構(gòu)樹葉粗多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫抑制小鼠免疫功能的影響

徐光沛 ，蔣 平，何燕飛，孫桃桃，陳存武,2，佘德勇，王敬利，左瑞華

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽六安 237012；2.安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室,安徽六安 237012； 3.安徽寶楮生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，安徽霍邱 237496)

近年來，中國畜牧經(jīng)濟(jì)發(fā)展飛速，養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖數(shù)量也在不斷擴(kuò)大，動(dòng)物免疫抑制性疾病成為阻礙養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要因素。免疫是指機(jī)體免疫系統(tǒng)識別自身與異己物質(zhì)，并通過免疫應(yīng)答排除抗原性異物，對維持機(jī)體的健康極為關(guān)鍵。免疫功能失調(diào)時(shí)，機(jī)體更易受到侵害。因此，免疫調(diào)節(jié)對疾病的預(yù)防十分重要，能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高機(jī)體對疾病的抵抗能力[1]，可以有效防御病菌和病毒的入侵[2]。環(huán)磷酰胺為臨床上應(yīng)用廣泛的化療藥物之一，也是建立免疫抑制模型的常用藥物。有研究表明，環(huán)磷酰胺具有骨髓抑制作用，長期使用會(huì)造成免疫細(xì)胞的生長發(fā)育受阻，也能對肝、腎等器官造成損傷[3]。多糖是由酮糖、醛糖通過脫水縮合成糖苷并鏈接在一起形成的一類天然高分子化合物，其種類多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，廣泛參與機(jī)體細(xì)胞的各種活動(dòng)，是生命體三大基礎(chǔ)物質(zhì)之一。近年來，關(guān)于多糖的研究越來越多，許多文獻(xiàn)均報(bào)道其具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、調(diào)節(jié)腸道菌群、免疫調(diào)節(jié)等功能[4-6]，有關(guān)多糖免疫調(diào)節(jié)作用被越來越多的學(xué)者關(guān)注，開發(fā)有效的多糖類免疫調(diào)節(jié)劑已成為研究熱點(diǎn)。

構(gòu)樹，又名楮樹，蕁麻目?？浦参?，主要分布在東亞地區(qū)，中國早在3 000 a前就有其相關(guān)記載。構(gòu)樹葉有清熱解毒、涼血止血、利尿的功效，可用于崩漏、外傷等多種出血性疾病的治療，外用可以治療水腫、毒瘡等[7]。構(gòu)樹葉不僅富含蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，被國務(wù)院列為精準(zhǔn)扶貧的十大工程之一。同時(shí)，構(gòu)樹葉還含有黃酮、多糖、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分[8]，具有一定的藥用價(jià)值。本研究利用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠模型評價(jià)構(gòu)樹葉粗多糖對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，以期為構(gòu)樹資源的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供 參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Mindry獸用全自動(dòng)血液分析儀2600Vet(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司)；東唐全自動(dòng)生化分析儀DP180(廣州東唐電子科技有限公司)；高速離心機(jī)TG16A(上海盧湘離心機(jī)儀器有限公司)；酶標(biāo)儀BG-XM096(廈門百谷生物工程有限公司)；環(huán)磷酰胺(上海阿拉丁試劑有限公司)；血清總蛋白、白蛋白生化試劑盒(珠海森龍科技有限公司)；小鼠IgG和IgM酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(杭州聯(lián)科生物科技有限公司)。

1.2 構(gòu)樹葉粗多糖的制備

采集新鮮的構(gòu)樹葉，55 ℃烘干，取200 g烘干的構(gòu)樹葉，加10倍體積的水，大火加熱至沸騰后轉(zhuǎn)為小火維持，煎煮1 h，過濾，收集濾液，濾渣加水繼續(xù)煎煮1 h，再次過濾并收集濾液，合并兩次收集的濾液，80 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至200 mL左右，加4倍體積的95%乙醇，置于4 ℃冰箱過夜。次日，將過夜的溶液裝入離心管，4 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀依次用石油醚、無水乙醇洗滌，重復(fù)3次。最后一次洗滌完后，棄上清，剩余沉淀置于60 ℃恒溫箱烘至恒質(zhì)量，得到構(gòu)樹葉多糖粉末(多糖含量13.1%)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及處理

雌性ICR小鼠36只，清潔級動(dòng)物房中適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為6組，分別為空白對照組、模型組、陽性對照組和構(gòu)樹葉粗多糖低、中、高劑量組，空白對照組不做任何處理；模型組按體質(zhì)量2 mL/kg灌胃生理鹽水，連續(xù)15 d，在第12天按50 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)3 d；陽性對照組按2 mL/kg灌胃玉屏風(fēng)口服液(1 g/mL)，連續(xù)15 d，在第1天按50 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)3 d；低、中、高劑量組每天分別按50、100、200 mg/kg(以多糖含量計(jì)算)等體積灌胃構(gòu)樹葉粗多糖溶液，連續(xù)15 d，在第1天按50 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)3 d。最后一次灌胃12 h后，稱體質(zhì)量，采集小鼠血液，檢測各類白細(xì)胞數(shù)、血清蛋白及抗體水平；摘取脾臟，稱質(zhì)量，計(jì)算脾臟指數(shù)；采取空腸組織及脾臟組織置于4%的多聚甲醛溶液中充分固定，飼養(yǎng)期間自由采食飲水。

1.4 指標(biāo)測定

構(gòu)樹葉粗多糖的測定：采用苯酚硫酸法測定多糖含量。

脾臟指數(shù)：脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)。

白細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的檢測：檢測血液中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量。

血清蛋白檢測：將采集的血液離心取血清，利用生化分析儀檢測血清總蛋白、白蛋白及球蛋白含量。

腸道組織和脾臟組織形態(tài)觀察：取小鼠的空腸、脾臟，4%多聚甲醛固定，制作切片，HE染色觀察[9]。

血清抗體水平的檢測：將采集的血液離心取上層血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作步驟，檢測血清IgM和IgG抗體水平。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0比較均值中的單因素進(jìn)行分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，比較各組之間的差異性，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)樹葉粗多糖對小鼠脾臟指數(shù)的影響

由圖1可以看出，空白組的脾臟指數(shù)最高，同模型組相比，差異顯著(P<0.05)，對照組、低劑量組和中劑量組的均高于模型組，但差異不顯著(P>0.05)，高劑量組的最低。

“*”表示與模型組相比差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 構(gòu)樹葉粗多糖對免疫抑制小鼠白細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的影響

如圖2所示，與模型組相比，空白組白細(xì)胞數(shù)量最高，差異顯著(P<0.05)，陽性對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組白細(xì)胞數(shù)量均高于模型組(P>0.05)；觀察各組淋巴細(xì)胞數(shù)量發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，空白組淋巴細(xì)胞數(shù)最高(P>0.05)，陽性對照組的淋巴細(xì)胞數(shù)最低(P>0.05)；觀察各組單核細(xì)胞數(shù)量發(fā)現(xiàn)，各組單核細(xì)胞數(shù)量均高于模型組，但與模型組差異均不顯著(P>0.05)；觀察各組中性粒細(xì)胞數(shù)量發(fā)現(xiàn)，陽性對照組的中性粒細(xì)胞數(shù)量最高，與模型組相比差異顯著(P<0.05)。

圖2 小鼠各類白細(xì)胞水平Fig.2 Levels of leukocytes in mice

2.3 構(gòu)樹葉粗多糖對免疫抑制小鼠血清蛋白的影響

如圖3所示，模型組的總蛋白、白蛋白及球蛋白含量最低，同模型組相比，各組的總蛋白、白蛋白及球蛋白水平均有升高，其中空白組和低劑量組顯著升高(P<0.05)。

圖3 小鼠的血清蛋白水平Fig.3 Level of serum protein in mice

2.4 構(gòu)樹葉粗多糖對小鼠空腸組織形態(tài)的影響

由圖4可以看出，模型組的腸絨毛結(jié)構(gòu)不完整，部分腸絨毛出現(xiàn)斷裂，絨毛長短不一。與模型組相比，空白組的空腸絨毛結(jié)構(gòu)完整、排列整齊，腸絨毛之間的間隙較??；陽性對照組腸絨毛僅有少部分脫落、絨毛長短不一，腸絨毛之間間隙較??；低劑量組腸絨毛整齊排列且間隙較小，未見明顯的脫落和斷裂；高劑量組的腸絨毛間隙較大，仍有部分?jǐn)嗔鸭懊撀洹?/p>

圖4 小鼠空腸組織的形態(tài) (HE,×200)Fig.4 Histomorphology of jejunum in mice (HE, ×200)

2.5 構(gòu)樹葉粗多糖對小鼠脾組織形態(tài)的影響

由圖5可以看出，空白組小鼠脾組織結(jié)構(gòu)完整，紅髓與白髓界限清晰，白髓區(qū)的淋巴小結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞排列緊密；模型組小鼠脾組織的紅髓區(qū)和白髓區(qū)界限模糊，白髓區(qū)的淋巴小結(jié)排列松散；對照組和低劑量組小鼠脾組織結(jié)構(gòu)完整，紅髓區(qū)與白髓區(qū)界限較為清晰，高劑量組小鼠脾組織的紅髓區(qū)和白髓區(qū)界限模糊，白髓區(qū)結(jié)構(gòu)也不完整。

圖5 小鼠脾組織的形態(tài)(HE,×200)Fig.5 Morphology of spleen in mice (HE, ×200)

2.6 構(gòu)樹葉粗多糖對小鼠血清抗體水平的影響

由圖6可以看出，與模型組相比，空白組、陽性對照組、低劑量組和中劑量組小鼠的IgM、IgG水平均呈現(xiàn)升高，其中空白組、陽性對照組和低劑量組升高顯著(P<0.05)，中劑量組IgG水平顯著升高(P<0.05)，高劑量組小鼠IgM、IgG水平低于模型組。

圖6 小鼠血清IgM和IgG水平Fig.6 Level of serum IgM and IgG in mice

3 討 論

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖密度和養(yǎng)殖規(guī)模的不斷提高，動(dòng)物的免疫抑制性疾病成為養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展面臨的難題，一些細(xì)菌、病毒、藥物、營養(yǎng)不良、疫苗接種失敗等都會(huì)造成機(jī)體的免疫抑制[10]，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力，對免疫抑制疾病的防治具有重大的意義。環(huán)磷酰胺作為常用的免疫抑制劑已被廣泛用于動(dòng)物免疫抑制模型的構(gòu)建，且效果十分明顯。有研究表明，環(huán)磷酰胺能夠抑制免疫器官發(fā)育、減少免疫細(xì)胞數(shù)量、降低抗體水平[11-12]。本研究結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺顯著降低小鼠的脾臟指數(shù)、各類白細(xì)胞數(shù)量、血清蛋白及抗體水平，同時(shí)對空腸黏膜及脾組織也造成不同程度的損傷，免疫抑制效果明顯。

構(gòu)樹葉作為新型飼料資源，不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，還含有多糖、黃酮、皂苷等化學(xué)活性成分[8]，已被國務(wù)院列為精準(zhǔn)扶貧十大工程之一。研究證實(shí)，多糖作為中草藥的主要活性成分之一，具有抗菌、抗氧化、調(diào)節(jié)腸道菌群、免疫調(diào)節(jié)等功能[4-5]，對受損的免疫器官也有一定的修復(fù)作用[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)樹葉粗多糖能提升小鼠的脾臟指數(shù)，同時(shí)還能改善環(huán)磷酰胺造成的脾組織損傷，這與牛佳卉等[14]研究結(jié)果一致。脾臟是機(jī)體的重要免疫器官，是免疫細(xì)胞成熟及免疫應(yīng)答的主要場所。脾臟指數(shù)和脾組織結(jié)構(gòu)能直觀反映脾臟的發(fā)育狀況及免疫功能，通常情況下，脾臟指數(shù)升高是免疫增強(qiáng)的表現(xiàn)[16]。

白細(xì)胞主要包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，其數(shù)量常作為臨床判斷機(jī)體抗病力的重要血液學(xué)指標(biāo)[17]。研究表明，多糖能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的生長和分化從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫力[18]。本研究結(jié)果顯示，構(gòu)樹葉粗多糖能增加白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的數(shù)量，這與王瑩等[19]研究結(jié)果一致。血清總蛋白是一類具有維持血液膠體滲透壓、運(yùn)輸物質(zhì)、解除毒性及免疫功能的蛋白，主要反映機(jī)體內(nèi)蛋白吸收、代謝、營養(yǎng)水平[20]，包括白蛋白和球蛋白[21]，其中球蛋白與免疫功能密切相關(guān)[22]。有研究表明，多糖能夠顯著提高血清總蛋白含量[23]，這與本研究的結(jié)果一致。腸道是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成，主要通過小腸黏膜組織參與機(jī)體的消化吸收及免疫應(yīng)答[24]。研究表明，多糖類物質(zhì)能夠通過調(diào)節(jié)腸道菌群、維持腸上皮細(xì)胞完整，提高腸道的免疫功能[25]。鄧樺等[26]發(fā)現(xiàn)玉屏風(fēng)多糖可通過增加腸壁厚度和絨毛長度，維持腸上皮細(xì)胞完整性，有效改善免疫抑制造成的小鼠腸黏膜損傷。本研究結(jié)果顯示，構(gòu)樹葉粗多糖能維持小鼠空腸組織完整，增加腸絨毛長度，縮小腸絨毛間隙，這與Ying等[27]研究結(jié)果一致。免疫球蛋白是血液、組織液中具有免疫功能的一類重要物質(zhì)。IgG是最主要的抗體，IgM是循環(huán)系統(tǒng)中最大且最早產(chǎn)生的抗體，具有發(fā)揮清除病原菌、激活補(bǔ)體、調(diào)節(jié)免疫功能等作用。研究表明，黃芪多糖[28]、羊棲菜多糖[29]等均能提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的血清IgG、IgM含量。本研究結(jié)果顯示，低劑量的構(gòu)樹葉粗多糖及玉屏風(fēng)顆粒能顯著提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的血清IgG、IgM抗體水平，增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫功能。

綜上，構(gòu)樹葉粗多糖能通過提高脾臟系數(shù)、白細(xì)胞數(shù)量、血清蛋白和血清抗體水平，修復(fù)腸道及脾臟組織損傷，從而改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫抑制小鼠的免疫功能，以低劑量效果最好。