秋水仙素對藥用蒲公英種子萌發(fā)及生長特性的影響

朱夢鑫，劉 茗，張 建，王 宇，武彥芳，霍星孜

（宜賓學(xué)院農(nóng)林與食品工程學(xué)部，四川宜賓 644000）

藥用蒲公英（Taraxacum officinalis）為菊科蒲公英屬植物，分布廣泛，適應(yīng)性強(qiáng)，具有多糖、多酚、三萜[1，2]等活性成分，在藥劑、食品、化妝品、飼料等方面具有廣泛應(yīng)用.隨著需求量越來越大，蒲公英栽培面積逐漸增大. 對蒲公英種子萌發(fā)特性[3]、栽培技術(shù)[4]、抗病性[5]等雖有相關(guān)研究，但藥用蒲公英依然存在抗病性低、藥用成分含量低、產(chǎn)量低等問題. 多倍體育種對于提高植物抗性、產(chǎn)量以及有效成分含量具有獨(dú)特優(yōu)勢.誘導(dǎo)多倍體的化學(xué)藥劑主要是秋水仙素，用于處理萌發(fā)的種子、嫩芽、愈傷組織等[6，7]，以獲得多倍體植株，這在燕麥[8]、人參果[9]、獼猴桃[10]等植物方面獲得了成功. 本文將藥用蒲公英種子用不同濃度秋水仙素處理，旨在篩選出最佳的染色體加倍條件，并對秋水仙素處理過的蒲公英幼苗進(jìn)行移栽，以獲得有實際應(yīng)用價值的蒲公英材料.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藥用蒲公英種子為2020年5月收集，4℃冰箱保存，千粒重為（0.043±0.0021）g.五個月后進(jìn)行秋水仙素處理.

1.2 試驗方法

（1）秋水仙素處理. 避光條件下稱取秋水仙素粉末，配置0.1%、0.3%、0.5%濃度的秋水仙素溶液，4℃下依次浸泡處理1d、3d、5d，蒸餾水浸泡作對照，共12 組處理，每個處理100 粒種子，重復(fù)三次.將秋水仙素處理后的種子用清水徹底清洗，分別放入鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，定期澆水使濾紙始終保持濕潤狀態(tài).在生態(tài)培養(yǎng)箱中進(jìn)行25℃黑暗條件培養(yǎng).觀察并記錄種子每日發(fā)芽數(shù)，計算最終發(fā)芽率.同時觀察并記錄種苗的形態(tài)特征，并與對照組做比較分析.培養(yǎng)至第10 天，使用游標(biāo)卡尺測量萌發(fā)種子的胚根、胚軸和胚芽長度，每個處理中隨機(jī)選取10棵蒲公英幼苗，進(jìn)行相關(guān)測定.

（2）移栽管理. 每一組不同濃度秋水仙素處理的種子培養(yǎng)的第20 天，分別將種苗移栽進(jìn)裝有椰土的花盆中，正常管理，每一盆標(biāo)記上組數(shù)和濃度便于后期統(tǒng)計觀察，放入培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)，定期澆水.三組種苗移栽的操作步驟相同.

（3）根系構(gòu)型觀察. 對移栽培養(yǎng)2 個月后成活的幼苗使用根系掃描儀MICROTK SANMAKER i800plus測量蒲公英種根的長度、面積、平均直徑.

（4）氣孔密度觀察. 對移栽成活四個月的蒲公英撕取下表皮制作裝片使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，與對照比較進(jìn)行分析.

（5）計算分析. 參照武彥芳[11]的方法對種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢進(jìn)行計算：

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素對藥用蒲公英種子萌發(fā)的影響

從表1 中可看出清水處理的對照組發(fā)芽率最高，0.5%秋水仙素處理的對種子發(fā)芽率最低，總體呈現(xiàn)出發(fā)芽率與處理濃度成反比的關(guān)系.種子萌發(fā)過程中，對照組發(fā)芽率最高，秋水仙素處理的種子發(fā)芽率受到不同程度抑制，隨著處理濃度的提高，種子發(fā)芽率逐漸下降，可能是秋水仙素對種子產(chǎn)生了毒害作用，導(dǎo)致種子發(fā)芽率降低.

表1 不同秋水仙素處理組合對種子萌發(fā)的影響

對照組和實驗組的種子萌發(fā)情況均為浸泡3 天的萌發(fā)率最高、發(fā)芽速度最快，發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均高于浸泡1 天和5 天的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù).可見，浸泡3 天的種子吸水量最為適宜，有助于種子萌發(fā)，浸泡時間過長或過短均會導(dǎo)致種子萌發(fā)率的降低.

2.2 不同濃度秋水仙素處理對幼苗形態(tài)的影響

萌發(fā)10 天后，每處理組合中隨機(jī)取出4 個幼苗拍照并進(jìn)行形態(tài)比較分析（圖1），再對每組進(jìn)行幼苗胚根、胚軸和子葉長度測量，得到的結(jié)果見表2.圖1 顯示，經(jīng)秋水仙素處理的種子與清水處理的種子相比，胚軸的直徑明顯增大，且隨著秋水仙素處理濃度的提高，胚軸直徑明顯增加，胚芽和胚軸長度縮短，胚根出現(xiàn)黃化腐爛現(xiàn)象. 經(jīng)秋水仙素處理后，蒲公英幼苗形態(tài)出現(xiàn)不同程度變異，出現(xiàn)三片子葉的幼苗，萌發(fā)初期，誘變劑對植物組織的正常生理環(huán)境造成破壞，導(dǎo)致形態(tài)的改變.

表2 不同秋水仙素處理組合對幼苗質(zhì)量的影響

圖1 不同濃度秋水仙素處理三天的幼苗形態(tài)

2.3 秋水仙素對蒲公英根的影響

秋水仙素處理后，對蒲公英的根生長有不同作用.通過使用MICROTK SANMAKER i800plus 對處理后移栽成活的三株蒲公英根的長度、表面積、平均直徑進(jìn)行測定（圖2、表3）. 實驗組1 總根長、表面積均小于對照，這可能是秋水仙素導(dǎo)致多次加倍，從而使植株表現(xiàn)矮小，發(fā)育遲緩.實驗組2 主根長度和平均直徑明顯大于對照組，總根長和根表面積遠(yuǎn)小于對照組總根長，說明實驗組2 側(cè)根極不發(fā)達(dá).實驗組3 根的平均表面積和平均直徑明顯大于正常組的平均根表面積和直徑，效果較好，根系發(fā)達(dá).

圖2 對照組和實驗組蒲公英的根對比圖

表3 秋水仙素對蒲公英根的影響

2.4 氣孔密度觀察

實驗組移栽成活四個月后，撕取下表皮，用光學(xué)顯微鏡觀察正常蒲公英和經(jīng)秋水仙素處理的蒲公英葉片下表皮氣孔的大小及氣孔數(shù)目.在10×40倍下，觀察氣孔的數(shù)目，統(tǒng)計十個視野范圍內(nèi)氣孔的數(shù)量，通過在顯微鏡下觀察正常蒲公英和加倍蒲公英葉片的表皮氣孔（圖3），發(fā)現(xiàn)對照組蒲公英葉片氣孔47個左右，秋水仙素處理的蒲公英葉片氣孔每個視野27 個左右.經(jīng)處理的蒲公英葉片氣孔數(shù)明顯少于對照組的蒲公英葉片氣孔.

圖3 秋水仙素處理獲得植株和正常植株葉片氣孔

3 結(jié)論與討論

3.1 秋水仙素對蒲公英種子萌發(fā)的影響

秋水仙素對蒲公英種子萌發(fā)率呈現(xiàn)出處理濃度與種子萌發(fā)率成反比的關(guān)系，且第三天浸泡處理種子的萌發(fā)率最高.隨著秋水仙素處理濃度的提高，藥用蒲公英種子的發(fā)芽率明顯下降，這一結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[12]，可能是因為秋水仙素本身的毒性對蒲公英種子產(chǎn)生了毒害作用，抑制種子的萌發(fā)，導(dǎo)致發(fā)芽率的降低.在處理濃度相同時，三天浸泡處理的萌發(fā)率均為最高，猜測是因為浸泡三天的蒲公英種子吸水達(dá)到一個適宜狀態(tài)，種子生理活性較強(qiáng)，有利于種子的萌發(fā). 徐佳琦等[13]在秋水仙素對洋紫荊種子處理的實驗中表明：在秋水仙素處理濃度相同時，隨著處理時間的增加，其發(fā)芽率也呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，處理24h 的發(fā)芽率顯著大于其他處理時間，二者趨勢相同，但最佳浸泡時間存在差異，這說明適宜的浸泡處理時間有利于種子的萌發(fā)，但不同植物種類的種子，其適宜浸泡處理時間不同.

3.2 秋水仙素對蒲公英幼苗的影響

秋水仙素處理對蒲公英幼苗影響主要體現(xiàn)在胚軸增粗縮短、子葉明顯增厚.方慶[14]在對石榴種子的研究中表明石榴種子在經(jīng)秋水仙素處理后，其幼苗冠幅大多比未經(jīng)處理的幼苗冠幅大. 梁海峰等[15]在對紅肉火龍果種子的研究中也提出經(jīng)秋水仙素處理后的幼苗與對照相比出現(xiàn)一些形態(tài)上的變異，表現(xiàn)為幼苗矮化、生長緩慢、子葉肥厚、胚軸膨大，說明秋水仙素對不同幼苗的影響不同，具有個體差異.本實驗中發(fā)現(xiàn)秋水仙素處理對胚根影響較大，具有毒害作用[6]，經(jīng)處理過的胚根易發(fā)黑損壞，導(dǎo)致胚軸部難以生長出新胚根，從而導(dǎo)致幼苗營養(yǎng)耗盡后死亡，這也是導(dǎo)致后期蒲公英存活率低的主要原因；但秋水仙素對蒲公英種子胚軸和子葉的誘導(dǎo)效果較好，其胚軸明顯縮短，子葉明顯增厚，可能是染色體加倍產(chǎn)生了變異，但這種胚根損壞的幼苗不能進(jìn)行正常的生長，難以形成正常的根系. 因此，對秋水仙素處理的蒲公英種子，應(yīng)采取激素誘導(dǎo)或者組織培養(yǎng)的方式，可獲得大量可供利用的誘導(dǎo)材料，為進(jìn)一步選育提供材料基礎(chǔ).

3.3 秋水仙素誘導(dǎo)對植株的影響

秋水仙素誘導(dǎo)對蒲公英的影響是不同的.通過對存活三株的蒲公英進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，地上部分三株蒲公英在形態(tài)上均存在葉片增厚的現(xiàn)象，這與基因劑量效應(yīng)使多倍體細(xì)胞體積、植物器官增大，使之表現(xiàn)出巨大性有關(guān)[16，17]；在氣孔特征上出現(xiàn)單位面積內(nèi)氣孔數(shù)減少，氣孔增大的情況，這一結(jié)果與前人研究一致[18]，根據(jù)其葉片增厚和氣孔的變化，可初步認(rèn)定這三株蒲公英均為加倍植株.其中一株較正常植株根系更加發(fā)達(dá)，生長更加旺盛，猜測可能成功加倍，達(dá)到最佳倍性，從而使植株表現(xiàn)優(yōu)良；另外兩株根系體積較正常明顯縮小，葉片產(chǎn)生卷曲，有可能發(fā)生倍性混雜，從而使植株表現(xiàn)弱小，生長勢變?nèi)?，說明秋水仙素對蒲公英倍性可能會有產(chǎn)生不同的效果，這方面還需要結(jié)合流式細(xì)胞儀以及染色體觀察，確定其倍性，從而為進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)生物學(xué)基礎(chǔ).