STE20L4促進(jìn)擬南芥下胚軸伸長的機(jī)制研究

佘玉婷　丁勇

摘? 要：下胚軸伸長是高等植物進(jìn)行正常生命活動的保障，下胚軸的伸長協(xié)助植株破土而出并由異養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)生長。本研究通過對一系列擬南芥突變體材料進(jìn)行下胚軸觀察，鑒定到一個具有短下胚軸的突變體，并對其調(diào)控下胚軸伸長的分子機(jī)制進(jìn)行初步探索。結(jié)果表明：編碼與酵母中同源的絲裂原活化蛋白激酶，在MAPK級聯(lián)信號通路中作為MAP4K激活下游的MAP3K?；蛐丸b定和半定量結(jié)果顯示，、均為功能缺失的突變體。通過表型觀察，突變體無論在長日照（16 h光照/8 h黑暗）、短日照（8 h光照/16 h黑暗）及黑暗（24?h黑暗）條件下與野生型相比均呈現(xiàn)出短的下胚軸。細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示，突變體短的下胚軸是由于其細(xì)胞長度的變短而不是細(xì)胞數(shù)目的變化導(dǎo)致的。植物激素赤霉素可促進(jìn)下胚軸的伸長，對其處理的敏感性可作為是否參與GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的判斷方法。在不同梯度濃度的GA處理（0、0.5、1、2、5 μmol/L）下，突變體與野生型相比下胚軸伸長作用不明顯。多效唑（PAC）是內(nèi)源GA合成的抑制劑，隨著不同梯度濃度的PAC處理（0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μmol/L），突變體下胚軸伸長的抑制作用相對于野生型不明顯。上述生理學(xué)結(jié)果表明，參與到GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中調(diào)控擬南芥下胚軸的生長發(fā)育。將STE20L4蛋白與熒光標(biāo)簽融合后轉(zhuǎn)染煙草或擬南芥原生質(zhì)體觀察其亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明STE20L4在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。對野生型、突變體中進(jìn)行一系列GA下游與下胚軸伸長相關(guān)基因的RT-qPCR檢測，結(jié)果表明、、、、和基因的轉(zhuǎn)錄水平在突變體中明顯下調(diào)，即可能通過間接調(diào)控這些下游基因的表達(dá)參與下胚軸的伸長。綜上，參與GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且通過促進(jìn)GA下游下胚軸伸長相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控下胚軸的伸長。本研究初步闡述了調(diào)控植物下胚軸伸長的分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究MAPK與GA互作調(diào)控植物生長發(fā)育提供參考。

關(guān)鍵詞：;下胚軸;GA;PAC;細(xì)胞長度中圖分類號：S565.9 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Mechanism Study ofin Promoting Hypocotyl Elongation of

SHE Yuting DING Yong

School of Life Sciences， University of Science and Technology of China， Hefei， Anhui 230027， China

Hypocotyl elongation assists plants to break through the soil and changes from heterotrophic to self-sustaining， which is the guarantee of normal life activities of higher plants. In this study， a mutant with shorter hypocotyl was identified by observing the hypocotyl of a series of mutants in our laboratory and the molecular mechanism of regulating hypocotyl elongation was preliminarily explored. ， as a MAP4K， encodes a mitosis-activated protein kinase homologous to in yeast and activates downstream MAP3K in the MAPK cascade signaling pathway. Genotyping identification and semi-quantitative results showed that and were mutants with loss of function. Through phenotype observation， the mutant shows a short hypocotyl either in long daylight （16?h light/8?h dark）， short daylight （8?h light/16?h dark） and dark （24?h dark） conditions compared with the wild type. Cytological results showed that short hypocotyl of mutants were due to a shortening of cell length rather than a change in cell number. The plant hormone gibberellin can promote the elongation of the hypocotyl and the sensitivity to its treatment can be used as a method of judging whether to participate in the GA signal transduction pathway. Under different gradient concentrations GA （0， 0.5?μmol/L， 1?μmol/L， 2?μmol/L and 5?μmol/L） treatment， the hypocotyl elongation of mutants were not significant compared with the wild type. Paclobutrazol （PAC） is an inhibitor of endogenous GA synthesis， with gradient concentrations PAC （0， 0.01 μmol/L， 0.02 μmol/L， 0.05 μmol/L， 0.1 μmol/L， 0.2 μmol/L， and 0.5 μmol/L） processing ， the inhibition of hypocotyl elongation in mutants were also less pronounced than wild type. The above physiological results show that is involved in regulating the growth and development of hypocotyl in the GA signal transduction pathway. After fusing the protein of STE20L4 with fluorescent tags， we transfected them into tobacco and protoplasts to observe subcellular localization， the results showed that STE20L4 was expressed in both cell membranes and cytoplasm. A series of RT-qPCR of GA downstream genes associated with hypocotyl elongation were tested in the wild-type and mutants. The results showed that the transcriptional levels of ， ， ， ， and genes were significantly downregulated in the mutant， suggesting may participate in hypocotyl elongation by indirectly regulating the expression of these downstream genes. In summary， participates in the GA signal transduction pathway and regulates hypocotyl elongation by promoting the expression of hypocotyl elongation-related genes downstream of the GA. Our study preliminarily elaborated the molecular mechanism of regulating plant hypocotyl elongation， which provides a reference for further study of the interaction between MAPK and GA to regulate plant growth and development.

; hypocotyl; GA; PAC; cell length

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.006

植物的整個生活史包括胚胎形成、種子萌發(fā)、下胚軸伸長，營養(yǎng)生長、生殖生長、果實成熟及衰老等過程。下胚軸是連接子葉和根的胚性部分，保證水分、無機(jī)鹽、營養(yǎng)物質(zhì)和激素等物質(zhì)的順利運輸。下胚軸伸長是長期自然選擇的結(jié)果，其伸長協(xié)助了幼苗出土這一過程，同時也是植物進(jìn)行光合作用、實現(xiàn)自養(yǎng)的必要前提，但下胚軸過度伸長容易造成幼苗徒長，抗逆性能力差，不利于產(chǎn)量提高和品質(zhì)改良。因此，合適的下胚軸伸長是植物進(jìn)行正常生命活動的保障。

下胚軸的伸長受環(huán)境因子和多種內(nèi)源激素的綜合調(diào)控。其中，光強(qiáng)與光質(zhì)調(diào)控下胚軸細(xì)胞伸長的機(jī)制類似，主要是通過光受體PHYA、PHYB、CRY1和CRY2調(diào)控PIFs，進(jìn)而影響下游基因的表達(dá)，從而實現(xiàn)對下胚軸伸長的調(diào)控。溫度調(diào)控機(jī)制也主要依賴于PHYB，高溫促使細(xì)胞核中的PHYB由Pfr（生理活躍型）向Pr（生理失活型）轉(zhuǎn)變，并向細(xì)胞質(zhì)中遷移，從而解除其對PIFs及COP1-SPA的抑制作用，誘導(dǎo)下胚軸細(xì)胞伸長。植物激素如赤霉素、生長素、獨腳金內(nèi)酯等均參與調(diào)控下胚軸伸長的過程。赤霉素（GA）主要通過調(diào)控DELLA蛋白含量影響下胚軸細(xì)胞的伸長。生長素（IAA）通過與TIR1結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)AUX/IAAs蛋白結(jié)合到SCF-Auxin復(fù)合體中泛素化降解，解除其對ARF的轉(zhuǎn)錄抑制作用從而影響下胚軸細(xì)胞的伸長。獨腳金內(nèi)酯（SLs）通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白MAX2促使光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵因子表達(dá)上調(diào)，HY5蛋白積累能促使植物光形態(tài)建成，抑制下胚軸伸長。

自20世紀(jì)60年代起，“綠色革命”中半矮化育種的大規(guī)模推廣大幅度地提高了世界主要糧食作物的產(chǎn)量。水稻和小麥的“綠色革命”均與赤霉素密切相關(guān)。赤霉素是一類雙萜類化合物的植物激素，在植物整個生命周期中均起著重要作用，在種子萌發(fā)、葉片伸展、莖和根的伸長、花和果實的發(fā)育等方面均起到了重要的調(diào)控作用。GA主要通過細(xì)胞伸長的方式促進(jìn)下胚軸的生長。DELLA蛋白是GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵作用元件，能與一類bHLH類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄激活作用受到阻遏，從而抑制光形態(tài)建成。植株在缺失GA的情況下，DELLA蛋白會累積到較高水平，抑制轉(zhuǎn)錄因子活性，從而抑制GA調(diào)節(jié)的下游基因表達(dá);在受到GA誘導(dǎo)的情況下，GA與受體GID1結(jié)合，促進(jìn)GID1與DELLA蛋白結(jié)合，導(dǎo)致DELLA蛋白與SCF復(fù)合體相互作用繼而被泛素化，最終通過26S蛋白酶體途徑降解，解除其對下游轉(zhuǎn)錄因子活性的抑制作用。

MAPK通路在動物中已經(jīng)被研究證明是多種信號通路的中心，可用來接收胞外的信號并將其傳遞給胞內(nèi)，并最終被帶入細(xì)胞核中。經(jīng)典的MAPK信號通路通過MAP3K、MAP2K、MAPK的級聯(lián)磷酸化的過程逐級激活和傳遞信號。MPK3/MPK6是擬南芥MAPK核心成員，在調(diào)控植物生長發(fā)育及對生物和非生物脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。然而關(guān)于MAPK信號更為上游的MAP4K家族的研究報道很少，擬南芥中共有10個MAP4Ks，其功能直到2013年才有研究報道。本研究選取表型較為明顯的MAP4K4作為研究對象，作為酵母中的的同源基因，已有研究表明STE20可將酵母的組蛋白H2BS10磷酸化，最終影響酵母的細(xì)胞周期。為了研究方便，將其命名為STE20-Like-4（）。近年來，有研究表明能夠參與免疫調(diào)節(jié)，通過磷酸化PP2C38從而激活BIK1，協(xié)同SIK1共同調(diào)節(jié)flg22誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。另一研究表明，通過參與到油菜素內(nèi)酯信號途徑調(diào)控擬南芥熱形態(tài)建成。因此，本研究將進(jìn)一步探索是否可以整合其他植物激素調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育過程。

本研究發(fā)現(xiàn)功能缺失的突變體表現(xiàn)出短的下胚軸，對GA和PAC的處理不敏感，表明其參與GA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。STE20L4定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，并通過下游細(xì)胞伸長相關(guān)基因調(diào)節(jié)細(xì)胞伸長和下胚軸的伸長。綜合運用遺傳分子細(xì)胞等手段闡述了和赤霉素信號協(xié)同參與細(xì)胞伸長過程，豐富了植物生長發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

材料與方法

? 材料

（Salk_086087）和（Salk_ 065417）突變體訂購于美國ABRC（Biological Resource Center）突變體庫，擬南芥（L）于22℃中，光周期為16 h光照/8 h黑暗的溫室培養(yǎng)。

方法

1.2.1? 下胚軸長度測量? 將供試材料種子無菌處理后均勻地點在1/2?MS培養(yǎng)基上，4℃吸水2～3?d，按照所需要的擬南芥生長環(huán)境培養(yǎng)一周左右（注意光照不宜過強(qiáng)），用鑷子將下胚軸按倒在培養(yǎng)皿上，用萊卡m165c體視鏡測量每一個下胚軸的長度，萊卡體視鏡配套軟件中直接有距離尺軟件，統(tǒng)計下胚軸長度。

1.2.2? GA與PAC敏感性處理? 在1/2 MS培養(yǎng)基上設(shè)置不同的GA濃度梯度（0、0.5、1、2、5?μmol/L）與PAC濃度梯度（0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5?μmol/L），將所需要處理的突變體和對照組均勻地點在培養(yǎng)基上，4℃吸水2～3?d，按照所需要的擬南芥生長環(huán)境培養(yǎng)一周左右（注意光照不宜過強(qiáng)），再用萊卡m165c體視鏡統(tǒng)計下胚軸長度。

1.2.3? 蛋白定位? 原生質(zhì)體：將STE20L4蛋白的CDS序列構(gòu)建到PUC19-eGFP載體中，提取較高純度的質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體中，黑暗培養(yǎng)10～12 h，在共聚焦顯微鏡（ZEISS Xradia 880）下觀察定位。

煙草：將STE20L4蛋白的CDS構(gòu)建至1300-eGFP載體上，瞬轉(zhuǎn)煙草常溫避光保溫36～ 48?h。撕取注射菌液的煙草下表皮細(xì)胞于激光共聚焦顯微鏡下觀察相應(yīng)熒光的定位。

1.2.4? 基因型鑒定? 根據(jù)T-DNA插入選用的不同載體設(shè)計中間引物（SALK系列中間引物BP為LBb1.3），然后通過T-DNA Primer Design網(wǎng)站查詢插入位點的上游引物L(fēng)P和下游引物RP（表1）。以提取的基因組作為模板，使用上游引物、中間引物和下游引物進(jìn)行PCR鑒定。

野生型（未插入）只能得到1條約1100 bp的條帶，純合突變體也只能得到1條約500～ 800?bp的條帶。PCR反應(yīng)體系：總體系為20?μL，其中模板1?μL，10×Easytaq buffer 2 μL，Easytaq酶0.2 μL，上下游引物各0.4 μL，10?mmol/L dNTPs 0.4 μL，ddHO 15.6?μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1～2 kb/min，共34個循環(huán);最后72℃充分延伸8?min。

1.2.5? RNA提取、半定量及Q-PCR分析? RNA提?。喝∩L一周左右的野生型和突變體材料約0.1?g，采用Trizol（TransGen Bio-tech）試劑提取植物葉片總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

半定量檢測：參照PCR程序分別擴(kuò)增內(nèi)參基因（TUBLIN）和待檢測靶基因，不斷調(diào)整模板的比例，使得內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物亮度基本一致，再以等比例的DNA模板，選取適當(dāng)?shù)腜CR擴(kuò)增圈數(shù)比較野生型與突變體靶基因擴(kuò)增的亮度。

Q-PCR分析：采用SYBR superMix試劑盒（TransGen Bio-tech），在定量PCR儀（Bio-Rad）上擴(kuò)增，以UBQ10為內(nèi)參，并通過2法計算相對表達(dá)量。Q-PCR反應(yīng)體系：總體系為20?μL，其中cDNA 3?μL，2×Q-PCR mix 10 μL，上下游引物各0.2?μL，ddHO 6.6?μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)

變性3 min;95℃變性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán);融解曲線：95℃（預(yù)變性）10 s，65℃（退火溫度）5 s，下個循環(huán)預(yù)變性溫度不變，退火溫度依次+1℃，共31個循環(huán)，反應(yīng)終止。

結(jié)果與分析

2.1? 突變體獲得及表型觀察

為了研究STE20L4蛋白的功能，本研究獲得2個T-DNA插入的突變體和，基因的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1A，突變體插入在基因第2位外顯子上，突變體插入在基因第8位外顯子上?；蛐头治鼋Y(jié)果可看出，和均是T-DNA插入的純合突變體（圖1B）。半定量檢測轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果也顯示，和均為功能缺失突變體（圖1C）。在長日照（16?h光照，8?h黑暗）下通過表型觀察，突變體與野生型相比開花上沒有明顯表型，但整體植株較?。▓D1D～圖1E）。將Col-0、和在1/2 MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7?d，觀察下胚軸表型，統(tǒng)計樣本超過40株。由圖2可知，在短日照、長日照及黑暗條件下，突變體均明顯表現(xiàn)出短下胚軸表型，這表明可能參與到赤霉素調(diào)控途徑中。

2.2? 參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

本研究檢測了野生型和突變體的下胚軸細(xì)胞長度和細(xì)胞數(shù)目。Col-0、和下胚軸在長日照條件下生長7?d后，用PI（碘化丙啶）染色，激光共聚焦顯微鏡掃描細(xì)胞長度。結(jié)果表明，與野生型下胚軸細(xì)胞相比，突變體的下胚軸長度明顯變短，而統(tǒng)計的下胚軸細(xì)胞個數(shù)無明顯差異（圖3A～圖3C），說明突變體的短下胚軸表型是由細(xì)胞長度變短導(dǎo)致。赤霉素可促進(jìn)植物下胚軸的伸長，用梯度濃度的GA（0、0.5、1、2、5?μmol/L）處理野生型、突變體和三突變體（三突為GA/PAC不敏感的正對照），以Col-0對GA的敏感程度當(dāng)作100%，各突變體對GA的敏感程度均相較于野生型不明顯。由圖4A～圖4B可知，隨著GA濃度的升高，野生型的下胚軸長度明顯伸長，而、與的下胚軸長度增長幅度明顯變小，表現(xiàn)出對外源GA處理不敏感的表型。為進(jìn)一步驗證此結(jié)論，本研究使用不同濃度的內(nèi)源GA合成抑制劑PAC（0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μmol/L）處理Col-0、、和。同樣，以Col-0對PAC的敏感程度當(dāng)作100%，各突變體對PAC的敏感程度均相較于野生型不明顯。由圖4C～圖4D結(jié)果顯示，野生型下胚軸隨著PAC濃度升高明顯變短，而、與的下胚軸變短的幅度小。由此確定參與到GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，并調(diào)控擬南芥下胚軸的生長發(fā)育。

的定位觀察

本研究將STE20L4與GFP標(biāo)簽融合，瞬時轉(zhuǎn)染煙草。綠色熒光信號顯示，STE20L4蛋白主要定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中（圖5A）。同時，將STE20L4與GFP和tagRFP標(biāo)簽融合，分別轉(zhuǎn)染擬南芥原生質(zhì)體。熒光觀察發(fā)現(xiàn)，無論是融合綠色的熒光標(biāo)簽還是紅色熒光標(biāo)簽，STE20L4蛋白均定位于細(xì)胞膜上（圖5B），這與JIANG等的研究結(jié)果一致。這表明正常情況下STE20L4不在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮功能。

2.4? 促進(jìn)下胚軸伸長相關(guān)基因的表達(dá)

本研究檢測了很多與細(xì)胞伸長相關(guān)的下游基因，看其是否受STE20L4的調(diào)控。取生長約一周大小的野生型和突變體材料，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用RT-QPCR檢測GA下游基因的表達(dá)，結(jié)果顯示很多基因如、、、、、在突變體中下調(diào)表達(dá)（圖6）。這一結(jié)果與相應(yīng)的下胚軸表型一致，表明可有效激活細(xì)胞伸長相關(guān)基因的表達(dá)，并參與到GA信號通路中促進(jìn)下胚軸的伸長。

?討論

研究植物下胚軸伸長的調(diào)控機(jī)制，有助于深入了解植物生長發(fā)育規(guī)律和提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)益。MAP激酶途徑介導(dǎo)對各種刺激的反應(yīng)，包括有絲分裂原和不同類型的應(yīng)激。雖然我們對植物MAP4Ks的了解在逐漸增加，但對它們的功能及其調(diào)控機(jī)制仍鮮有報道。JIANG等曾報道（）參與植物的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答從而抵抗病原菌的侵染。最近的報道還發(fā)現(xiàn)在溫暖溫度下影響油菜素內(nèi)酯（BR）介導(dǎo)的下胚軸伸長。本研究則顯示突變體在擬南芥正常生長溫度（22℃）下也表現(xiàn)為較短的下胚軸表型，并且這一表型不受光周期途徑的變化而變化，同時發(fā)現(xiàn)可參與到GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中調(diào)控擬南芥下胚軸細(xì)胞的伸長過程。DELLA蛋白可整合多種植物激素來調(diào)控PIFs從而調(diào)控下胚軸的伸長，那么既參與BR信號通路又參與到GA信號通路中，是否介導(dǎo)多種植物激素之間的crosstalk從而調(diào)控植物的生長發(fā)育過程，還需要更多強(qiáng)有力的實驗來證實。經(jīng)典的GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是通過調(diào)控核定位蛋白DELLA的降解從而調(diào)控植物的生長，而STE20L4主要定位于細(xì)胞膜中，是否存在某種信號或與某個蛋白的相互作用，使其定位發(fā)生動態(tài)變化進(jìn)而與DELLA蛋白產(chǎn)生關(guān)聯(lián)，還需進(jìn)一步的探究。此外，雖然參與GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路且突變體中下胚軸伸長相關(guān)基因下調(diào)，但并不能說明僅通過GA依賴的方式調(diào)控下胚軸的伸長，不排除直接調(diào)控下游基因的可能性，下一步將從遺傳學(xué)上判斷其上下游關(guān)系，而這些基因的啟動子是否可被直接靶向結(jié)合等更為精細(xì)的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

目前盡管已在植物激素調(diào)節(jié)擬南芥生長發(fā)育過程方面取得了巨大進(jìn)展，但關(guān)于植物激素如何協(xié)同蛋白激酶共同調(diào)控單子葉植物下胚軸伸長的模式研究仍處于起步階段。因此，有必要進(jìn)行更深入的研究來揭示和闡明絲裂原活化蛋白激酶與不同植物激素的局部合成、感知、轉(zhuǎn)運及其串?dāng)_對擬南芥生長發(fā)育的調(diào)控作用。而擬南芥中已取得的成果可作為今后研究的鋪墊，有助于增強(qiáng)作物的適應(yīng)性反應(yīng)及提高作物產(chǎn)量。

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