海南白蟻共附生放線菌的分離鑒定及其抗熱帶作物病原真菌活性研究

吳煒城　陳必婷　張世清　郭志凱　李吉濤

摘? 要：白蟻（Isoptera）的筑巢和覓食活動主要在土壤及腐爛的木材上進(jìn)行，所以白蟻極易受到來自環(huán)境病原微生物的侵害。因此，白蟻需要依賴共附生微生物菌群形成防御體系，放線菌是其中一個重要的類群，且放線菌能產(chǎn)生具有抗菌活性的次級代謝產(chǎn)物。但是白蟻共附生放線菌能否對熱帶作物的病原真菌有抑制活性有待研究。為了挖掘在熱帶農(nóng)業(yè)綠色健康發(fā)展中具有應(yīng)用潛力的海南特色農(nóng)用放線菌資源，以海南白蟻共生放線菌為研究對象，利用平板分離法從采集的健康白蟻體內(nèi)分離純化放線菌，利用平板對峙法篩選生防菌株;通過分子生物學(xué)確定其分類地位;平板對峙法研究拮抗菌株的抗菌穩(wěn)定性、持效性和廣譜性;濾紙片法研究抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性。結(jié)果從海南白蟻體內(nèi)分離得到1株拮抗活性較好的放線菌菌株W7，系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明該放線菌與鏈霉菌屬（）親緣關(guān)系接近。菌株W7的抗菌活性持久性強(qiáng)，平板接種30?d后仍對植物病原真菌具有抑菌活性，抗菌穩(wěn)定性好;菌株W7抑菌譜廣，對16株植物病原真菌有不同程度的抑菌活性，其中對芒果膠孢霉（Penz.）、香蕉炭疽霉（）、辣椒棒孢霉（）、豇豆瓜果腐霉[ （Edson） Fitzp]抑制作用較強(qiáng)，對蘆筍擬莖點霉（）、荔枝疫霉（）抑制作用較弱;菌株W7發(fā)酵粗提物有較好的熱穩(wěn)定性，但是抑菌率會隨著水浴溫度的增高而降低。本文首次對海南白蟻共附生放線菌進(jìn)行了分離鑒定，并從中篩選得到1株具有抑制多種熱帶作物病原真菌活性的生防菌株，為高效生防菌劑的研發(fā)提供新資源。

關(guān)鍵詞：白蟻;共附生放線菌;植物病原真菌;生防菌劑中圖分類號：S476.1 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Isolation and Identification of Symbiotic Actinomycetes from Termites in Hainan and Their Activity Against Tropical Plants Pathogenic Fungi

WU WeichengCHEN BitingZHANG ShiqingGUO ZhikaiLI Jitao

1. Hubei Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization （Hubei Minzu University）， Enshi， Hubei 445000， China; 2. Hainan Key Laboratory of Tropical Microbe Resources / Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 3. Hainan Key Laboratory of Conservation and Utilization of Tropical Agricultural Bioresources / Hainan Institute of Tropical Agricultural Resources， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

The nesting and foraging activities of termites are mainly carried out in soil and rotting wood， where many pathogenic microorganisms live. However， termites are extremely vulnerable to these environmental pathogenic microorganisms. Therefore， termites need to rely on their mutualistic symbiotic microflora to form a defense system. Species of actinomycetes are one of the important groups in termite’s symbiotic microflora， which can produce diverse structures of secondary metabolites with antibacterial and antifungal activity. Whether the actinomycetes in termites can inhibit the pathogenic fungi of tropical crops remains to be studied. In order to explore the characteristic actinomycetes with potential application in the healthy development of tropical agriculture in Hainan， the actinomycetes were isolated and purified by the plate separation method from the healthy termites collected in the tropical plants garden of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences in Haikou. Biocontrol strains were screened against 16 species of plant pathogenic fungi including Penz.， ， ， ， ， ， ， Fetrak & Cif.， ， ， ， sp.， （Edson） Fitzp and by the growth plate-confrontation method. Identification of bioactive strain was based on the phylogenetic tree analysis constructed with 16S rRNA gene sequence. Growth plate-confrontation was directly used to investigate the antimicrobial stability， persistence and bacteriostatic spectrum for the strain and the filtering paper method was used to study the heat stability of antimicrobial substances for the crude extract of the bioactive strain. As a result， one strain of actinomycete （W7） with the best biocontrol activity was isolated from termites. Phylogenetic tree analysis showed that the strain W7 was closely related to genus. Most importantly， the bioactivity tests showed that the strain W7 had strong antifungal persistence and antifungal stability， even after cultivating for 30 d， it still had better antifungal against the tested plant pathogenic fungi. The strain W7 had inhibitory activity against 16 pathogenic fungi. It had strong inhibitory activity against plant pathogenic fungi ， ，（Edson） Fitzp， with strong antibacterial persistence and antibacterial stability. The strain also displayed weak antibacterial activity on plant pathogenic fungi ，. The fermentation extract showed good heat stability towards the mango pathogenic fungi Penz.， but the inhibition rate would decrease with the increase of water bath temperature. This is the first paper to investigate the termite-associated actinomycetes in Hainan. Bioactivity evaluation revealed termite-associated actinomycetes could be good resources for discovering biocontrol agent to control crop disease.

termite; symbiotic actinomycetes; plant pathogenic fungi; biocontrol agent

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.017

放線菌（Actinomycetes）是一種革蘭氏陽性、高G+C含量的原核微生物，也是生物活性化合物的主要來源之一。最廣為人知的便是抗生素，約有70%的天然抗生素來源于放線菌。這些次級代謝產(chǎn)物被應(yīng)用在抗癌、免疫抑制劑、抗真菌等領(lǐng)域，其中對人類貢獻(xiàn)最大的是制成抗菌劑。隨著時間的推移，土壤來源的新放線菌及活性良好的天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)概率逐漸下降，尋找新的放線菌來源成為目前的研究熱點。昆蟲是地球上最多樣化的動物群體，幾乎占據(jù)了每一個環(huán)境生態(tài)位。昆蟲在長期進(jìn)化的過程中，其體內(nèi)的共生和/或致病微生物已經(jīng)適應(yīng)昆蟲作為宿主。由于特殊的生活方式和取食行為，昆蟲往往容易受到環(huán)境的威脅和病原體的侵?jǐn)_，群居昆蟲表現(xiàn)更為明顯。昆蟲可以通過體內(nèi)共生菌群產(chǎn)生的天然產(chǎn)物作為防御手段抵抗這些威脅。白蟻（Isoptera）作為一種社會性昆蟲，逐漸成為發(fā)現(xiàn)新的生物活性化合物的重要來源。

白蟻大量生活在熱帶和亞熱帶地區(qū)，溫帶地區(qū)也有發(fā)現(xiàn)。自然環(huán)境中，它們在復(fù)雜生物聚合物的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用，同時，還增加土壤通氣性和排泄性。但是，白蟻的筑巢和覓食活動主要在土壤和腐爛的木材上進(jìn)行，營養(yǎng)物質(zhì)少且易受環(huán)境病原微生物入侵。因此，白蟻要依賴腸道密集多樣的微生物菌群獲取營養(yǎng)以及形成防御體系。放線菌則是其中一個重要的類群。研究人員在高等和低等白蟻的腸道內(nèi)、巢穴及其周圍土壤均發(fā)現(xiàn)大量共生放線菌。白蟻共附生放線菌是一個相對研究較少的特殊環(huán)境微生物，是新穎天然產(chǎn)物的來源之一，其研究尚處于起步階段，目前只對少部分白蟻共附生放線菌產(chǎn)生的小部分天然產(chǎn)物進(jìn)行了研究。例如，VISSER等發(fā)現(xiàn)白蟻共生放線菌產(chǎn)生的化合物能抑制假木霉（）對白蟻的入侵。胡松英等發(fā)現(xiàn)一株白蟻共生鏈霉菌屬菌株BY02，其粗提物對蘋果腐爛菌（）、楊樹潰瘍病菌（）和番茄早疫病菌（）具有抑制效果。共生菌是生防菌的主要來源，因此，對白蟻共生放線菌分離及其抗植物病原真菌的研究、開發(fā)顯得十分重要，也對農(nóng)業(yè)等社會生產(chǎn)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用意義。

真菌感染位居植物病害起因的首位，能導(dǎo)致作物大量減產(chǎn)。農(nóng)用抗菌劑、殺蟲劑等化學(xué)品對作物生產(chǎn)具有顯著效果，得以滿足全球農(nóng)業(yè)的需求。但是，廣泛使用化學(xué)農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境傷害極大，也會增強(qiáng)作物抗藥性，對人體健康也有影響。隨著人們環(huán)保意識的不斷加強(qiáng)，尋求環(huán)保、高效的防治方法成為世界各國的研發(fā)目標(biāo)。其中，微生物農(nóng)藥具有對作物安全性高、對環(huán)境友好、不易產(chǎn)生抗藥性等特點而受到廣泛關(guān)注。我國學(xué)者也提出了多個研究方向，其中包括活體微生物農(nóng)藥和代謝產(chǎn)物農(nóng)藥。

本研究從海南白蟻中分離并篩選出具有生防效果的共附生放線菌，并對其進(jìn)行生物學(xué)鑒定;同時研究其對農(nóng)業(yè)病原菌的抗菌穩(wěn)定性、持效性和抑菌譜，研究結(jié)果將為研發(fā)高效的生防菌劑提供資源。

? 材料與方法

? 材料

1.1.1? 供試樣品? 供試白蟻采自位于海南省?？谑旋埲A區(qū)學(xué)院路4號的中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物園區(qū)內(nèi)，裝入自封袋，帶回實驗室處理。

1.1.2? 供試菌株? 龍船花炭疽霉（）：菌株編號LCT;小葉龍船葉點霉（）：菌株編號XLY;小葉龍船擬盤多毛孢霉（）：菌株編號XLN;火龍果桃吉爾霉（）：菌株編號HLT;蘆筍擬莖點霉（）：菌株編號LSN;豇豆棒孢霉（sp）：菌株編號JDB;木瓜二孢霉（）：菌株編號MGE;木瓜擬莖點霉（Fetrak & Cif.）：菌株編號MGN;芒果膠孢霉（Penz.）：菌株編號MGJ;木瓜炭疽霉（Penz.）：菌株編號MGT;椰子奇異串根霉（）：菌株編號YZQ;香蕉炭疽霉（）：菌株編號XJT;辣椒炭疽霉（sp）：菌株編號LJT;辣椒棒孢霉（）：菌株編號LJB;豇豆瓜果腐霉[（Edson） Fitzp]：菌株編號JDG;荔枝疫霉（）：菌株編號LZY。以上供試植物病原菌均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所分離保存。

?方法

1.2.1? 共附生放線菌的分離與純化? 將采集的15只白蟻在無菌水中清洗3次，然后浸入75%酒精中表皮消毒30 s，最后用無菌水漂洗3次。蟲體置于無菌研缽，加入少量無菌水研磨，用無菌水進(jìn)行梯度稀釋（稀釋倍數(shù)為10、10、10、10），取各梯度稀釋液150 μL涂布于高氏一號培養(yǎng)基平板（含50?μg/mL重鉻酸鉀），28℃恒溫培養(yǎng)。根據(jù)菌落形態(tài)和大小，挑取平板上菌落孢子或邊緣菌體進(jìn)行純化培養(yǎng)、編號。純化后分別于甘油管-20℃保存。

1.2.2? 拮抗放線菌初篩、復(fù)篩? 以香蕉炭疽霉XJT、芒果膠孢霉MGJ、龍船花炭疽霉LCT、辣椒棒孢霉LJB作為指示菌，采用平板對峙法進(jìn)行初篩，觀察有無抑菌帶，篩選具有拮抗作用的共生放線菌。

對有良好拮抗活性的放線菌進(jìn)行復(fù)篩，采用平板對峙法，以只接病原真菌塊為對照組，直至對照組長滿平板后進(jìn)行觀察。每個處理重復(fù)3次，十字交叉法測量菌落直徑，求出菌株對各病原真菌的抑菌率。抑菌率=[（對照組病原菌生長直徑-病原菌塊直徑）-（處理組病原菌生長直徑-病原菌塊直徑）]/（對照組病原菌生長直徑-病原菌塊直徑）×100%。

1.2.3? 拮抗放線菌的抗菌持效性研究? 以芒果膠孢霉MGJ為指示菌，采用平板對峙法，以只接種病原真菌為對照組，28℃恒溫培養(yǎng)，每個處理重復(fù)3次。培養(yǎng)7、15、30、40 d后觀察，計算各時期的抑菌率。

1.2.4? 拮抗放線菌的抗菌穩(wěn)定性研究 ?以芒果膠孢霉MGJ為指示菌，采用平板對峙法，平板培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接5代拮抗放線菌，以此作為處理組，以只接種病原真菌為對照組，28℃恒溫培養(yǎng)10 d，計算指示菌的抑菌率。

1.2.5? 抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性研究? 利用鏈霉菌培養(yǎng)基2號（international streptomyces project medium No.2， ISP 2）固體平板對活性放線菌進(jìn)行固體發(fā)酵。在長滿放線菌的種子平板上倒入3 mL無菌水，用接種環(huán)刮落孢子制成菌液，然后吸取150?μL菌液涂布于新鮮的ISP 2平板上，共涂布100個直徑9 cm的ISP 2平板，培養(yǎng)10 d后，將固體平板用甲醇浸提3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮后合并得到粗提物。

粗提物溶解為濃度1 mg/mL的溶液，均分為4份，分別置于40、50、60℃溫度下水浴1 h。以芒果膠孢霉MGJ為指示菌，采用濾紙片平板對峙法，無菌水作陰性對照，對照組為不作處理的溶液，每張濾紙片加10 μL溶液，每個處理重復(fù)3次，28℃恒溫培養(yǎng)5 d后，計算指示菌的抑菌率。

1.2.6? 抗放線菌的抗菌譜研究? 以菌株編號為HLT、XLY、XLN、LCT、LSN、LJT、JDB、MGE、YZQ、MGJ、MGN、MGT、XJT、LJB、JDG、LZY的16株病原真菌作為指示菌，采用平板對峙法，以只接種病原菌塊為對照組，每個處理重復(fù)3次，計算各指示菌的抑菌率，評價拮抗共附生放線菌的抗菌廣譜性。

1.2.7 ?拮抗放線菌16S rRNA基因序列分析? 將菌株W7單菌落接種到ISP 2平板固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)5 d，使用TSINGKE植物DNA提取試劑盒（通用型）提取總DNA，PCR擴(kuò)增選擇通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。PCR反應(yīng)體系總體積50 μL。擴(kuò)增條件為預(yù)變性98℃，2 min，變性98℃，10 s，退火56℃，10 s，延伸72℃，10 s，35個循環(huán);終延伸72℃，5 min。0.8%瓊脂糖凝膠用于檢測PCR反應(yīng)后獲得的片段（電壓300 V，時間12 min），使用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果，陽性結(jié)果送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司測序。將獲得的序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST相似性比對，選擇相似度大于98%的菌株的16S rRNA基因序列作為參比對象，在MEGA-X軟件中進(jìn)行多序列比對，通過鄰接法（neighbor-joining）進(jìn)行聚類分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)Kimura two parameter模型評估系統(tǒng)進(jìn)化矩陣，自展值（bootstrap value）1000次用于評估進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

? 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并作統(tǒng)計分析，處理組間顯著性差異用單因素方差分析和Turkey多重比較檢驗法。

結(jié)果與分析

? 共附生放線菌的分離與純化

從中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？谠簠^(qū)采集的白蟻樣品中分離得到4株放線菌，菌株編號為t55、t108、t198、W7。

?拮抗共生放線菌的初篩、復(fù)篩

4株共生放線菌通過平板對峙法進(jìn)行抗菌活性初篩和復(fù)篩，篩選得到1株對供試病原菌有較好抑制作用的放線菌菌株W7（圖1）。結(jié)果顯示對4株供試真菌都具有抑制作用。對芒果膠孢霉（）抑菌率為72.73%，對龍船花炭疽霉（）抑菌率為60.87%，對辣椒棒孢霉（）抑菌率為59.15%，對香蕉炭疽霉（）抑菌率為57.14%。根據(jù)初篩和復(fù)篩試驗，選取芒果膠孢霉作后續(xù)試驗菌株。

? 拮抗放線菌拮抗作用的持效性研究

通過測量不同時間病原菌菌落直徑變化，結(jié)果表明，對照組病原菌落直徑由57.21 mm增長至84.20 mm，接種拮抗放線菌W7的病原菌落直徑由20.19?mm增長至36.09?mm。接種拮抗放線菌W7的處理組30 d內(nèi)病原菌落生長速度明顯慢于對照組，表明菌株W7能夠較持久抑制病原菌的生長。

菌株W7不同世代的菌株對芒果膠孢霉MGJ均有抑制效果，且抑制效果較好。菌株W7從第1代至第5代的抑菌率在70.83%～73.18%之間波動。雖然抑菌率有所變化，但波動范圍較小，說明菌株W7對芒果膠孢霉MGJ的抑制作用較穩(wěn)定。

菌株W7不同培養(yǎng)時間下對芒果膠孢霉的抑菌效果如表1，抑菌率隨培養(yǎng)時間的延長呈下降趨勢，最后趨于穩(wěn)定。接種15 d后的抑菌率與接種7?d后的抑菌率呈顯著差異，15?d后抑菌率下降速度變慢，30 d后抑菌率趨于穩(wěn)定，達(dá)67.53%。表明，菌株W7對病原菌抑制作用較持久。

?抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性研究

菌株W7粗提物在不同溫度下對芒果膠孢霉MGJ的抑菌率見表2，抑菌率隨溫度升高而降低，60℃高溫下仍對病原菌有較好的抑制作用。因此，菌株W7的抑菌物質(zhì)有較好的熱穩(wěn)定性。

?拮抗共附生放線菌抗菌譜研究

菌株W7對菌株編號為HLT、XLY、XLN、LCT、LSN、LJT、JDB、MGE、YZQ、MGJ、

MGN、MGT、XJT、LJB、JDG、LZY的16株病原真菌均有抑制效果，表明菌株W7的抗菌譜較廣，并且該菌株對豇豆瓜果腐霉菌JDG、小葉龍船擬盤多毛孢霉菌XLN、木瓜擬莖點霉菌MGN均具有較強(qiáng)的抑制作用，對炭疽類病原菌MGJ、LCT、LJT和XJT普遍具有較好的抑制活性，但對蘆筍擬莖點霉菌LSN、荔枝疫霉菌LZY抑制作用最弱（表3）。

? 菌株分子鑒定

用16S rRNA基因通用引物對菌株W7進(jìn)行序列擴(kuò)增并測序，得到1365?bp左右的序列，經(jīng)BLAST比對，選取相似性較高且有效發(fā)表的菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，菌株W7與鏈霉菌屬KC-106聚在同一分支上（圖2）。比對結(jié)果顯示菌株W7屬于鏈霉菌（sp.）。

? 討論

本文首次對海南白蟻來源的放線菌進(jìn)行了研究，抗農(nóng)業(yè)病原菌活性篩選發(fā)現(xiàn)鏈霉菌菌株sp. W7對多種熱帶作物病原真菌具有不同程度的體外拮抗活性，表明其抗菌譜較廣，此外它還具有一定程度的專一性，能較好抑制炭疽類病原真菌。進(jìn)一步對其進(jìn)行活性評價，發(fā)現(xiàn)該菌株對芒果膠孢霉MGJ的抑制作用隨時間的延長逐漸降低，后趨于穩(wěn)定趨勢。接種7?d左右對照組菌落正常生長，處理組因拮抗放線菌的抑

制作用，指示菌生長速度較慢，抑菌率較高，7～ 15?d病原菌對拮抗菌產(chǎn)生一定抗性，因此抑菌率下降較快，15?d后可能由于培養(yǎng)皿直徑大小、培養(yǎng)基營養(yǎng)不足等因素的限制，抑菌率下降趨勢變緩，30?d后抑菌率無明顯變化。上述結(jié)果表明菌株W7對芒果膠孢霉MGJ的抑菌持效性較好。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)sp. W7不同世代的菌株對芒果膠孢霉MGJ均表現(xiàn)較好的抑制作用，抑制率較高，表明菌株W7的抗菌穩(wěn)定性較好。

菌株W7的粗提物溶液在高溫仍對芒果膠孢霉MGJ有較明顯的抑制作用，表明該菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可能在自然條件下具有較好的熱穩(wěn)定性。今后將對該菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)進(jìn)行分離純化，并鑒定其結(jié)構(gòu)類型，為相關(guān)農(nóng)用藥物的研發(fā)提供先導(dǎo)物質(zhì)。

如前言所述，當(dāng)前關(guān)于白蟻共生菌群的天然產(chǎn)物及其生物活性研究較少。本研究分離得到的放線菌株W7與胡松英等從白蟻中分離的鏈霉菌BY02經(jīng)BLAST比對，2株鏈霉菌同屬不同種。但與SRIPREECHASAK等從土壤中分離得到的菌株 KC-106相似性高。關(guān)于海南省白蟻的研究主要集中于生物學(xué)特性研究，尚未見海南白蟻共附生放線菌的相關(guān)研究。因此，研究這類新型放線菌資源對海南特色生物資源的挖掘利用具有重要指導(dǎo)意義。目前，基于PacBio測序技術(shù)已對該菌株的全基因組進(jìn)行了測序及拼接組裝，獲得了完整的基因組。進(jìn)一步通過antiSMASH（https：//antism-ash. sec-ond-arymetabolites.org）在線分析其基因組中負(fù)責(zé)次級代謝產(chǎn)物合成的基因，預(yù)測出33個次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇（尚未發(fā)表）。后續(xù)研究工作將重點開展活性物質(zhì)分離、鑒定、活性物質(zhì)生物合成基因簇的挖掘和大田活性評價等方面，為熱帶作物病害的綠色防控提供基礎(chǔ)資源。

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