新型冠狀病毒肺炎動物模型研究進展

蔡亞爭，周莉，，孫祖越

（1.湖北天勤生物科技有限公司武漢分公司，湖北武漢 430075；2.上海市計劃生育科學研究所，中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心，上海 200032；3.復旦大學生殖與發(fā)育研究院，上海 200032）

2020 年1 月5 日，中國首次向美國國家生物技術(shù)信息中心GenBank 數(shù)據(jù)庫提交SARS-CoV-2 基因組序列（MN908947.3）。SARS-CoV-2 是具包膜的正鏈RNA 病毒，屬于β 冠狀病毒，呈圓形或橢圓形顆粒，直徑60～140 nm［4］。SARS-CoV-2 外殼主要包含4 種結(jié)構(gòu)蛋白，分別是核衣殼蛋白（N 蛋白）、包膜蛋白（E 蛋白）、膜蛋白（M 蛋白）和刺突蛋白（spike glycoprotein，S 蛋白）［5］。SARS-CoV-2 通過S 蛋白與宿主細胞表面受體ACE2 特異性結(jié)合，進入宿主細胞內(nèi)復制引起感染［6］。

S蛋白由2個亞基S1和S2組成。S1主要包含受體結(jié)合區(qū)（receptor-binding domain，RBD），直接參與ACE2 的識別；S2 參與病毒與宿主細胞膜的融合［7-8］。最近研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸蛋白激酶受體UFO能夠結(jié)合SARS-CoV-2 的S 蛋白N 端結(jié)構(gòu)域，是SARS-CoV-2 感染人類呼吸系統(tǒng)的潛在受體，可能成為不依賴于ACE2的新受體［9］，為COVID-19 的治療提供新靶點。

迄今為止，尚無理想的COVID-19 動物模型。通過篩選易感動物、構(gòu)建人ACE2（human ACE2，hACE2）腺病毒載體、篩選鼠適應(yīng)性毒株、重組毒株和基因編輯技術(shù)等方法，研究人員成功開發(fā)出能夠部分模擬臨床表現(xiàn)、發(fā)病過程、病理生理學變化和免疫學反應(yīng)等特征的COVID-19 動物模型，主要包括非人靈長類、嚙齒類和其他哺乳類COVID-19 動物模型等。本文針對COVID-19動物模型特征和適用范圍進行綜述。

1 非人靈長類COVlD-19動物模型

研究發(fā)現(xiàn)，非人靈長類動物在遺傳學上與人親緣關(guān)系極其相近，其ACE2 受體與SARS-CoV-2 具有高親和力，非人靈長類COVID-19 動物模型可模擬部分臨床表現(xiàn)和病理病變特點［10-13］。Yu 等［10］曾構(gòu)建恒河猴COVID-19 動物模型，3～5 歲成年和15歲老年恒河猴通過氣管接種SARS-CoV-2 1×106半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（median tissue culture infective dose，TCID50），成年恒河猴表現(xiàn)出體重減輕、鼻腔內(nèi)病毒高效復制和間質(zhì)性肺炎等，而老年恒河猴表現(xiàn)出更嚴重的間質(zhì)性肺炎。而Shi等［12］研究發(fā)現(xiàn)，6～11歲恒河猴通過氣管接種SARS-CoV-2 7×106TCID50，恒河猴體重和體溫無變化，但表現(xiàn)出呼吸道病毒高效復制和肺組織輕度病理改變（包括肺血管內(nèi)血栓形成和細支氣管上皮細胞壞死脫落），并且有自愈的傾向。通過該動物模型進一步研究發(fā)現(xiàn)，恒河猴可抵抗病毒再次感染，抗SARSCoV-2單克隆抗體CB6具有治療和預防COVID-19的潛力，表明該模型可應(yīng)用于抗SARS-CoV-2 藥物篩選。

Rockx 等［13］構(gòu)建了食蟹猴COVID-19 動物模型，對4～5 歲成年和15～20 歲老年食蟹猴通過氣管和滴鼻聯(lián)合途徑接種SARS-CoV-2 1×106TCID50，成年和老年食蟹猴均未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，體重無明顯下降、呼吸道病毒高效復制和輕度肺組織病理改變（包括肺泡和細支氣管上皮細胞壞死、肺泡水腫和少量炎癥細胞浸潤等），而老年食蟹猴上呼吸道中檢測到病毒的時間有所延長。

雖然不同研究報道存在一定差異，但非人靈長類動物具有與人類相似的生物學特征，感染SARSCoV-2 后表現(xiàn)出體溫升高、肺部病毒載量增加和間質(zhì)肺炎，通過鼻拭子、咽拭子及肛拭子可檢測到病毒復制。目前，非人靈長類COVID-19 動物模型應(yīng)該是最有參考價值的模型，可適用于發(fā)病機制的研究和疫苗及治療性藥物的評估。但非人靈長類動物具有個體差異較大、繁殖周期長和價格高昂等缺點，因此其他種屬COVID-19 動物模型的開發(fā)十分必要。

2 嚙齒類COVlD-19動物模型

2.1 野生型嚙齒類動物模型

2.1.1 腺病毒轉(zhuǎn)導hACE2野生型小鼠

步驟2 計算各草莓植株所在位置的適應(yīng)度函數(shù)值，記錄最優(yōu)個體和最優(yōu)解。適應(yīng)度函數(shù)所計算的個體適應(yīng)度值為執(zhí)行一次訂單任務(wù)的總時間。

Anderson 等［14-15］開發(fā)了在巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）啟動子控制下表達hACE2 的腺病毒載體（Ad5-ACE2），Ad5-ACE2 可使小鼠表達hACE2。Sun 等［16］首次構(gòu)建了Ad5-hACE2 COVID-19 小鼠模型，給野生型小鼠滴鼻接種Ad5-ACE2 2.5×108病灶形成單位（focus forming unit，F(xiàn)FU），5 d 后小鼠肺上皮細胞表達hACE2 受體；通過滴鼻接種SARS-CoV-2 1×105空斑形成單位（plaque forming unit，PFU）感染病毒后，小鼠表現(xiàn)出體重減輕、肺部病毒高效復制和間質(zhì)性肺炎等。通過該模型顯示，COVID-19 患者恢復期血漿和瑞德西韋治療后，該模型小鼠體重減輕、肺部病毒載量升高和肺組織病理改變均有明顯改善。

Zost 等［17］將野生型小鼠滴鼻接種AdV-hACE2（表達hACE2 的腺病毒）2.5×108FFU，5 d 后滴鼻接種SARS-CoV-2 4×105PFU，觀察2 種單克隆抗體（COV2-2196 和COV2-2130）分別單獨用藥和聯(lián)合用藥的預防和治療作用。兩者分別單獨用藥和聯(lián)合用藥后，該模型小鼠體重減輕、肺部病毒載量升高和間質(zhì)性肺炎均有明顯改善。Zhang 等［18］通過Ad5-hACE2 模型證明，相比單克隆抗體2H2（來源于受體結(jié)合區(qū)免疫后的小鼠），c2H2/c3C1（人鼠嵌合化單克隆抗體組合）雙抗體雞尾酒療法對COVID-19 具有更好的治療效果，對該模型小鼠的肺部病毒載量降低更顯著。Tian 等［19］將野生型小鼠滴鼻接種Ad5-hACE2 2.5×108FFU，4 d 后滴鼻接種SARS-CoV-2 1.5×105PFU，用該模型驗證NVX-CoV2373 疫苗的預防效果。結(jié)果表明，NVXCoV2373 疫苗免疫后，該模型小鼠體重減輕、肺部病毒載量升高和間質(zhì)性肺炎均有明顯改善。Ad5-hACE2 小鼠COVID-19 模型可表現(xiàn)出體重減輕、肺部病毒高效復制和肺組織病理改變包括間質(zhì)性肺炎等，適用于抗病毒藥物的篩選和疫苗評價。缺點是該模型無法發(fā)展成嚴重致死的癥狀和無肺外組織損傷。

2.1.2 敘利亞金黃地鼠

Chan 等［20］發(fā)現(xiàn)，敘利亞金黃地鼠的ACE2 蛋白與hACE2 蛋白高度相似，與SARS-CoV-2 具有高親和力。給金黃地鼠滴鼻接種SARS-CoV-2 1×105PFU 感染病毒，2 d 后金黃地鼠表現(xiàn)出體重減輕、肺部病毒高效復制和肺組織輕度病理改變。Rosenke 等［21］通過該動物模型研究顯示，羥氯喹無明顯的預防或治療效果。Sia 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，給金黃地鼠滴鼻接種SARS-CoV-2 8×104TCID50感染病毒，2 d 后金黃地鼠表現(xiàn)出肺部病毒高效復制和肺組織輕度病理變化等與輕度COVID-19 患者類似的癥狀。Osterrieder 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，敘利亞金黃地鼠滴鼻接種來自慕尼黑的SARS-CoV-2M（SARSCoV-2 München）1×105PFU 感染病毒，2 d 后金黃地鼠表現(xiàn)出體重輕微減輕、肺部病毒高效復制和間質(zhì)性肺炎等。Kreye等［24］應(yīng)用該模型驗證了單克隆抗體CV07-209對感染SARS-CoV-2的敘利亞金黃地鼠的治療和預防作用。結(jié)果表明，經(jīng)單克隆抗體CV07-209 治療（接種病毒后2 h 給藥）和預防（接種病毒前24 h 給藥）后，該模型小鼠體重減輕和肺部組織病理改變（包括間質(zhì)性肺炎、支氣管上皮細胞壞死和炎癥細胞浸潤等）均有明顯改善。敘利亞金黃地鼠COVID-19 模型可模擬輕度臨床癥狀，但無法發(fā)展成嚴重致死的癥狀，適用于輕度患者發(fā)病機制研究和抗病毒藥物的評價。

2.1.3 基于鼠適應(yīng)病毒株和重組病毒株的小鼠感染模型

Wang等［25］通過實驗篩選出可適應(yīng)野生型小鼠的SARS-CoV-2 突變毒株HRB26M。給老齡小鼠接種HRB26M 1×104.4PFU感染病毒，3 d后老齡小鼠表現(xiàn)出呼吸道和肺部病毒高效復制及間質(zhì)性肺炎。通過該模型亦證明了瑞德西韋對病毒的抑制作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，與SARS-CoV-2（HRB26毒株）基因組比較，HRB26M 毒株有3 處氨基酸位點突變和1 處缺失，分別為nsp8 蛋白A81T、S 蛋白Q498H 和N969S 突變及S 蛋白中臨近裂解位點的675～679 位（QTQTN）缺失［25］。Gu 等［26］通過實驗篩選出適應(yīng)野生型BALB/c 小鼠的SARS-CoV-2 突變毒株MASCp6，給6周齡和9月齡的BALB/c小鼠滴鼻接種MASCp6 1.6×104PFU 感染病毒，2 d 后小鼠均表現(xiàn)出呼吸道和肺部病毒高效復制和間質(zhì)性肺炎，其中老齡小鼠表現(xiàn)出更嚴重的間質(zhì)性肺炎。同時應(yīng)用該模型測試了皮下注射重組亞單位候選疫苗（RBD-Fc），發(fā)現(xiàn)免疫RBD-Fc后能有效抑制肺部病毒復制并改善肺組織病理損傷。Dinnon等［27］通過反向基因技術(shù)設(shè)計出了重組毒株SARSCoV-2 MA，給BALB/c 小鼠接種1×105PFU 感染病毒，隨后小鼠表現(xiàn)出肺部病毒高效復制和肺組織病理改變（如上皮損傷、炎癥浸潤和細支氣管周圍淋巴細胞炎癥等）；候選藥物干擾素λ1a 治療后，該模型小鼠呼吸道上皮細胞中病毒載量明顯降低。

突變毒株或重組毒株COVID-19小鼠模型能模擬部分臨床病理病變，且具有很好的可重復性，適用于發(fā)病機制的研究、治療藥物和疫苗的評價，缺點是變異毒株或重組毒株可能會產(chǎn)生免疫逃逸現(xiàn)象。

2.2 轉(zhuǎn)基因嚙齒類動物模型

研究發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠的ACE2 與人類的ACE2存在一定差異，其ACE2受體與SARS-CoV-2的親和力較低，因此野生型小鼠不易感染SARSCoV-2［28］。SARS 期間開發(fā)出的多種轉(zhuǎn)基因小鼠模型逐漸被用于COVID-19 研究。通過基因編輯技術(shù)，國內(nèi)外科研人員成功構(gòu)建了可在不同啟動子驅(qū)動下表達hACE2 的轉(zhuǎn)基因小鼠，包括細胞角蛋白18（human cytokeratin，K18）編碼基因啟動子驅(qū)動下表達hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠（簡稱K18-hACE2小鼠）、肝細胞核因子3/叉頭同源物4（hepatocyte nuclear factor-3/fork homologue 4，HFH4）啟動子驅(qū)動下表達hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠（簡稱HFH4-hACE2小鼠）、CAG 啟動子驅(qū)動下表達hACE2 的轉(zhuǎn)基因小鼠譜系如AC-12，AC-22，AC-50，AC-63 和AC-70（簡稱CAG-hACE2 小鼠）和小鼠ACE2（mouse ACE2，mACE2）啟動子驅(qū)動下表達hACE2 的轉(zhuǎn)基因小鼠（簡稱mACE2-hACE2小鼠）。

2.2.1 K18-hACE2小鼠

McCray 等［29］開發(fā)了K18-hACE2 小鼠，而且hACE2 主要在上皮細胞中表達。Oladunni 等［30］構(gòu)建了K18-hACE2小鼠COVID-19模型，K18-hACE2小鼠接種SARS-CoV-2 1×105PFU 感染病毒，2 d后肺部病毒高效復制，肺組織出現(xiàn)嚴重病理變化（包括彌漫性肺泡損傷、炎癥細胞浸潤、組織損傷和肺血管損傷等）；6 d 內(nèi)小鼠體重下降20%，全部死亡。Zheng 等［31］構(gòu)建了致死性呼吸道疾病的K18-hACE2 小鼠COVID-19 模型，K18-hACE2 小鼠滴鼻接種SARS-CoV-2 1×105PFU 后，肺是病毒早期攻擊的主要靶器官，后期病毒透過血腦屏障損傷腦部，并且腦損傷可能是小鼠致死的主要原因。通過該模型證實了COVID-19患者恢復期血漿具有一定預防和治療COVID-19的作用。

K18-hACE2小鼠模型具有易感特點，可表現(xiàn)出部分臨床表現(xiàn)和病理病變，適用于抗病毒藥物的篩選和疫苗評價，但缺點是致命的腦炎與人類感染癥狀差異大。

2.2.2 HFH4-hACE2小鼠

Menachery 等［32］開發(fā)出HFH4-hACE2 小鼠。Jiang等［33］成功構(gòu)建了HFH4-hACE2小鼠COVID-19模型。HFH4-hACE2 小鼠滴鼻接種SARS-CoV-2 3×104TCID50，感染后在肺、氣管和腦中檢測到高病毒載量，并出現(xiàn)類似臨床病理改變（包括支氣管和肺血管周圍炎癥細胞浸潤、肺泡水腫和纖維蛋白滲出等），部分小鼠體重大幅減輕并發(fā)生致命的腦炎。進一步研究發(fā)現(xiàn)，預先暴露于SARS-CoV-2 的HFH4-hACE2小鼠可保護其免受病毒再次侵害。

HFH4-hACE2 小鼠模型具有易感特點，適用于抗病毒藥物的篩選和疫苗評價，但缺點是其致命的腦炎與人類臨床癥狀差異大。

2.2.3 CAG-hACE2小鼠

Tseng 等［34］開發(fā)出CAG-hACE2 小鼠，其中AC-70 小鼠的hACE2 在多種組織器官中均高度表達。AC-70小鼠滴鼻接種SARS-CoV 1×106TCID50，2 d 后表現(xiàn)出體重減輕、肺部病毒載量升高及血管和細支氣管周圍輕微至輕度炎癥浸潤，并伴有支氣管和細支氣管上皮細胞腫脹和空泡化；3 d后表現(xiàn)出肺炎癥浸潤減少及間質(zhì)增厚逐漸消退，腦內(nèi)病毒高效復制；8 d內(nèi)小鼠全部死亡［35］。但暫無正式報道使用該小鼠用于COVID-19研究。本研究集體研究表明，CAG-hACE2 小鼠接種SARS-CoV-2 1×105PFU，3 d后小鼠體重大幅減輕，部分小鼠死亡，肺部病毒高效復制，表現(xiàn)出SARS-CoV-2感染急性期病理變化等癥狀（待發(fā)表）。

2.2.4 mACE2-hACE2小鼠

研究人員通過不同方法開發(fā)出mACE2-hACE2小鼠［36-38］。Bao 等［37］通過將mACE2 啟動子顯微注射到ICR 小鼠受精卵原核中的方式培育出能表達hACE2 的mACE2-hACE2 小鼠，該小鼠接種SARS-CoV-2 1×105TCID50感染病毒后，表現(xiàn)出體重減輕、肺部病毒高效復制、彌漫性間質(zhì)性肺炎和廣泛的肺外器官損傷等，但癥狀較輕微且非致命，可能是由于小鼠肺部hACE2 表達水平較低。Sun等［38］通過CRISPR/Cas9 技術(shù)把hACE2cDNA 插入到mACE2基因中開發(fā)出表達hACE2的轉(zhuǎn)基因小鼠。該小鼠對SARS-CoV-2高度致敏，滴鼻SARSCoV-2 4×105PFU 感染病毒后，未觀察到明顯臨床癥狀；6 d 后在肺氣管和腦中均檢測到病毒復制，并出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎；老年mACE2-hACE2 小鼠肺組織病理變化更接近于臨床癥狀，并且ig 接種SARSCoV-2 5×106PFU 也可成功被感染，這為探究新的感染途徑提供了思路。

在K18，HFH4 和CAG 啟動子驅(qū)動下表達hACE2 的轉(zhuǎn)基因小鼠可模擬部分臨床表現(xiàn)和肺組織病理變化，但其局限性在于嚴重肺外器官損傷（包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)和致死性腦炎等）；在mACE2啟動子驅(qū)動下表達hACE2 的轉(zhuǎn)基因小鼠可模擬部分臨床表現(xiàn)和肺病理變化，但可能存在hACE2表達差異較大的缺點。因此，可根據(jù)hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠的臨床表現(xiàn)、病理生理學和病原學等重要指標，綜合考慮COVID-19動物模型的選擇。

3 其他哺乳類COVlD-19動物模型

3.1 雪貂

雪貂是常被用于人類呼吸道病毒研究的動物模型。Shi 等［39］發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2 可在雪貂上呼吸道中高效復制，而不會造成嚴重疾病或死亡。Kim 等［40］報道了SARS-CoV-2 感染和傳播的雪貂模型。雪貂鼻腔內(nèi)接種SARS-CoV-2 1×105.5TCID50感染病毒，2 d 后體溫升高，4 d 后在呼吸道出現(xiàn)病毒高效復制，并可通過空氣傳染，但肺部病毒復制量極低。Cox等［41］通過雪貂COVID-19模型研究發(fā)現(xiàn)，口服藥物莫納皮拉韋（molnupiravir）能明顯減少上呼吸道病毒載量并完全阻斷病毒傳染。雪貂COVID-19 模型可通過空氣傳播病毒，適用于對COVID-19 感染途徑的研究，缺點是肺部無大量病毒復制。

3.2 中國樹鼩

中國樹鼩是非人靈長類動物的近親。Xu 等［42］報道，中國樹鼩可能成為SARS-CoV-2 致病機制研究、藥物和疫苗評價的模型動物。約1 歲的成年中國樹鼩和5～6歲的老年中國樹鼩，通過ig、滴鼻和滴眼的途徑總接種SARS-CoV-2 1×107TCID50感染病毒，3 d 后表現(xiàn)出血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和尿素氮水平升高、肺部病毒高效復制和肺損傷（包括肺泡間隔增厚和間質(zhì)出血）等。有趣的是，從肺部病毒載量結(jié)果分析，與成年中國樹鼩相比，老年中國樹鼩似乎更不容易感染SARS-CoV-2。中國樹鼩有望成為SARS-CoV-2 致病機制研究、藥物和疫苗評價的模型動物。

4 結(jié)語

目前迫切需要理想的COVID-19動物模型用于致病機制研究及有效藥物和疫苗的評價。理想的動物模型應(yīng)該是易感動物，并且能夠最大化模擬人類COVID-19 疾病臨床表現(xiàn)、疾病過程、病理生理變化和免疫學反應(yīng)等疾病特征［43］。現(xiàn)已報道的COVID-19動物模型各有優(yōu)缺點（表1），研究人員應(yīng)根據(jù)研究目的選擇合適的動物模型。非人靈長類COVID-19 模型是目前相對理想的動物模型，可作為非臨床研究最后一步藥效學評估，但非人靈長類動物存在個體差異較大、繁殖慢和成本高等限制。Ad5-hACE2 小鼠COVID-19 動物模型能模擬臨床肺組織病理改變，且具有構(gòu)建周期短、方法簡單和易于重復等優(yōu)點，穩(wěn)定和可靠的hACE2腺病毒載體是該模型快速推廣到各研究機構(gòu)的關(guān)鍵。敘利亞金黃地鼠COVID-19 動物模型具有較大開發(fā)潛力，但癥狀相對較輕。變異毒株或重組毒株COVID-19小鼠模型能較好地模擬臨床肺組織病理改變，但該變異毒株或重組毒株可能會產(chǎn)生免疫逃逸現(xiàn)象。雪貂COVID-19 模型適用于呼吸道傳染研究，但肺病毒復制量較少。中國樹鼩COVID-19動物模型有望用于SARS-CoV-2 致病機制研究、藥物和疫苗評價。自從疫情爆發(fā)后，轉(zhuǎn)基因小鼠COVID-19 模型陸續(xù)被報道，但不同研究報道存在一定差異，包括轉(zhuǎn)基因小鼠品系、攻毒劑量和攻毒后觀察時間等。因此，研究人員需要提前摸索出可重復性高的轉(zhuǎn)基因小鼠COVID-19 動物模型。總之，COVID-19動物模型的進一步優(yōu)化和發(fā)展，對疾病發(fā)病機制的研究、抗病毒藥物和疫苗的研制起到至關(guān)重要的作用。

表1 現(xiàn)已報道的新型冠狀病毒肺炎（COVlD-19）動物模型的特征（截止2021-03-01）

雖然已有多款疫苗附條件上市，但令人擔憂的突變毒株，如快速傳播的奧密克戎B.1.1529 毒株，對現(xiàn)有的疫苗是否存在免疫逃逸需要進一步研究證實。COVID-19 發(fā)病機制的深入研究不僅是COVID-19 動物模型的進一步優(yōu)化和發(fā)展的基礎(chǔ)，而且是疫苗和藥物研發(fā)的基礎(chǔ)。因此，研究人員面臨的挑戰(zhàn)和突破是從分子層面深入揭示COVID-19發(fā)病機制，包括病毒感染、病毒復制、器官損傷和機體免疫反應(yīng)等。同時，鑒于現(xiàn)有的動物模型存在的差異，期望國內(nèi)外研究人員制備出更規(guī)范、成熟、穩(wěn)定的COVID-19動物模型。