微納米尺度生物體溫度測量方法及展望

王 政, 歐陽可琛, 邢 力, 馮曉娟, 張金濤

(1. 清華大學(xué) 精密儀器系,北京 100084； 2. 中國計量科學(xué)研究院 熱工計量科學(xué)研究所,北京 100029；3. 清華大學(xué) 核能與新能源技術(shù)研究院,北京 100084)

1 引 言

細(xì)胞是生物體最基本的結(jié)構(gòu)和功能單元,其新陳代謝活動產(chǎn)生熱量[1],造成溫度的改變,同時,不同溫度環(huán)境也影響細(xì)胞的生命演變過程。因此,細(xì)胞、生物體的溫度及其分布,是物理表征生物體和細(xì)胞的生命活動能力的重要參數(shù)。溫度變化可用于改變細(xì)胞的活動特性,比如對癌變細(xì)胞的溫度進(jìn)行控制,可抑制癌細(xì)胞活性甚至誘導(dǎo)死亡[2]；溫度還可以用來觀測遞送藥物后靶細(xì)胞的動態(tài)變化及內(nèi)部的交互變化,更有利于篩選藥物和精準(zhǔn)標(biāo)靶,減少對正常細(xì)胞組織的損傷[3]。

由于細(xì)胞體積較小,一般約在10～100 μm之間,內(nèi)部存在復(fù)雜的亞結(jié)構(gòu),與外界環(huán)境具有多自由度的交互作用,因此細(xì)胞的溫度測量,有生物友好、抗干擾、高時空分辨率、高實時性等要求[4]。近年來,隨著對凝聚態(tài)物理現(xiàn)象的深入了解和納米制備技術(shù)的進(jìn)步,測量生物體和細(xì)胞溫度的傳感技術(shù)也獲得了迅速的發(fā)展。

鑒于目前細(xì)胞測溫技術(shù)的發(fā)展存在傳感器種類繁雜,測溫原理、使用特性和計量性能差異明顯等問題,本文從測溫技術(shù)特點和計量性能兩個方面,對近十幾年來,應(yīng)用于生物體和細(xì)胞測溫的微納熱電偶、熱電阻、紅外熱像儀、磁性納米粒子和熒光發(fā)光等方法進(jìn)行了比較分析,并梳理各種測溫方法的優(yōu)缺點及研究現(xiàn)狀,最后針對金剛石納米粒子應(yīng)用于生物體和細(xì)胞的測溫方法進(jìn)行了展望。

2 生物細(xì)胞測溫技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

按測溫依據(jù)的不同效應(yīng)，本文將細(xì)胞測溫方法分為熱電、熱輻射、熱磁、熒光以及復(fù)合5類,見表1。

表1 微納米尺度生物體測溫技術(shù)匯總Tab.1 Summary of the technology of micro-nano meter scale biosome temperature measurement

表1中概括了生物體(細(xì)胞)代表性測溫技術(shù)的原理、方法、測溫特點、研究對象和發(fā)展現(xiàn)狀。除紅外測溫外,其他測量技術(shù)均為接觸式測量,其中熱電類方法傳輸電信號,一般需要引線,熱磁和熒光類方法傳輸磁或光信號,對于微觀測量具有一定優(yōu)勢；熒光類測量在測溫精度與易實現(xiàn)等方面均存在優(yōu)勢,因此近幾年成為了細(xì)胞內(nèi)測溫的研究熱點和主要技術(shù)手段。

3 代表性生物細(xì)胞測溫方法

3.1 熱電效應(yīng)測溫

3.1.1 微納熱電偶

熱電偶是一種廣泛使用的溫度傳感器,兩種不同材料的金屬絲在兩端形成結(jié)點,一端為參考溫度另一端為被測溫度。當(dāng)被測溫度不同于參考點溫度時,塞貝克效應(yīng)會因為兩種絲材傳輸電子性質(zhì)的差異,在探測點和參考點之間形成(熱)電勢,該電勢與溫度有單值對應(yīng)關(guān)系,且在較寬溫度范圍內(nèi)保持恒定和近似線性,從而可獲得探測點的溫度。

為了能夠?qū)犭娕紲y溫技術(shù)用于細(xì)胞尺度的測量,需采用現(xiàn)代的微加工技術(shù),將宏觀尺度的傳統(tǒng)熱電偶制作為微尺度的熱電偶傳感器。2005年Watanab等[5]在玻璃微量吸液管表面沉積金屬鎳(Ni)和具有高電阻率的類金剛石(DLC)膜,利用聚焦離子束(FIB)刻蝕尖端(直徑1 μm)進(jìn)行微加工切斷,通過離子濺射在DLC膜上沉積一層50 nm的康銅合金薄膜,在切口處與鎳膜接觸,最后在合金薄膜外沉積DLC膜,從而形成微納尺度的熱電偶探針,其測溫系統(tǒng)見圖1。利用該方法制備的金屬鉑(Pt)和金(Au)微納熱電偶探針,熱電勢為2.1 μV/K,測溫靈敏度優(yōu)于常規(guī)熱電偶1個數(shù)量級。

圖1 微納熱電偶測溫系統(tǒng)示意圖[5]Fig.1 Schematic diagram of micro-thermocouple measurement system[5]

2006年Haeberle等[6]在原子力顯微鏡(AFM)的導(dǎo)電懸臂梁上,使用焦耳加熱的電阻器,在0.5 μm長的硅尖端上,刻蝕出了半徑為5～10 nm的熱電偶探針,熱電勢為(1.26±0.06) μV/K,可獲得優(yōu)于100 nm的空間分辨率和10 mK的溫度分辨率。

2010年Shrestha等[7]在玻璃微移液管表面進(jìn)行點焊錫合金,通過物理氣相沉積(PVD)在移液管外表面涂上金屬薄膜(Ni+Au)制成微納熱電偶傳感器,熱電勢達(dá)到8.45～8.86 μV/K,比文獻(xiàn)[6]的熱電偶探針提高了近4倍。同年, Sadat等[8]在AFM的硅(Si)懸臂梁的固定端和自由端分別沉積鈦粘附層和鉑(Pt),通過探針對金薄膜上點接觸區(qū)域(直徑約10 nm)的熱電電壓進(jìn)行測溫；該方法還可實現(xiàn)納米尺度溫度梯度的測量,其空間分辨率可達(dá)100 nm。

2011年Wang[9]設(shè)計制造了一種鎢(W)探針為襯底,聚氨酯(PU)為絕緣層,外部由一層均勻的鉑金屬(Pt)附著的微納熱電偶,探針尺度為50 nm和100 nm,其中100 nm尺度的探針熱電勢受環(huán)境的影響小,熱電偶探針的熱平衡響應(yīng)時間短,計算機(jī)模擬顯示,探針與被測細(xì)胞接觸400 ns后,溫度達(dá)到一致。

3.1.2 熱電阻

導(dǎo)電體的電阻率與溫度的對應(yīng)關(guān)系,可以被用于感知物體的溫度。2013年Binslem等[10]通過納米針實現(xiàn)了針對單細(xì)胞的溫度熱傳感微流控系統(tǒng),其中納米針材料為鎢,經(jīng)過建模分析電熱表征后,表明在297～313 K內(nèi)可實現(xiàn)實時準(zhǔn)確獲得0.1 K的溫度分辨率。

2015年Kido等[11]利用被測生物體細(xì)胞的電極化性質(zhì)與溫度的關(guān)系,表征被測生物體的溫度。將2個棒狀介電泳(DEP)金電極插入到胡蘿卜原生質(zhì)體內(nèi),2個電極從外接電路獲得微量的電壓時,胡蘿卜可視為1個電阻,在外電路中形成微電流；改變胡蘿卜的溫度,電阻即發(fā)生改變,當(dāng)電流恒定時通過觀測兩電極間的電壓可以獲取被測體的溫度。

2018年Li等[12]提出了利用金屬鉑表面培養(yǎng)細(xì)胞,測量細(xì)胞產(chǎn)熱能力的方法。將人微血管內(nèi)皮細(xì)胞群培育在薄膜鉑表面上,其中在薄膜鉑表面與細(xì)胞之間的培養(yǎng)基液注入去甲腎上腺素使細(xì)胞溫度升高,測量鉑的電阻變化值,感知細(xì)胞的微小溫度變化。

2019年Kim等[13]設(shè)計了一種可實現(xiàn)420 pW代謝功率的薄膜聚對二甲苯(parylene)微流控芯片量熱計,在微流控腔室內(nèi)感知細(xì)胞代謝熱,利用氧化釩(VOx)熱電阻溫度計實現(xiàn)高靈敏度測溫。當(dāng)偏置電壓大于0.5 V時,熱電阻的溫度分辨率約為15 μK；再利用電熱脈沖對微流體系統(tǒng)中測量方的加熱器進(jìn)行變功率加熱,根據(jù)線性擬合溫度變化和輸出電壓獲得熱導(dǎo)率,得以精確測量細(xì)胞的代謝熱。

熱電偶和熱電阻測量溫度響應(yīng)較快,分辨率較高,但通常會對細(xì)胞造成不可逆的傷害甚至致死,在與細(xì)胞接觸測溫時存在溫度交互易引入偏差,因此溫度復(fù)現(xiàn)測量準(zhǔn)確度不高,無法生成三維熱圖像。微納熱電偶結(jié)構(gòu)尺寸在一定程度上會影響溫度測量的精度,尺寸過小時,感知能力會減弱,測量偏差變大。此外,微納熱電阻不易植入細(xì)胞測量內(nèi)部溫度情況,僅能獲得細(xì)胞外表層微小的溫度變化。

3.2 紅外熱像測溫

物體表面具有向外環(huán)境熱輻射的能力,根據(jù)普朗克輻射定律,物體表面的輻射度取決于其表面的溫度。常溫附近,物體表面的熱輻射集中于中紅外光譜,采用紅外熱像儀收集物體表面的輻射能,即可探測物體表面的溫度。由于惡性腫瘤的溫度高于正常細(xì)胞,通過掃描人體表面可實時獲取溫度分布,因此被廣泛應(yīng)用于排查腫瘤、診斷乳腺癌等。早在1997年Gamagami等[14]對比了X光機(jī)和紅外熱像儀對乳腺癌的預(yù)測性,指出紅外熱像儀的預(yù)測能力更高,而且是唯一能顯示化療對炎癥性乳腺癌療效的技術(shù)手段。1998年P(guān)aulik等[15]利用紅外熱像儀對微量滴板上培養(yǎng)的人類脂肪細(xì)胞的產(chǎn)熱過程實時測量,溫度分辨率達(dá)到2 mK。2011年Flores-Sahagun等[16]采用紅外成像分析技術(shù)對皮膚基底細(xì)胞癌患者進(jìn)行早期篩查,根據(jù)測量得到的溫度梯度對照組進(jìn)行病情分析,高效識別受損組織。Qi等[17]在2012年分析了紅外熱像測溫對乳腺癌的篩選性,并提出利用熱像采集、特征分割提取及有效識別研究圖像中不對稱的可疑區(qū)域,能夠發(fā)現(xiàn)早期癌癥疾病。

紅外熱像儀可直接實時獲得熱分布圖像,響應(yīng)時間快,且不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)；但僅能用于測量生物體表面的溫度,容易受到外界環(huán)境的影響造成測量誤差,例如介質(zhì)的浮動、周圍物體的輻射干擾等。

3.3 磁性納米粒子測溫

具有超順磁特性的磁納米粒子在低磁場激勵下,不存在磁滯現(xiàn)象,磁化率較高,根據(jù)居里順磁原理可知：磁化響應(yīng)強(qiáng)度較弱,具有更強(qiáng)的溫度敏感性,且其粒子直徑在10 nm左右,可被細(xì)胞吞噬,故而能夠通過測量磁性納米粒子磁化率,實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)部的溫度測量[18]。

2009年Weaver等[19]利用磁性納米顆粒進(jìn)行測溫并獲得溫度分布,實驗利用磁性納米顆粒在正弦磁場中的第五次和第三次諧波的單調(diào)比值生成校準(zhǔn)曲線,用于估算溫度變化,在293～323 K溫度范圍內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)差為0.3 K。

2012年Zhong等[20]利用磁化率與溫度的關(guān)系,構(gòu)建了磁化率與溫度之間的數(shù)學(xué)模型,在310～350 K溫度范圍,測溫重復(fù)性優(yōu)于0.55 K；隨后,在交變低頻外加磁場作用下,記錄磁化曲線,實時地探測溫度,測溫的重復(fù)性提高到0.2 K[21]；2018年,Zhong等又提出通過掃描磁性粒子光譜儀測量諧波空間分布的方法獲得溫度圖像,實現(xiàn)空間分辨率約為3.5 mm[22]。

2015年Zhou等[23]提出利用交流磁場中測量得到的基波和三次諧波,采用傅里葉級數(shù)求解方程獲得溫度值,重復(fù)性達(dá)到0.29 K。

磁性納米粒子借助對溫度敏感的磁化強(qiáng)度與磁化率進(jìn)行溫度測量,其測溫精度由外加磁場的狀態(tài)、磁化曲線的測量和構(gòu)建模型的反演求解準(zhǔn)確性所決定。理論上,測量磁性納米離子的磁化曲線,便可以通過適用于超順磁性的朗之萬函數(shù)構(gòu)建相關(guān)模型進(jìn)行反演計算獲取溫度信息,但在高頻強(qiáng)磁場作用下,磁納米粒子會產(chǎn)生動態(tài)弛豫特性影響磁化響應(yīng),不再表現(xiàn)出超順磁性,朗之萬函數(shù)將不再適用,只能通過磁化率與具有溫敏性的有效弛豫時間之間的關(guān)系構(gòu)建新模型實現(xiàn)溫度測量。

3.4 熒光測溫

熒光法是生物研究領(lǐng)域廣泛使用的溫度標(biāo)志、測溫方法,通常是由于其內(nèi)部電子能級躍遷,在入射光的激發(fā)后產(chǎn)生熒光,通過觀測其熒光強(qiáng)度、峰值位置、衰減壽命及強(qiáng)度比等與溫度的變化關(guān)系,獲得所測物質(zhì)的精確溫度及分布情況。按照觀察量的不同,可將基于物質(zhì)產(chǎn)生熒光的測溫方式分為6類： 熒光強(qiáng)度、峰值位置、光譜線寬、熒光強(qiáng)度比、偏振各向異性與熒光衰減壽命。各類方式的測溫原理以及應(yīng)用見表2。

用作指示溫度的熒光標(biāo)志可分為生物體外的熒光標(biāo)志(本文稱作體外熒光標(biāo)志)和生物體自身的熒光標(biāo)志(體內(nèi)熒光標(biāo)志)。體外熒光標(biāo)志,如熒光染料、量子點、熒光納米顆粒等,它們不是生物體的構(gòu)成元素,尺寸小,體外熒光標(biāo)志的空間尺度可達(dá)到5 nm,可被細(xì)胞吸收,具有較高的熒光強(qiáng)度、溫度探測的靈敏度和寬廣的敏感范圍。

3.4.1 熒光染料

在生物實驗中熒光分子微團(tuán)被廣泛用于溫度示蹤粒子,其發(fā)光強(qiáng)度、衰蕩壽命與溫度相關(guān)。2001年Ross等[24]在微流體系統(tǒng)中使用多種熒光染料進(jìn)行溫度測溫,測溫精度在0.03～3.5 K之間。熒光染料中被廣泛使用的羅丹明B,容易被吸附在塑料表面,即使用緩沖液沖洗后也仍然會殘留壁上,會導(dǎo)致溫度測量的系統(tǒng)誤差。

2007年Suzuki等[25]利用填充熱敏熒光染料(Eu-TTA)的微玻璃管檢測了單個HeLa細(xì)胞的產(chǎn)熱,單個HeLa細(xì)胞在離子霉素的刺激下導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度變化,從而引起細(xì)胞溫度的改變,通過熒光強(qiáng)度可指示溫度的改變。同年,Jigami等[26]在298～308 K溫度范圍內(nèi)觀測驗證了Cy3染料的溫度依賴性,并制作了一種利用近場光纖和Cy3熒光染料團(tuán)的溫度響應(yīng)系統(tǒng),在100 nm的空間分辨率下獲得局部溫度梯度為4 K。

2015年Arai等[27]提出一種針對線粒體溫度測量的熒光染料(Mito thermo yellow),發(fā)現(xiàn)被染料染色后的線粒體對溫度變化更加敏感,并成功獲得細(xì)胞內(nèi)溫度梯度圖像。同年,魯維等[28]使用羅丹明B染料將細(xì)胞進(jìn)行4 h染色,利用共聚焦顯微鏡和光纖測溫儀進(jìn)行實時溫度測量,擬合得到染料熒光強(qiáng)度與溫度的關(guān)系式；同時還發(fā)現(xiàn)在溫度上升時,染料測溫較準(zhǔn)確,在溫度下降時,出現(xiàn)較大的偏差。同年,Homma等[29]設(shè)計了由2種羅丹明染料(Rhodamine B和CS NIR dye)組成的線粒體靶向溫度標(biāo)志；由于羅丹明B染料的熒光強(qiáng)度隨溫度升高而線性下降,而CS NIR dye的熒光強(qiáng)度不隨溫度改變,是恒定值,故通過檢測這2種染料熒光強(qiáng)度的比值變化,檢測線粒體的溫度情況。

表2 熒光測溫原理及應(yīng)用匯總表Tab.2 The fundamentals of fluorescent thermometry and their applications

3.4.2 熒光熱敏性聚合物

熒光熱敏性聚合物受熱后,其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,熒光強(qiáng)度也隨之變化,且其結(jié)構(gòu)在一定溫度范圍內(nèi)可逆,但測溫空間分辨率不夠高。

2003年Baker等[30]利用具有高粘度系數(shù)和熱流體特性的離子液體(ILs)溶解熱敏性聚合物1,3-bis(1-pyrenyl),在298.1～413 K范圍,通過比率發(fā)光(不同溫度下單體和準(zhǔn)分子測量得到的熒光強(qiáng)度比)實現(xiàn)溫度測量。2009年Uchiyama課題組[31]將一種熱敏聚合物與一種水敏熒光團(tuán)結(jié)合制成了一種熒光納米凝膠溫度計(FNT),在活細(xì)胞中,FNT在300～306 K范圍內(nèi)溫度分辨率約0.29～0.5 K對溫度的變化表現(xiàn)出較高的敏感性；然而,FNT只能測量整個細(xì)胞的平均溫度。該課題組[32]于2012年發(fā)表了改進(jìn)的熒光聚合物溫度計(FPT)研究,利用熒光壽命探測溫度,避免了熒光強(qiáng)度受光源穩(wěn)定性和周圍環(huán)境光的影響對測量造成的干擾,測溫的分辨率達(dá)到0.18 K。

3.4.3 熒光生物分子

活細(xì)胞可通過某些特定可誘導(dǎo)熱休克或冷休克的核酸分子和蛋白質(zhì)等生物分子來感知溫度。對于冷休克,細(xì)胞生長趨于停止,伴隨著大量基因表達(dá)的顯著降低,并且冷休克蛋白被表達(dá)；熱休克也是相同道理。

(1) 基于核酸分子

RNA溫度計[33]是一類通過控制基因表達(dá)實現(xiàn)溫度傳感的非編碼RNA,選擇性地感知溫度,依賴于高度結(jié)構(gòu)化的5’端非翻譯區(qū),溫度改變會使得Shine-Dalgarno(SD)序列二級結(jié)構(gòu)形成屏蔽或暴露,從而促進(jìn)核糖體結(jié)合和翻譯起始,最后通過構(gòu)象變化將信號傳遞給翻譯機(jī)器。2006年Chowdhury等[34]通過調(diào)控核酸分子RNA,獲得細(xì)菌RNA溫度計的第一個3D-NMR結(jié)構(gòu)；針對WT MiniROSE和ΔG83 MiniROSE兩種RNA溫度計進(jìn)行溫度響應(yīng)測試,發(fā)現(xiàn)WT MiniROSE在啟用SD序列周邊時有些不穩(wěn)定,會造成部分核糖體與亞單位結(jié)合翻譯,產(chǎn)生編碼蛋白,影響基因表達(dá)與溫度測量。2018年Loh等[35]利用2個或多個RNA溫度計對細(xì)菌進(jìn)行溫度測量,從而更多地控制和預(yù)測多種病原體的基因表達(dá)；實驗通過對假結(jié)核桿菌和鉤端螺旋體等隨溫度變化的構(gòu)象變化分析,深入了解其動態(tài)RNA結(jié)構(gòu)。RNA溫度計通過降低生長溫度來調(diào)節(jié)基因表達(dá),產(chǎn)生可分析的分子或代謝表型,并利用這種方式獲取細(xì)胞內(nèi)具有研究價值的信息。

2012年Ke等[36]提出了一種基于L-DNA分子信標(biāo)的可逆細(xì)胞納米溫度計,L-DNA是由天然D-DNA的光學(xué)異構(gòu)體構(gòu)建的雙標(biāo)記發(fā)夾寡核苷酸,即鏡像異構(gòu)體。實驗中將2種分子信標(biāo)導(dǎo)入HeLa細(xì)胞,在293～310 K的溫度范圍內(nèi),監(jiān)測熒光強(qiáng)度與溫度的關(guān)系曲線,得到L-DNA熒光強(qiáng)度隨溫度的增加而增加，見圖2所示。。

圖2 L-DNA分子信標(biāo)納米溫度計[36]Fig.2 L-DNA molecular beacon nano-thermometer

(2) 基于蛋白質(zhì)

1962年,Shimomura等[37]在維多利亞多管發(fā)光水母中首次發(fā)現(xiàn)能夠在藍(lán)光照射下發(fā)出綠色熒光的蛋白質(zhì),簡稱為綠色熒光蛋白(GFP)；其具有良好的生物相容性,對環(huán)境不敏感,但熒光強(qiáng)度低。Osamu Shimomura、Martin Chalfie和Roger Y Tsien因為發(fā)現(xiàn)和研究改造GFP,獲得了2008年諾貝爾化學(xué)獎[38]。2006年Leiderman等[39]研究了在87～291 K溫度范圍內(nèi)綠色熒光蛋白作為生物熒光標(biāo)記物的溫度依賴性,實驗中利用時間相關(guān)單光子計數(shù)(TCSPC)技術(shù)在受光激發(fā)后獲得光致熒光的衰減時間曲線,并發(fā)現(xiàn)低溫下酸性GFP校正后的熒光衰減漸近于t-1/2(t為時間)。而在2012年,Donner等[40]將GFP作為溫度標(biāo)志,在轉(zhuǎn)染GFP的癌細(xì)胞上進(jìn)行了測試,利用細(xì)胞周圍的金納米棒加熱細(xì)胞,檢測熒光偏振各向異性(FPA),實現(xiàn)了溫度的實時表征。

2019年Savchuk等[41]展示了如何使用綠色熒光蛋白來評估溫度,使用標(biāo)準(zhǔn)的GFP轉(zhuǎn)染試劑來評估細(xì)胞內(nèi)線粒體中表達(dá)GFP的HeLa細(xì)胞的溫度,并提出了一種新的熒光峰值分?jǐn)?shù)(PF)進(jìn)行溫度測定的方法,該方法利用比值測量技術(shù),不依賴于樣品濃度和激發(fā)功率的變化,PF隨溫度呈線性增加,在溫度周期內(nèi)具有較好的重復(fù)性。

3.4.4 熒光納米顆粒

(1) 量子點

半導(dǎo)體納米粒子,又稱量子點,一般尺寸為1～100 nm,光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,可在第一激發(fā)態(tài)上的任意波段受激發(fā),通常溫度與熒光強(qiáng)度成線性反比關(guān)系,可通過改變顆粒大小調(diào)節(jié)熒光發(fā)射峰波長。

2006年Aigouy等[42]在AFM針尖上放置包裹著CdSe/ZnS量子點的二氧化硅球作為熒光探測器,通過針尖的移動對物體進(jìn)行掃描獲取熱成像,但僅限于表面測溫；通過不同的樣品和激發(fā)波長實驗,證明了量子點寬光譜的傳輸特性。2010年Maestro等[43]發(fā)現(xiàn)硒化鎘(CdSe)量子點在雙光子激發(fā)下熒光發(fā)射強(qiáng)度的溫度熱成像對比度和靈敏度更高,并將其應(yīng)用在單個HeLa細(xì)胞中進(jìn)行溫度測量,在溫度升高后,峰值位置發(fā)生改變。2011年Yang等[44]利用量子點(QD655)的光致發(fā)光光譜描述了NIH/3T3小鼠纖維細(xì)胞內(nèi)的熱變化現(xiàn)象,實現(xiàn)了對細(xì)胞內(nèi)部不均勻溫度的實時觀測,發(fā)現(xiàn)單個活細(xì)胞在化學(xué)和物理刺激下的局部溫度響應(yīng)；實驗利用Ca2+離子化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞使溫度升高,并觀察到光譜紅移現(xiàn)象。

(2) 金屬納米粒子

金屬納米粒子擁有更小的尺寸、良好的生物相容性以及較高的溫度敏感性,當(dāng)被激光激發(fā)時,在一定溫度范圍內(nèi)其熒光壽命會隨溫度的變化而變化,從而測得溫度。

2009年Huang等[45]詳細(xì)介紹了金納米顆粒的各種合成方法：種子介導(dǎo)生長法、電化學(xué)法、光化學(xué)還原法等；并概述了金納米顆粒在生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究。2010年Zhang等[46]將對激發(fā)極化敏感的雙光子熒光金納米顆粒導(dǎo)入犬腎臟細(xì)胞中進(jìn)行熒光壽命光學(xué)成像,發(fā)現(xiàn)其發(fā)光壽命小于100 ps,溫度探測靈敏度優(yōu)于很多熒光分子。

2013年Li等[47]報道了熒光金納米團(tuán)簇(AuNCs)熒光壽命在一定溫度范圍內(nèi)隨溫度的升高而明顯降低;實驗使用HeLa細(xì)胞吞噬AuNCs,施加溫度梯度,再通過熒光壽命成像觀測細(xì)胞內(nèi)部溫度分布狀況，發(fā)現(xiàn)溫度引起的壽命縮短與環(huán)境有關(guān)，且壽命長短會影響圖像數(shù)據(jù)采集的速度，從而引入測量誤差。

(3) 稀土摻雜納米粒子

稀土離子的能級結(jié)構(gòu)豐富,在受到相應(yīng)的泵浦光激發(fā)后會產(chǎn)生較寬的熒光光譜,與溫度等因素存在一定的關(guān)系。

1976年Kusama等[48]提出采用硫氧化釔銪(Y2O2S: Eu)的2種不同躍遷能級方法產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度比值進(jìn)行溫度的測量,并建立了一定范圍內(nèi)熒光溫度測量標(biāo)準(zhǔn)。2010年Vetrone等[49]通過對比多光子激發(fā)熒光NaYF4：Er3+：Yb3+納米晶、量子點以及金納米顆粒作為生物熒光標(biāo)志時的熒光強(qiáng)度,證明了摻雜納米粒子的熒光轉(zhuǎn)換效率遠(yuǎn)高于其它兩個。同年,首次實現(xiàn)利用稀土摻雜的納米熒光材料的熒光強(qiáng)度比在單細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行測溫,在298～318 K溫度范圍下,利用共聚焦顯微鏡觀測吸收NaYF4：Er3+：Yb3+納米粒子的HeLa細(xì)胞內(nèi)部熒光強(qiáng)度變化,獲得實時溫度[50]。

2011年Dong等[51]利用2種不同稀土原子摻雜CaF2的納米晶對HeLa細(xì)胞進(jìn)行溫度測量,選取2個激發(fā)波長的熒光強(qiáng)度值進(jìn)行比值計算,發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度比與溫度存在線性關(guān)系。

(4) 納米金剛石

金剛石氮-空位(nitrogen-vacancy,NV)色心是由1個取代了碳原子的氮原子,及其鄰近處缺失的1個碳原子空位組成的復(fù)合結(jié)構(gòu)。在沒有外磁場的情況下NV色心自旋三重態(tài)的基態(tài)呈自旋能級ms=±1的簡并態(tài),基態(tài)能級ms=0與ms=±1之間的頻率差稱為零場劈裂。利用微波對NV色心的自旋態(tài)進(jìn)行操控,配合激光進(jìn)行基態(tài)自旋初始化和讀出,并連續(xù)監(jiān)控NV中心的熒光強(qiáng)度并掃描微波頻率得到光磁共振譜線及零場劈裂能D,進(jìn)而根據(jù)D值與溫度的關(guān)系,進(jìn)行高精度的溫度測量。1997年德國Wrachtup研究組[52]首次利用共聚焦系統(tǒng)研究了單個NV色心并實現(xiàn)了其在室溫下的光探測磁共振信號,從此金剛石NV色心就引起了全世界物理學(xué)家的廣泛關(guān)注。2008年德國Wrachtup研究組和美國Lukin研究組同時實現(xiàn)了金剛石NV色心的直流和交流磁場納米尺度的探測技術(shù),從此引發(fā)了人們利用NV色心去探測其它物理量的熱潮[53,54]。目前已實現(xiàn)較寬的溫度范圍5～600 K內(nèi)的測量[56～58]。

圖3 細(xì)胞納米測溫[58]Fig.3 Nanoscale thermometry in cells

2015年, Laraoui等[61]利用金剛石納米NV色心附著在原子力顯微鏡(AFM)的硅熱尖端作為局部溫度傳感器,獲得不同表面熱導(dǎo)率的熱變化圖,且溫度時間響應(yīng)速度較快。

2017年, Neeraj等[62]經(jīng)實驗觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可以通過連續(xù)的內(nèi)吞作用和胞吐作用來調(diào)節(jié)FND,證明了FND與細(xì)胞吸收的相互作用。2018年, Sekiguchi等[63]證明了FND的熱敏能力不受外部環(huán)境影響,并提出一種應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)部的絕對溫度測量方法,在單個細(xì)胞中其測溫精度優(yōu)于±1 K。

熒光納米金剛石NV色心性質(zhì)穩(wěn)定,具有超高熱惰性和耐酸堿性,無色無毒[64],由于其優(yōu)異導(dǎo)熱性使得NV色心與周邊環(huán)境處于熱平衡狀態(tài),不存在溫度擾動影響測量精度的情況,加之可以通過不同的微波脈沖操控方式消除外部磁場波動、共振譜線加寬等不確定因素,實現(xiàn)超精細(xì)能級調(diào)控；且NV色心體積較小,具有生物相容性,可被細(xì)胞胞吞胞吐,有望于應(yīng)用在醫(yī)療藥物投擲至靶癌細(xì)胞上,以及通過實時獲取溫度可控制加熱用以抑制癌細(xì)胞等生物醫(yī)學(xué)方面。

3.5 混合結(jié)構(gòu)測溫

2012年, Albers等[65]制備了一種中心為CdSe/CdS量子點-量子棒,外層由花菁染料(Alexa-647)聚合物包裹的混合結(jié)構(gòu)的溫度標(biāo)志,該方法采用雙激光激發(fā)法產(chǎn)生2個不同波段的熒光強(qiáng)度,利用其比值與溫度的線性關(guān)系,實現(xiàn)了0.2 K的測量精度,并開展了HeLa細(xì)胞在水溶液和碳酸氫鹽緩沖液中測溫比率響應(yīng)對比實驗。

2014年, Qiao等[66]設(shè)計了一種由熱敏聚合物(PNIPAm)分別與熒光染料(NBDAA)和羅丹明B衍生物(RhBAM)組成的基于比例熒光聚合物(RFPs)的納米溫度計,可精確測量活細(xì)胞的溫度。RFP標(biāo)志可自校準(zhǔn)熒光發(fā)射強(qiáng)度,可探測的溫差小于1 K。將RFP標(biāo)志融入Hela細(xì)胞,觀測到PNIPAm-co-NBDAA通道發(fā)射熒光的強(qiáng)度隨溫度升高而升高,而PNIPAm-co-RhBAM通道變化不大,因此,通過比值通道熒光圖像顏色的變化可實現(xiàn)溫度測量。

2015年, Wang等[67]提出一種測溫范圍為283～318 K,用于細(xì)胞內(nèi)部溫度測量的磁性熒光納米顆粒溫度計。實驗利用Hela細(xì)胞吞噬Fe3O4@SiO2@(pNIPAM-co-RhBITC)/Au混合納米顆粒,發(fā)現(xiàn)在299～314 K的范圍內(nèi),熒光強(qiáng)度與細(xì)胞溫度呈線性關(guān)系,測溫靈敏度為-4.84%K-1,且在外磁場的作用下,可實現(xiàn)有磁場導(dǎo)向定位和溫度傳感。

4 分析與展望

由于細(xì)胞內(nèi)部的復(fù)雜結(jié)構(gòu),在多樣的生命活動過程中,細(xì)胞的溫度變化是無法預(yù)料的,周圍環(huán)境對細(xì)胞的影響也是不可估計的。因此在對活細(xì)胞進(jìn)行溫度測量時,需要滿足高分辨率、低擾動、抗干擾、快速響應(yīng)和非破壞性等要求。

基于傳統(tǒng)熱電偶和熱電阻測量細(xì)胞內(nèi)溫度,測溫空間分辨率可達(dá)50 nm,不易受中間介質(zhì)影響,但對設(shè)計制作工藝要求較高,其結(jié)構(gòu)尺寸一定程度上影響溫度測量精度,加之熱電偶和熱電阻測量時傳輸電信號,一般需要引線或者在某微納加工表面上進(jìn)行測量,引線及基底限制了使用環(huán)境。紅外熱像儀在規(guī)定范圍內(nèi)可快速定位熱點或冷點,測量的空間分辨率約在0.1～1 mrad,但僅能獲得表面溫度,并且測溫精度會受熱像儀鏡頭焦距和周圍物體影響,因此在μm量級的單細(xì)胞或集群測量時會存在無法精準(zhǔn)定位測溫的情況。

對于生物體或者細(xì)胞內(nèi)低擾動的溫度測量,主要可使用磁性納米粒子和熒光類測量。磁性納米粒子可實現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)部測量,有多種獲取溫度的模型算法,重復(fù)性約為0.2～0.6 K,但無法實時獲取溫度值,且空間分辨率和穩(wěn)定性較差。熒光染料可直接通過熒光強(qiáng)度獲取溫度變化,在激光共聚焦顯微鏡下還可分析細(xì)胞溫度的三維分布圖,但也容易發(fā)生光漂白現(xiàn)象,穩(wěn)定性較差。熒光熱敏性聚合物可繪制細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器的溫度圖像,但測溫空間分辨率不高,響應(yīng)時間受自身結(jié)構(gòu)影響,且大多需要復(fù)雜的合成程序。熒光生物分子可實時讀出細(xì)胞溫度,重復(fù)性較好,但熒光強(qiáng)度較低,準(zhǔn)確性較差。量子點光化學(xué)穩(wěn)定性高,單一激發(fā)光源下可標(biāo)記并觀測多個位置溫度,靈敏度較高,但對細(xì)胞具有潛在毒性,重復(fù)性相對較差。稀土摻雜納米粒子測溫方法較多,但靈敏度和精確度會受能級間隔影響。金屬納米粒子發(fā)光穩(wěn)定,測量精度較高,但易被激光長時間照射而導(dǎo)致加熱,現(xiàn)多用于細(xì)胞內(nèi)部加熱控溫。

相比較而言,由于金剛石NV色心可制作成為10 nm至微米不同尺寸的顆粒,適應(yīng)多種類細(xì)胞測量,具有響應(yīng)速度快,化學(xué)穩(wěn)定性較高,對生物體友好等優(yōu)點,目前已有研究表明該方法具有高溫度分辨率和高測量靈敏度的潛力,在可編碼的測量序列下具有較強(qiáng)的抗干擾性,且在室溫下可實現(xiàn)量子調(diào)控,是一種優(yōu)異的量子傳感器。此外,金剛石NV色心不僅可作為溫度傳感,也可作為磁場、電場傳感介質(zhì),有望進(jìn)行多物理場測量。因此,基于金剛石NV色心及其混合結(jié)構(gòu)的測溫技術(shù)可以有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)細(xì)胞測溫技術(shù)的不足,為生物體及細(xì)胞的溫度測量提供一種新的技術(shù)方案。

目前,我國在金剛石NV色心測溫領(lǐng)域的研究才剛起步,對于測量方法、定量化技術(shù)參數(shù)、計量學(xué)特性等方面的研究尚不深入,并且缺乏在生物體及細(xì)胞測溫應(yīng)用方面的研究,未來該領(lǐng)域需要得到廣泛和持續(xù)性的關(guān)注和發(fā)展。

5 結(jié) 論

本文綜述了5類應(yīng)用于微納米尺度生物體溫度測量方法的代表性研究進(jìn)展,對比分析了各種技術(shù)的優(yōu)缺點。在已有的研究方法中,基于金剛石NV色心的測溫技術(shù)可在常溫下實現(xiàn)量子傳感,具有較高的空間、時間和溫度分辨率,以及良好的穩(wěn)定性與生物兼容性。鑒于生物醫(yī)學(xué)、新材料以及智能制造等領(lǐng)域?qū)ξ⒓{米尺度高精度溫度測量技術(shù)的需求,在未來需持續(xù)深入開展研究，解決限制技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵問題,不斷提高微納米尺度溫度測量性能。