油棕甾醇合成關(guān)鍵酶基因DWF5的克隆及表達分析

張為圣　劉智超　曹紅星　顏彥　陳萍　李睿

摘? 要：（）基因，編碼7-脫氫膽固醇還原酶（7-dehydrocholesterol reductase），是甾醇合成的關(guān)鍵酶，通過調(diào)控甾醇的合成參與植物油體（oil bodies，OBS）的形成。為了探究基因?qū)τ妥毓庵杏腕w發(fā)育的影響，以‘熱油4號’為材料，提取油棕果肉的RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行基因的全長克隆，獲得2個基因并分別命名為和。運用生物信息學的方法對其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點和親緣關(guān)系等進行分析預測，利用實時熒光定量PCR對其在油棕的根、莖、葉、花及花后不同時期的果實進行表達水平分析。結(jié)果表明：和基因編碼的氨基酸數(shù)量分別為434個和374個，相對分子質(zhì)量為49.71 kDa和42.68 kDa，等電點為8.61和8.69，其蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為38.60和38.13，脂肪族指數(shù)為98.80和96.68，總平均親水性為0.347和0.313，均具有疏水性。與水稻和玉米親緣關(guān)系最近，與其他物種關(guān)系較遠。qRT-PCR分析表明，基因在油棕的各個器官均有表達，其中基因在果肉中高表達，顯著高于根、葉、花等部位，其表達趨勢為花后12～18周升高，至20周時達到最高后表達量逐漸降低，這與油棕果肉中油體的發(fā)育趨勢基本一致?；蛟诟颓o中高表達而在果肉中表達量低，其果肉中表達趨勢為花后12～18周逐漸降低。因此，推測參與調(diào)控油棕的油體發(fā)育，未參與該調(diào)控而可能在油棕的生長發(fā)育中發(fā)揮功能。本研究為進一步探索基因調(diào)控油棕中油體的形成機制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：油體;;生物信息學;基因表達中圖分類號：S565.9 ?????文獻標識碼：A

Cloning and Expression Analysis of Genes Involved in the Sterol Synthesis in Oil Palm

ZHANG Weisheng LIU Zhichao CAO Hongxing YAN Yan CHEN Ping LI Rui

1. College of Horticulture， Hainan University / Key Laboratory for Quality Regulation of Tropical Horticultural Crops of Hainan Province， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Key Laboratory of Tropical Oil Crops Biology， Wenchang， Hainan 571339， China; 3. Sanya Nanfan Research Institute， Hainan University， Sanya， Hainan 572025， China; 4. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

（） encodes 7-dehydrocholesterol reductase， which is a key enzyme in the synthesis of sterols and participates in the formation of plant oil bodies （OBS） by regulating the synthesis pathway of sterols. The cultivar， ‘Reyou No. 4’， was taken as the experimental material to explore the effects of gene on the development of OBS in the mesocarp of oil palm. After extracting RNA from mesocarp， the reverse transcription cDNA was used as a template to conduct full-length cloning of genes. Two genes obtained were named and . The bioinformatics method was applied to analyze and predict physicochemical properties， structural characteristics， and genetic relationship， etc.. The expression levels of the genes in roots， stems， leaves， flowers， and fruits at different stages after flowering were analyzed by quantitative real-time PCR. The results showed that the number of amino acids encoded by the gene was 434 and 374， respectively， the relative molecular masse was 49.71 kDa and 42.68 kDa， the isoelectric points was 8.61 and 8.69， the protein instability indexes was 38.60 and 38.13， and the aliphatic index was 98.80 and 96.68. The gravy was 0.347 and 0.313. Both proteins were hydrophobic. has the most closed genetic relationship with rice and maize， but less related to other species. The qRT-PCR analysis showed that the two genes were expressed in all organs of oil palm， among which was highly expressed in mesocarp， which was significantly higher than that in roots， leaves， flowers and other parts. The expression trend of gene increased from 12 to 18 weeks after flowering and reached the peak at 20 weeks after flowering， and then gradually decreased， which was consistent with the synthesis trend of the OBS in the oil palm mesocarp. gene was highly expressed in roots and stems， but the expression level of it was low in mesocarp， and its expression trend in mesocarp gradually decreased from 12 to 18 weeks after flowering. Therefore， it is speculated that is involved in the regulation of development of OBS in oil palm， while is not involved in this regulation and may play a role in the growth and development of oil palm. This study would lay a foundation for further exploring the mechanism of regulating OBS formation in oil palm.

oil bodies; ; bioinformatics; gene expression

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.001

油體（oil bodies，OBS），又稱為脂肪體（lipid bodies），或者脂肪滴（lipid droplets，LDS），是植物體內(nèi)主要進行能量儲存和脂質(zhì)代謝的細胞器，由三酰甘油（TGs）和甾醇酯等組成，為多數(shù)真核植物所有。除甾醇和三酰甘油之外，油體中還含有多種生物活性成分，如異黃酮、生育酚和各類小蛋白，這些成分同樣參與油體的形成，維持和穩(wěn)定油體的大小和數(shù)量。油體被認為是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）磷脂雙分子層中間的中性脂質(zhì)積累而成。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的中性脂質(zhì)與其膜結(jié)合后進入細胞質(zhì)，最終由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的單磷脂分子層環(huán)繞而成為油體。其中甾醇通過調(diào)節(jié)膜的流動性和滲透性，以及在轉(zhuǎn)錄水平和信號轉(zhuǎn)導途徑中參與油體的形成。

油體中的甾醇是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中由異戊二烯通過甲戊酸途徑合成，該過程涉及到的酶促反應包括甲基化、去甲基化、還原、異構(gòu)化等。有12種酶參與代謝途徑，包括甾醇C24甲基轉(zhuǎn)移酶1、甾醇甲基氧化酶2、7-脫氫膽固醇還原酶和甾醇C22去飽和酶等。DWF基因家族的許多成員均參與了甾醇的合成，如和參與谷甾醇和蕓苔甾醇的合成，、和參與油菜素內(nèi)酯的合成，參與油菜烷醇的合成調(diào)控。其中基因調(diào)控的7-脫氫膽固醇還原酶能將5-脫氫膽固醇催化為亞甲基膽固醇，也能將5-脫氫燕麥甾醇催化為異巖藻甾醇，二者均是甾醇合成中的關(guān)鍵限速步驟。常見的油料作物如花生和油菜中含有2個基因，芝麻和大豆中含有1個基因，而其他作物如擬南芥、煙草、葡萄、番茄等中均發(fā)現(xiàn)基因。最近的研究表明，基因通過調(diào)控甾醇的合成能夠參與植物中油體的發(fā)育。擬南芥突變體與野生型相比，組織中磷脂和總游離甾醇含量的減少使葉片中油體含量嚴重下降。煙草LAB1-4突變體與野生型相比，愈傷組織中甾醇含量的升高使組織中油體含量增多。油菜中植物的含油量與總甾醇呈顯著正相關(guān)。這些結(jié)果表明了甾醇的含量對植物中油體的積累有著重要的作用。

油棕（Jacq）是世界上產(chǎn)油率最高的油料作物，其棕櫚油被廣泛應用于食品、化妝品、工業(yè)等領(lǐng)域，現(xiàn)已成為世界上生產(chǎn)量和貿(mào)易量最大的植物油。油棕的果肉中含有豐富的棕櫚油，果肉細胞中發(fā)達的油體與甾醇的積累密切相關(guān)，但對其調(diào)控油棕油體發(fā)育的相關(guān)基因鮮見報道。本研究從油棕中克隆了2個的同源基因和，對其理化性質(zhì)、序列特征和進化關(guān)系進行分析，同時采用熒光定量PCR對其在油棕果實發(fā)育中的表達特征進行分析，為后續(xù)研究的生物學功能和利用該基因?qū)τ妥亻_展遺傳改良工作奠定基礎(chǔ)。

? 材料與方法

?材料

試驗材料來源于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所（海南省文昌市）基地（19°33′N，110°47′E），采集8年生的‘熱油4號’油棕新品種的根、莖尖、葉、花，并取開花后生長12、14、16、18、20、22周果實。其中根和莖等材料收集后立即置于液氮中速凍，果實在收集時將果肉和果仁分開后速凍，于–80℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

?方法

1.2.1 ?基因的挖掘和生物信息學分析 ?從擬南芥基因數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org/）中查找擬南芥AtDWF5（AT1G50430）的氨基酸序列。油棕基因組數(shù)據(jù)庫中采用BLASTP進行比對分析獲得與高度同源的候選基因，利用Batch Web CD-search Tool進行該基因的保守結(jié)構(gòu)域分析。引物設計采用NCBI官網(wǎng)上的Primer-Blast在線工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/）進行分析。以油棕的果肉cDNA為模板，利用設計的引物進行PCR擴增，獲得目的基因后純化并連接至PMD18-T載體中，通過熱激法轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆并送至公司測序。油棕DWF5的蛋白質(zhì)分子量和等電點等理化性質(zhì)均采用在線工具ExPASy（http：// www.expasy.org）進行分析。采用ClustalX對油棕、擬南芥、煙草和番茄的DWF5蛋白質(zhì)序列進行多重比對，系統(tǒng)進化樹采用MEGA 6.0的Neighbor-joining法進行構(gòu)建，bootstrap的校驗值設置為1000。

1.2.2 ?RNA的提取和基因表達分析? 使用北京天根公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒提取油棕的根、莖、葉、花和果肉等器官的RNA，通過北京全式金生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA。實時熒光定量PCR采用SYBR Select Master Mix進行分析，作為內(nèi)參基因，反應體系及操作步驟參照該試劑盒操作說明書進行，引物見表1，基因相對表達量采用2法進行計算。

?數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件進行原始數(shù)據(jù)的計算和處理，利用SPSS 25.0軟件作為統(tǒng)計分析工具，利用GraphPad Prism 8.0軟件制圖。采用Duncan’s檢驗法進行油棕基因表達的差異顯著性分析。

結(jié)果與分析

2.1? 的克隆及基本信息分析

以油棕果肉cDNA為模板，進行油棕基因全長克隆，獲得2條單一條帶，長度在1600 bp

左右，將其分別命名為、（圖1）。測序結(jié)果顯示，條帶長度為1621 bp，編碼的氨基酸為434個，條帶長度為1577 bp，編碼氨基酸374個;其相對分子質(zhì)量分別為49.71 kDa和42.68 kDa;等電點分別為8.61和8.69;的蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為38.60，的蛋白不穩(wěn)定指數(shù)是38.13，二者均為不穩(wěn)定蛋白;脂肪族系數(shù)分別為98.80和96.68;總平均親水性為0.347和0.313，均為正值，呈疏水性;定位在Chr8上，定位在Chr7上（表2）。EgDWF5-1中的氨基酸含量最多的是Leu（L）和Val（V），占比分別為10.8%和7.8%。EgDWF5-2中的氨基酸含量最多的是Leu（L）和Val（V），占比分別為10.4%和8.6%。

2.2? 的序列比對及進化分析

將油棕、擬南芥、煙草和番茄的DWF5氨基酸序列進行多重比對分析。結(jié)果表明，4個物種中氨基酸序列有很高的同一性（圖2）。采用MEGA 6.0的Neighbor-joining法將EgDWF5的氨基酸序列與煙草、擬南芥、番茄、葡萄、水稻、玉米的DWF5序列進行進化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2個EgDWF5聚類在一個分支上，并與水稻和玉米的DWF5聚類到一個大分支上，說明油棕的DWF5與水稻和玉米親緣關(guān)系較近，與其他物種關(guān)系較遠（圖3）。

2.3? 的表達特征分析

采用實時熒光定量PCR對2個基因在油棕的根、莖、葉、花和花后各個時期生長的果仁和果肉進行基因表達特征分析。結(jié)果表明，在油棕果肉中基因表達量顯著高于根、葉、花部位?；虻谋磉_量在油棕的果實發(fā)育過程中表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，其中，在果仁中，隨著生長逐漸升高，并在18周達到最大值，隨后緩慢下降;在果肉中，隨著果肉生長至20周時達到最大值，隨后降低。在果實中，基因在果肉的表達量顯著高于果仁。在油棕果肉中低表達，其表達量顯著低于根、莖和花，其表達趨勢在12～18周逐漸降低。該基因在根中表達量顯著高于葉、花等部位（圖4）。

植物和藻類等生物中含有對食品和能源工業(yè)非常重要的油脂，油脂的主要積累部位是油體。油體的發(fā)育起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，主要由三酰甘油和甾醇酯組成。其中甾醇的合成是環(huán)丙烯醇經(jīng)過多種酶代謝的結(jié)果。有許多DWF家族成員參與甾醇的合成途徑，油棕中發(fā)現(xiàn)的DWF同源基因有1個、1個、2個、1個和1個等。其中基因控制的7-脫氫膽固醇還原酶是甾醇合成途徑中的關(guān)鍵酶，主要調(diào)控甾醇的后期合成。

本研究從油棕中克隆了2個的基因，分別命名為和，分別編碼的氨基酸為424個和374個;定位在Chr8上，定位在Chr7上。2個基因的蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為38.60和38.13，均為不穩(wěn)定蛋白;總平均親水性為0.347和0.313，均為正值，呈疏水性;EgDWF5-1含量較多的氨基酸是Leu（L）和Val（V），占比分別為10.8%和7.8%。EgDWF5-2含量較多的氨基酸是Leu（L）和Val（V），占比分別為10.4%和8.6%。多序列對比結(jié)果顯示，EgDWF5與煙草、擬南芥和番茄的DWF5氨基酸序列具有很高的同一性。進化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，與水稻和玉米的親緣關(guān)系相近，與其他物種關(guān)系較遠。對油棕不同部位的基因表達分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2個基因在根、莖、葉及花和果實中均有表達。果實是油棕唯一的產(chǎn)油器官，其含油量隨果實的發(fā)育而升高，在花后5個月達到最高，果肉中含油率在成熟期可高達50%。本研究中在果實中的表達量顯著高于根、葉和花等部位，在根和莖中的表達量顯著高于其他部位。的基因表達量隨果肉的生長逐漸升高，在花后20周達到最高隨后下降，其表達趨勢與果肉中的含油量基本一致，這可能是在油棕果實成熟過程中基因表達量上調(diào)，提高了7-脫氫膽固醇還原酶的活性，使組織中獲得了更多的游離甾醇，這些甾醇提高了膜的流動性和滲透性，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可合成更多的油體并儲存在細胞質(zhì)中。因此基因在細胞中的高表達可能是油棕果實高含油量的原因。在油棕的果實中表達量低，并在果實的成熟過程中遠低于根、莖、花等部位，而該基因在根和莖的表達量比其他部位的表達量高，這與番茄中的研究結(jié)果一致，其原因可能是因為油棕的基因功能產(chǎn)生了分化，其中參與了油棕果實中油體的發(fā)育，未參與果實中油體的發(fā)育，而參與了植株的生長發(fā)育，在擬南芥和黃瓜的研究中發(fā)現(xiàn)基因缺失導致了植株的矮化，因此推測可能參與了植株的生長發(fā)育。

綜上所述，本研究從油棕中克隆得到2個基因，對其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和進化關(guān)系進行分析，并對2個基因在油棕的不同器官和組織進行基因表達特征分析。結(jié)果表明，在果肉中高表達，推測其對油棕果實中油體的發(fā)育起著重要的調(diào)控作用。在果肉中表達水平低而在根和莖中表達水平高，推測未能參與油棕果肉的油體發(fā)育，而是在植株的生長發(fā)育中參與調(diào)控。本研究結(jié)果為探究油棕果實中油體發(fā)育的相關(guān)基因提供了一定的參考，關(guān)于其在油棕的油體發(fā)育中具體功能還有待進一步的研究。

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