甘蔗線條花葉病毒RNA沉默抑制子的寄主互作蛋白鑒定

馮小艷　王俊剛　王文治　沈林波　趙婷婷　馮翠蓮　張樹珍

摘? 要：甘蔗線條花葉病毒（， SCSMV）是引起甘蔗花葉病的一種主要病原。SCSMV編碼的P1蛋白是RNA沉默抑制子，在SCSMV抑制寄主的RNA沉默防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但其作用機制尚未清楚。與寄主蛋白互作是RNA沉默抑制子發(fā)揮其抑制作用的主要途徑之一，因此鑒定與病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用機制的一個重要方法。為探究SCSMV P1抑制寄主RNA沉默的機制，本研究首先將SCSMV 基因連接到質(zhì)粒pGBKT7上構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-P1，然后對pGBKT7-P1進(jìn)行毒性和自激活檢測，最后以pGBKT7-P1為誘餌，采用酵母雙雜交技術(shù)從甘蔗cDNA文庫中篩選與P1互作的寄主蛋白。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒。將pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Y2H Gold酵母菌株后，酵母菌株在SD/-Trp平板及液體培養(yǎng)基中生長良好，表明pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒對Y2H Gold酵母菌株無毒性。含pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒的酵母菌株在SD/-Trp/X-α-Gal平板上長出白色菌落未變藍(lán)，在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA和SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板上無菌落生長，表明pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒無自激活活性。用pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒對甘蔗cDNA文庫進(jìn)行篩選，經(jīng)SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板篩選1次及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA平板篩選3次后，獲得42個陽性酵母克隆，提取陽性酵母質(zhì)粒并導(dǎo)入大腸桿菌中擴大培養(yǎng)，經(jīng)測序及blastx比對分析，獲得13個可能與SCSMV P1互作的寄主甘蔗蛋白，分別是生長素應(yīng)答蛋白IAA1、IAA15，轉(zhuǎn)錄因子NAC、GATA4、OFP4，真核翻譯起始因子eIF5A，分子伴侶DnaJ，輔分子伴侶SBA1，重金屬相關(guān)異戊二烯化植物蛋白HIPP35，mec-8和unc-52蛋白同系物抑制子SMU2，外膜孔蛋白OEP24，及2個未表征蛋白?；谶@些蛋白的功能，推測P1可能通過與寄主蛋白互作來調(diào)控寄主防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，和/或通過與寄主蛋白互作來影響寄主RNA沉默相關(guān)蛋白的合成、加工或轉(zhuǎn)運，從而發(fā)揮其RNA沉默抑制子的功能。研究結(jié)果為后續(xù)深入解析P1抑制RNA沉默的作用機制奠定了重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甘蔗線條花葉病毒;RNA沉默抑制子;P1蛋白;互作蛋白中圖分類號：S435.661 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Identification of Host Proteins Interacting with RNA Silencing Suppressor of

FENG Xiaoyan， WANG Jungang， WANG Wenzhi， SHEN Linbo， ZHAO Tingting， FENG Cuilian，ZHANG Shuzhen

Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

（SCSMV） is a major pathogen of sugarcane mosaic disease. P1 protein encoded by SCSMV is an RNA silencing suppressor， which plays a key role in suppressing the host’s RNA silencing defense. However， its mechanism is not yet clear. Interaction with host proteins is one of the main pathways for RNA silencing suppressors to exert the suppression functions. Therefore， identifying host proteins that interact with viral RNA silencing suppressors is an important method to study the mechanism of suppressors. In order to explore the mechanism of SCSMV P1 suppressing the host RNA silencing， in this study， SCSMV was ligated to the plasmid pGBKT7 to construct the bait plasmid pGBKT7-P1， then pGBKT7-P1 was tested for toxicity and self-activation， and finally pGBKT7- P1 was used as a bait to screen the host proteins that interact with P1 from the sugarcane cDNA library by yeast two-hybrid technology. The results showed that the bait plasmid pGBKT7-P1 was successfully constructed. After the pGBKT7-P1 bait plasmid was transferred into the Y2H Gold yeast strain， the yeast strain grew well in the SD/-Trp plate and liquid medium， indicating that the pGBKT7-P1 bait plasmid was non-toxic to the Y2H Gold yeast strain. The yeast strain containing the pGBKT7-P1 bait plasmid grew white rather than blue colonies on the SD/-Trp/X-α-Gal plate， and did not grow on the SD/-Trp/X-α-Gal/AbA and SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA plates， indicating that the pGBKT7-P1 bait plasmid had no self-activation activity. The sugarcane cDNA library was screened with pGBKT7-P1 bait plasmid. After screening on SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA plate once and SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA plate three times， 42 positive yeast clones were obtained. The positive yeast plasmids were extracted and introduced into for amplification. After sequencing and blastx comparison analysis， a total of 13 host sugarcane proteins that may interact with SCSMV P1 were obtained， namely auxin-responsive proteins IAA1， IAA15， transcription factors NAC， GATA4， OFP4， eukaryotic translation initiation factor eIF5A， chaperone DnaJ， co-chaperone SBA1， heavy metal-associated isoprenylated plant protein HIPP35， suppressor of mec-8 and unc-52 protein homolog SMU2， outer envelope pore protein OEP24， and two uncharacterized proteins. Based on the functions of the proteins， it was speculated that P1 may interact with host proteins to regulate the expression of host defense response-related genes， and/or interact with host proteins to affect the synthesis， processing， or transport of host RNA silencing-related proteins， thereby exerting the RNA silencing suppressor function of P1. The research results would lay an important foundation for the subsequent in-depth analysis of the RNA silencing suppression mechanism of P1.

; RNA silencing suppressor; P1 protein; interacting protein

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.016

甘蔗線條花葉病毒（， SCSMV）隸屬馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）禾本科病毒屬（），是引起甘蔗花葉病的主要病原之一。SCSMV侵染甘蔗除能引起典型的花葉癥狀外，還會導(dǎo)致甘蔗植株矮化，分蘗減少，汁液變少，口感變差，產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降。據(jù)統(tǒng)計，當(dāng)SCSMV發(fā)生率超過50%時，可導(dǎo)致蔗莖和蔗糖產(chǎn)量分別顯著下降16%～17%和19%～21%。自1978年首次報道以來，SCSMV在全球范圍迅速傳播，目前已在中國、印度尼西亞、泰國、印度等主要甘蔗種植國家廣泛發(fā)生，嚴(yán)重制約甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)展。目前缺乏行之有效的針對SCSMV的科學(xué)防控方法。

RNA沉默是植物用以抵抗病毒侵染的重要天然防御機制^[6-。病毒為了對抗這一機制，在與植物長期共進(jìn)化過程中，通過自身編碼RNA沉默抑制子來干擾植物的RNA沉默通路從而建立有效侵染。RNA沉默抑制子通常是病毒成功侵染植物的必需因子，因此，闡明其作用機制可為病毒的科學(xué)防控提供理論指導(dǎo)。SCSMV編碼的P1蛋白是RNA沉默抑制子，其在SCSMV抑制寄主的RNA沉默防御從而建立有效侵染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但目前尚未清楚其抑制RNA沉默的作用機制。解析SCSMV P1的作用機制對該病毒的科學(xué)防控具有重要意義。

RNA沉默抑制子不僅可以通過結(jié)合siRNA和dsRNA來發(fā)揮其抑制作用，還可通過與寄主蛋白互作來實現(xiàn)其抑制功能。因此，鑒定與病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用機制的一個重要途徑。目前，已有多個病毒RNA沉默抑制子的寄主互作蛋白被鑒定，這些互作蛋白種類多樣、功能不一，按作用通路大致可歸納為2類，一類是RNA沉默通路蛋白，另一類是非RNA沉默通路蛋白。RNA沉默通路蛋白：AGO、Dicer、DRB4、RDR6和SGS3是RNA沉默通路中的重要蛋白，有些病毒編碼的抑制子與這些蛋白中的一個或幾個互作，通過干擾它們的正常功能來抑制RNA沉默。非RNA沉默通路蛋白：馬鈴薯Y病毒屬（）病毒編碼的HC-Pro抑制子與寄主轉(zhuǎn)錄因子RAV2互作，可能通過RAV2調(diào)控寄主防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)來抑制寄主的RNA沉默機制。黃瓜花葉病毒（，CMV）編碼的2b抑制子與寄主核糖體蛋白亞基RPS11互作，下調(diào)寄主中RPS11的mRNA水平導(dǎo)致2b抑制子活性降低、病毒復(fù)制和積累減少，表明2b可能通過作用于寄主蛋白RPS11來發(fā)揮其抑制子功能。甜菜嚴(yán)重曲頂病毒（， BSCTV）、甜菜曲頂病毒（， BCTV）和番茄金色花葉病毒（， TGMV）編碼的抑制子與寄主甲基化循環(huán)相關(guān)蛋白SAMDC1或ADK互作，通過抑制SAMDC1降解或者促使ADK失活，從而抑制寄主DNA甲基化介導(dǎo)的基因沉默。

鑒定與病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用機制的重要途徑，目前已被應(yīng)用于多個病毒RNA沉默抑制子作用機制的解析，但未見SCSMV編碼的RNA沉默抑制子P1與寄主蛋白互作研究的報道。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與SCSMV P1蛋白互作的寄主（甘蔗）蛋白，以期為闡明SCSMV P1抑制RNA沉默的作用機制奠定基礎(chǔ)，為SCSMV的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

?材料與方法

?材料

酵母雙雜交所用質(zhì)粒pGBKT7購自美國Clontech公司。Y2H Gold菌株和DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。高保真酶Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;快速限制性內(nèi)切酶購自美國Thermo Scientific公司;T DNA連接酶購自美國Promega公司;X-α-gal和AbA溶液購自北京酷來搏科技有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司;酵母質(zhì)粒提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

?方法

1.2.1 ?SCSMV 基因的克隆? 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中SCSMV的基因組序列（GenBank：GQ246 187.1）及本實驗室獲得的SCSMV 基因序列（待發(fā)表）設(shè)計基因擴增引物，并在正向引物引入酶切位點R I，反向引物引入酶切位點H I，引物序列具體如下：P1-R I-F：TCCGA ATTCATGGCTACTATCACTAAG，P1-H I-R：TCCGGATCCTCAGTAAAATACTAAATCTTC。以實驗室保存的含有基因的pMD-18T載體為模板，使用高保真酶Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase PCR擴增基因。擴增程序：95℃ 30?s;95℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 17 s（30個循環(huán)）;72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

1.2.2 ?pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建? 將基因膠回收產(chǎn)物用快速限制性內(nèi)切酶R I和H I進(jìn)行雙酶切，然后使用T DNA連接酶將酶切后的基因與經(jīng)相同酶切處理的pGBKT7質(zhì)粒進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，采用PCR法鑒定陽性克隆。提取陽性克隆質(zhì)粒并進(jìn)行酶切驗證，將酶切驗證正確的質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果正確的質(zhì)粒即為pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒。

1.2.3 ?誘餌質(zhì)粒毒性及自激活檢測? 按照Clontech公司的Yeastmaker Yeast Transformation System 2手冊說明進(jìn)行Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。毒性檢測：將100 ng的pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒和pGBKT7空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞，然后取100 μL稀釋10倍的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于SD/-Trp平板，30℃倒置培養(yǎng)3?d左右，挑取平板上生長良好的單菌落接種于50 mL SD/-Trp（含50 μg/mL卡那霉素）液體培養(yǎng)基中，30℃ 260 r/min培養(yǎng)20～24 h后測量值。自激活檢測：將轉(zhuǎn)化了pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒、pGBKT7空質(zhì)粒、陽性對照質(zhì)粒（pGBKT7-53和pGADT7-T）和陰性對照質(zhì)粒（pGBKT7-Lam和pGADT7-T）的Y2H Gold酵母菌分別劃線于分區(qū)的SD/-Trp、SD/-Trp/X-α- Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/AbA和SD/-Trp/-Leu/X-α- Gal/AbA平板上，30℃倒置培養(yǎng)2～3 d，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.4 ?酵母雙雜交文庫篩選? 甘蔗cDNA文庫的構(gòu)建委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。采用共轉(zhuǎn)法對甘蔗cDNA文庫進(jìn)行篩選，將5 μg的pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒和15 μg的文庫質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞，具體操作參照Clontech公司的Yeastmaker Yeast Transformation System 2手冊進(jìn)行。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于SD/ -Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板上，30℃倒置培養(yǎng)3～5?d后，將平板上的藍(lán)色克隆轉(zhuǎn)移到SD/-Trp/- Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA平板上，重復(fù)3次。對3次轉(zhuǎn)板后仍正常生長的藍(lán)色陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取。利用pGADT7載體通用引物T7：TAATACGACTCACTATAGGGC和3￠ AD：AGAT GGTGCACGATGCACAG對提取的酵母質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。PCR程序：95℃ 5 min;95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min（35個循環(huán)）;72℃ 10 min。將經(jīng)PCR鑒定后的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于LB平板上（含100?μg/mL氨芐青霉素），37℃過夜培養(yǎng)后挑取PCR陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。使用NCBI的blastx功能對測序結(jié)果進(jìn)行分析，以獲得候選互作蛋白的相關(guān)信息。

結(jié)果與分析

2.1 ?SCSMV 基因擴增

利用特異性引物P1-R I-F和P1-H I-R對SCSMV 基因的編碼框進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得1074?bp左右的片段，片段大小與預(yù)測的目的基因大小一致（圖1），表明基因擴增成功。

誘餌質(zhì)粒構(gòu)建

利用R I和H I對SCSMV 基因擴增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，然后用T DNA連接酶將酶切的基因連接至pGBKT7載體，構(gòu)建pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒。對構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗證，結(jié)果顯示酶切得到與預(yù)期大小一致的基因片段（圖2）。誘餌質(zhì)粒測序結(jié)果也顯示插入的序列方向及編碼框完全正確，表明pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒構(gòu)建成功。

誘餌質(zhì)粒毒性及自激活檢測

將分別轉(zhuǎn)化了pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒和pGBKT7空質(zhì)粒的Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞涂布于SD/-Trp平板，結(jié)果顯示含有誘餌質(zhì)粒和空質(zhì)粒的酵母均可在平板上生長正常，且菌落數(shù)量大體相同，菌落大小均為2～3 mm。挑取平板上生長良好的單菌落接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20～24 h后含有誘餌質(zhì)粒和空質(zhì)粒的菌液值分別達(dá)到2.168和2.308，均超過0.8的判定標(biāo)準(zhǔn)。以上結(jié)果表明，pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒對Y2H Gold酵母菌株無毒性。

將含有pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒的Y2H Gold酵母菌株劃線于不同的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上，結(jié)果如圖3所示。含有誘餌質(zhì)粒的菌株與含有空質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒的菌株一樣，在SD/-Trp平板上正常生長，在SD/-Trp/X-α-Gal平板上長出白色菌落，在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA和SD/-Trp/-Leu/X-α- Gal/AbA平板上無菌落生長，而陽性對照在SD/ -Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/AbA和SD/-Trp/ -Leu/X-α-Gal/AbA平板上均長出藍(lán)色菌落。以上結(jié)果表明，pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒無自激活活性，可用于酵母雙雜交篩選。

的寄主互作蛋白篩選

用pGBKT7-P1誘餌質(zhì)粒對甘蔗cDNA文庫進(jìn)行篩選，經(jīng)SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板篩選1次及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA平板篩選3次后，成功獲得42個陽性酵母克隆。提取陽性酵母質(zhì)粒，使用pGADT7載體通用引物對T7/3' AD進(jìn)行PCR擴增，結(jié)果顯示，有3個酵母質(zhì)粒（15、34、41）未擴增出片段，2個酵母質(zhì)粒擴增出雙片段（37、40），其余酵母質(zhì)粒擴增出單一片段，擴增獲得的片段大小均在750 bp以上（圖4）。

將擴增出片段的酵母質(zhì)粒導(dǎo)入DH5α進(jìn)行擴大培養(yǎng)，分離插入片段，并挑取陽性克隆進(jìn)行測序分析。對于擴增出雙片段的酵母質(zhì)粒，每條擴增片段所對應(yīng)的陽性克隆均送去測序。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blastx比對分析，去除重復(fù)序列后，獲得13個候選互作蛋白，它們分別是：生長素應(yīng)答蛋白IAA1、IAA15，轉(zhuǎn)錄因子NAC、GATA4、OFP4，真核翻譯起始因子eIF5A，分子伴侶DnaJ，輔分子伴侶SBA1，重金屬相關(guān)異戊二烯化植物蛋白HIPP35，mec-8和unc-52蛋白同系物抑制子SMU2，外膜孔蛋白OEP24，及2個未表征蛋白（表1）。

討論

SCSMV引起甘蔗花葉病導(dǎo)致甘蔗產(chǎn)量減少和品質(zhì)下降，目前在多個甘蔗種植國家廣泛發(fā)生，對甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。SCSMV編碼的P1蛋白是RNA沉默抑制子，在SCSMV抵抗寄主的RNA沉默防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用，闡明其作用機制可為該病毒的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。鑒定與病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用機制的重要途徑。因此，為初步解析SCSMV P1抑制RNA沉默的作用機制，本研究采用酵母雙雜交技術(shù)篩選與SCSMV P1蛋白互作的寄主（甘蔗）蛋白，結(jié)果共獲得13個候選互作蛋白，包括IAA1、IAA15、NAC、GATA4、OFP4、eIF5A、DnaJ、SBA1、HIPP35、SMU2、OEP24、和2個未表征蛋白。

AUX/IAA（auxin/indole-3-acetic acid）是生長素早期應(yīng)答基因家族，是生長素信號傳導(dǎo)途徑的核心因子，生長素通過調(diào)節(jié)AUX/IAA蛋白水平進(jìn)而調(diào)控一系列響應(yīng)生長素的基因表達(dá)。AUX/IAA蛋白不僅參與植物生長發(fā)育過程，還在植物與病毒相互作用過程中發(fā)揮作用。水稻矮縮病毒（，RDV）編碼的P2蛋白與水稻AUX/IAA蛋白IAA10互作，通過抑制26S蛋白酶體介導(dǎo)的IAA10降解來干擾生長素信號傳導(dǎo)途徑，影響生長素應(yīng)答基因的表達(dá)，進(jìn)而增強病毒侵染力、促進(jìn)病情發(fā)展。在轉(zhuǎn)基因水稻中的研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)使水稻更容易受到RDV感染，而敲低則增強了水稻對RDV的抗性。煙草花葉病毒（， TMV）編碼的復(fù)制酶蛋白與擬南芥AUX/IAA蛋白IAA26互作，通過改變IAA26的亞細(xì)胞定位及生長素應(yīng)答基因的表達(dá)水平，來誘導(dǎo)植物產(chǎn)生特定病征。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選獲得2個與SCSMV P1蛋白互作的AUX/IAA蛋白，即IAA1和IAA15，這2個蛋白在篩庫得到的酵母質(zhì)粒中多次出現(xiàn)——在篩庫獲得的42個酵母質(zhì)粒中，有8個質(zhì)粒經(jīng)測序及blastx比對分析得到IAA1，有11個質(zhì)粒經(jīng)測序及blastx比對分析得到IAA15。推測SCSMV編碼的P1蛋白與甘蔗IAA1和IAA15互作，可能通過抑制IAA1和IAA15的降解和/或改變其亞細(xì)胞定位，繼而干擾生長素信號傳導(dǎo)途徑，影響生長素應(yīng)答基因的表達(dá)，從而抑制寄主的RNA沉默防御，增強病毒侵染力。

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其可激活植物體內(nèi)病程相關(guān)基因的表達(dá)從而調(diào)節(jié)植物的防御反應(yīng)。研究表明，病毒可通過靶向寄主的NAC轉(zhuǎn)錄因子來增強侵染性。TMV編碼的復(fù)制酶蛋白與寄主轉(zhuǎn)錄因子NAC互作，通過誘導(dǎo)NAC降解來抑制寄主病程相關(guān)基因的表達(dá)，從而幫助病毒建立系統(tǒng)侵染。番茄卷葉病毒（， TLCV）編碼的復(fù)制輔助蛋白REn與寄主轉(zhuǎn)錄因子NAC互作，并誘導(dǎo)NAC在感染細(xì)胞中特異性表達(dá)，從而增強病毒DNA的復(fù)制。水稻突變體由于 插入破壞了其轉(zhuǎn)錄因子NAC的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致RDV在突變體中的積累量顯著下降，表明NAC對RDV在水稻體內(nèi)的增殖是必需的。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選獲得1個與SCSMV P1蛋白互作的甘蔗NAC轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子在篩庫得到的酵母質(zhì)粒中屢次出現(xiàn)——篩庫獲得的42個酵母質(zhì)粒中有4個質(zhì)粒經(jīng)測序及blastx比對分析得到NAC。表明SCSMV P1可能通過與寄主轉(zhuǎn)錄因子NAC互作，通過NAC來影響寄主病程相關(guān)基因的表達(dá)從而抑制寄主的RNA沉默防御，增強病毒侵染力。除了NAC外，本研究還篩選到2個與SCSMV P1互作的寄主轉(zhuǎn)錄因子（GATA4和OFP4），暗示P1可能通過與多個寄主轉(zhuǎn)錄因子互作，通過轉(zhuǎn)錄因子來影響寄主防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)從而實現(xiàn)其RNA沉默抑制子的功能。

eIF5A是普遍存在于植物、動物、真菌等真核生物體內(nèi)的翻譯因子，在蛋白質(zhì)翻譯過程的延伸階段和終止階段具有普遍的促進(jìn)作用。本研究顯示，SCSMV編碼的P1蛋白與甘蔗eIF5A互作，推測其可能通過eIF5A調(diào)控RNA沉默相關(guān)蛋白的翻譯進(jìn)而抑制寄主的RNA沉默。分子伴侶是一類普遍存在于生物體內(nèi)的保守蛋白質(zhì)家族，能協(xié)助蛋白質(zhì)的正確折疊、組裝、轉(zhuǎn)運乃至降解，對蛋白功能的發(fā)揮具有重要意義。輔分子伴侶是一類與分子伴侶結(jié)合并調(diào)節(jié)其功能的蛋白。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選到1個與SCSMV P1蛋白互作的甘蔗分子伴侶（DnaJ）及1個輔分子伴侶（SBA1），暗示P1可能通過作用于寄主的分子伴侶和輔分子伴侶來干擾RNA沉默相關(guān)蛋白的正確折疊、組裝、轉(zhuǎn)運或降解，進(jìn)而抑制寄主的RNA沉默。金屬離子在生物體內(nèi)扮演著非常重要的角色，生物體內(nèi)將近一半的蛋白質(zhì)需要金屬離子，金屬離子是這些蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)成分或催化因子。HIPP是植物中負(fù)責(zé)金屬離子轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵蛋白之一，對植物體內(nèi)金屬相關(guān)蛋白功能的發(fā)揮具有重要意義。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選到1個與SCSMV P1蛋白互作的甘蔗HIPP蛋白（HIPP35），推測P1可能通過結(jié)合寄主HIPP35來影響寄主金屬相關(guān)蛋白的功能，從而抑制寄主的RNA沉默。此外，本研究利用酵母雙雜交技術(shù)還篩選到與SCSMV P1蛋白互作的甘蔗蛋白SMU2、OEP24，及2個未表征蛋白，P1亦可能通過與這些蛋白互作來發(fā)揮其RNA沉默抑制子的功能。

本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選到13個可能與SCSMV P1蛋白互作的寄主甘蔗蛋白，基于這些蛋白的功能，推測P1可能通過與寄主蛋白IAA1、IAA15、NAC、GATA4和/或OFP4互作來調(diào)控寄主防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，和/或通過與寄主蛋白eIF5A、DnaJ、SBA1和/或HIPP35互作來影響寄主RNA沉默相關(guān)蛋白的合成、加工或轉(zhuǎn)運，從而發(fā)揮其RNA沉默抑制子的功能。研究結(jié)果為后續(xù)深入解析P1抑制RNA沉默的作用機制奠定了重要基礎(chǔ)。但本研究僅通過酵母雙雜交技術(shù)研究蛋白互作關(guān)系，由于酵母結(jié)構(gòu)簡單，其蛋白質(zhì)的加工和修飾與甘蔗可能存在差異，因此酵母雙雜交的結(jié)果僅是提示蛋白質(zhì)相互作用的可能性，后續(xù)還需要進(jìn)行雙分子熒光互補、免疫共沉淀、GST pull-down等試驗驗證蛋白的互作關(guān)系。SCSMV編碼的P1蛋白與寄主蛋白如何互作？P1如何通過與寄主蛋白互作來發(fā)揮其抑制RNA沉默的功能？這些問題有待進(jìn)一步研究。

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