元寶楓KCS 基因家族的鑒定及時空表達分析

馬建文，顧錫亭，王 珊，陳轉香，張博勇，李玲俐

（西北農林科技大學 林學院，陜西 咸陽 712100）

元寶楓Acer truncatum（2n=2x=26）屬槭樹科Aceraceae 槭屬Acer植物，是我國特有且綜合效益較高的木本油料樹種，主要分布于我國東北和華北等地區(qū)的27 個省、區(qū)、市，分布區(qū)域廣、海拔差異大[1]。由于其翅果外形與我國古代的金元寶極其相似，故常被稱為“元寶槭”或“元寶楓”。發(fā)展元寶楓可獲得良好的生態(tài)效益與社會效益。元寶楓秋葉具有獨特的園林觀賞價值，而且由于元寶楓具有VA 菌根，是抗旱、耐寒、耐貧瘠、改善生態(tài)環(huán)境的理想造林樹種[2]。元寶楓是良好的木本油料樹種，其種仁含油率45%～48%，其種子油食用后無不良反應。元寶楓葉中含多種活性物質和營養(yǎng)保健成分[3]；種皮中含60%的凝縮類單寧，是皮革工業(yè)和紡織印染工業(yè)的優(yōu)質原料[4]。另外，元寶楓種仁含27%的蛋白質，是理想的蛋白質資源[5]，且其油酸、亞油酸、維生素E 含量豐富。最重要的是元寶楓種仁中含有5%～6%的神經酸[6]，神經酸是大腦神經系統(tǒng)發(fā)育所需重要物質，而我國常規(guī)食用植物油中不含神經酸[7]，因此近年來元寶楓種子油得到了相關學者和企業(yè)的青睞。

神經酸（NA，C24:1，ω-9，順15-二十四碳烯酸）是一種超長鏈單不飽和脂肪酸（C22 ～C26）[8]，最早從鯊魚大腦內分離出來，故又稱鯊魚酸，能促進受損腦神經纖維的修復和再生[9]，是大腦發(fā)育必需的營養(yǎng)物質，在大腦發(fā)育和維持以及神經細胞的生物合成和改善中起著至關重要的作用。但人體自身較難合成神經酸，只能靠體外攝取。嬰兒通過吸收母乳中的神經酸協(xié)助神經系統(tǒng)發(fā)育[10-11]。神經酸水平的降低與發(fā)生精神類疾病的高風險密切相關[12-13]，補充神經酸是有效治療幾種神經系統(tǒng)疾病的方法，如脫髓鞘疾病[13-15]。由于鯊魚等動物體內神經酸的獲取成本高、資源少，并且化學合成神經酸產率低、副產物多，難以大量生產[16]，所以，植物神經酸是神經酸的重要來源。據報道，富含神經酸的植物主要有蒜頭果Malania oleifera、銀 扇 草Lunaria annua、海 檀 木Ximenia caffra、元寶楓、琉璃苣Borago officinalis、大麻Cannabis sativa、旱金蓮Tropaeolum majus、美麗旱金蓮T.speciosum、 文 冠 果Xanthoceras sorbifolium等，考慮到植物的適生性以及種子的含油率和含神經酸率等因素，在實際應用中，銀扇草和元寶楓被認為是生態(tài)位種，其他植物有待進一步研究和開發(fā)[17-18]。現(xiàn)階段，主要任務是選育出高含油率、高神經酸含量的品種。基因修飾是大規(guī)模生產神經酸以及選育高神經酸含量品種的一個良好途徑[18]。通過研究元寶楓種子油中神經酸生物合成的相關基因或基因互作，找到影響神經酸生物合成的遺傳因素是提高神經酸生物合成效率的有效策略。

超長鏈脂肪酸（VLCFAs）的生物合成包括在植物質體中從頭合成脂肪酸（FA）和在細胞質內質網膜利用4 種酶（KCS、KCR、HCD 和ECR）以油酸（C18:1）開始的脂肪酸碳鏈延伸（FAE）2 個階段[19]。VLCFAs 包括多種植物脂類，如種子油、表皮蠟、鞘膜脂、角質以及花粉外表脂類。KCS（β-羥脂酰-CoA 合酶）作為脂肪酸碳鏈延長反應中第1 個參與反應的限速酶，決定FAs 的延伸以及VLCFAs 的數(shù)量和類型。在模式植物擬南芥中，AtKCS1 和AtKCS17 催化C20:0、C20:1、C22:0、C24:0 和C26:0 等5 種VLCFAs 的 伸 長，而AtKCS18 催 化 合 成C20:0、C20:1、C22:0、C22:1、C24:0 、C24:1 和C26:0，其種子特異性表達催化籽油中C20:0 和C22:1 的合成；AtKCS2和AtKCS20 催 化 合 成C22:0、C24:0 和C26:0；AtKCS5 和AtKCS6 參 與 合 成C24 ～C28[20-21]。在文冠果中，KCS基因在種胚發(fā)育早期調控神經酸的合成[22]。在蒜頭果中，MoKCS1在果實膨大期表達量最高，而此階段也是神經酸累積期，表明MoKCS1與蒜頭果神經酸合成密切相關[23]。在甘藍型油菜中，武玉花[24]發(fā)現(xiàn)僅BnKCS1基因在酵母異源表達后能產生微量的超長鏈脂肪酸，且多數(shù)KCS基因存在功能重疊；Xue 等[25]發(fā)現(xiàn)6 個KCS基因可能是病原菌應答基因。在元寶楓的相關研究中，Ma 等[26]在種子發(fā)育期發(fā)現(xiàn)了3個與神經酸積累密切相關的KCS基因，同時發(fā)現(xiàn)MYB 和bZIP 轉錄因子也參與神經酸調控，具體機制仍在研究中。KCS 高度的底物特異性決定了VLCFAs 的最終鏈長，其表達量和活性也決定了合成產物的量[18]。從蒜頭果中分離出的MoKCS11基因對C20:1 具有底物偏好，但對芥酸無底物偏好，因此出現(xiàn)基因已表達但并無神經酸積累的結果[27]。另外，在植物中，KCS的表達決定了VLCFAs 是否在特定細胞中合成，而其他3 種酶（KCR、ECR、HCD）在植物中無處不在，無速率限制[28]。由此可見，KCS基因的表達以及嚴格的底物特異性和組織特異性與神經酸的生物合成有著直接且密切的聯(lián)系。

本研究中，利用元寶楓轉錄組數(shù)據，使用生物信息學分析軟件，鑒定了元寶楓VLCFAs 生物合成的KCS 蛋白，研究了KCS基因在元寶楓根、莖、葉、花4 個器官中以及授粉后4 個發(fā)育階段種子中的表達量，旨在為后續(xù)的KCS基因調節(jié)神經酸生物合成研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料采集和處理

元寶楓樣株種植于陜西省咸陽市楊凌區(qū)西北農林科技大學北校區(qū)（108°04′E，34°17′N，海拔520 m），樹齡約60 a，樹高約13.5 m，胸徑約25 cm，為長勢優(yōu)良、結實量大的優(yōu)良單株。2019—2020年的7—11 月，采集其根、莖、葉、花和發(fā)育中的種子（授粉后100、130、160、190 d），每種樣取3 個生物學重復，在液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA 提取和轉錄組測序

采用改良的CTAB 法提取元寶楓根、莖、葉、花及發(fā)育各時期種子的總RNA[29]。依據mRNAseq 樣品制備試劑盒（Illumina 公司，美國）構建mRNA-seq 文庫。用Illumina HiSeqTM 2000 測序法測定mRNA-seq 基因組文庫的序列。

1.2.2AceKCS基因家族鑒定

在pfrm 數(shù)據庫（http://pfam.xfam.org/）分別輸入PF08392（FAE1/Type Ⅲ polyketide synthaselike protein）、PF08541（3-Oxoacyl-[acyl-carrier protein (ACP)] synthase Ⅲ C terminal）和PF00109（acetyl-CoA C-acetyltransferase）Pfam 號 下 載 隱馬可夫模型。用于元寶楓KCS基因家族鑒定的蛋白質、核苷酸序列文件及基因注釋文件來自陜西佰艾基因信息科技有限公司。使用Hmmsearch 程序包搜索元寶楓蛋白序列中含以上蛋白保守結構域的蛋白，將得到的基因利用Tbtools、Clustalw、Hmmerbuild、Hmmersearch 等軟件（設置E值為10-5），篩選出元寶楓KCS基因家族成員。

1.2.3AceKCS基因染色體定位及串聯(lián)重復基因的Ka/Ks

使用Tbtools V1.0971軟件的Gene location visualize from GFF 程序以及元寶楓基因組注釋文件，得到元寶楓KCS基因在染色體上的分布圖譜。檢測KCS基因在不同染色體上的出現(xiàn)頻率。在本研究中，KCS基因簇的分配參考用于蒺藜苜蓿Medicago truncatulaNBS 基因家族分析的標準[30]。如果2 個相鄰的KCS基因在染色體上相隔不超過250 kb，那么這2 個基因被認為是該簇的基因成員?；谶@個標準，每個基因組中串聯(lián)排列的KCS基因被識別。然后對串聯(lián)重復基因，使用Tbtools 軟件分別計算每條染色體上串聯(lián)重復基因的Ka/Ks。

1.2.4AceKCS基因系統(tǒng)發(fā)育樹構建及順式作用元件預測

使用鑒定AceKCS基因家族的方法來鑒定蒜頭果、文冠果KCS基因家族成員，蒜頭果、文冠果基因組序列從GigaDB（http://gigadb.org/dataset/view/id/100549/File_page/2）數(shù)據庫獲取。甘藍型油菜KCS基因家族直接使用Xue 等[25]鑒定的58 個成員。擬南芥KCS基因組數(shù)據從TAIR 數(shù)據庫（https://www.arabidopsis.org/）獲 取。使 用Editplus 軟 件將元寶楓等5 個物種的蛋白質序列合并成1 個Fasta 文件，利用本地muscle 3.8.31 程序對5 個物種KCS 蛋白質序列進行多序列比對，將比對后的文件導入MEGA 7.0[31]進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建。首先使用Muscle 工具進行序列比對，采用最大似然法Maximum Likelihood 構建系統(tǒng)發(fā)育樹，設置Bootstrap 為1 000，選擇mtREV 模型，然后利用ITOL（https://itol.embl.de/tree）在線網站進行系統(tǒng)發(fā)育樹的美化。

利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測所有AceKCS基因上游2 000 bp 堿基范圍內的順式作用元件。

1.2.5AceKCS基因結構預測及保守基序Motif 分析

使用TBtoolsv1.0983 軟件中的Gene structure View 程序，提交元寶楓基因組的發(fā)育樹文件以及NCBI-CDD 保守域結果文件，生成基因結構及保守域圖譜。使用MultipleEm-for-Motif-Elicitation（MEME）在線程序（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）上傳元寶楓KCS 蛋白質序列文件，得到Motif 圖譜。

1.2.6AceKCS基因編碼蛋白質三維結構及亞細胞定位預測

使用在線網站（https://swissmodel.expasy.org）預測AceKCS基因編碼蛋白質的三維結構，使用Plant-PLoc server 在線網站預測亞細胞定位。

1.2.7AceKCS基因家族成員RNA-seq 分析

采用RT-qPCR 技術檢測AceKCS在元寶楓各組織器官中的表達，根據目標基因的開放閱讀框列出RT-qPCR 反應的特異性引物。使用SYBR Green試劑盒，在StepOnePlus 實時PCR 系統(tǒng)（ABI）中進行實時qPCR 反應。采用actin house keeping 基因作為內部對照，并對樣品重復測定3 次，通過計算每個基因的RNA 相對表達量及歸一化量[32]，得到元寶楓不同組織和不同發(fā)育階段種仁RNA-seq數(shù)據的FPKM 值，將所有樣本表達量數(shù)據以10 為底數(shù)取對數(shù)，然后使用R 包的pheatmap 生成相應的表達水平熱圖。

1.3 數(shù)據分析

使用Excel 軟件分析轉錄組數(shù)據。使用R 語言和Origin 2021 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 AceKCS 基因家族成員的鑒定及染色體定位

通過采用生物信息技術共鑒定到35 個AceKCS基因家族成員。根據每個成員在染色體上的位置，依次命名為AceKC1～AceKC35。使用EXPASY 在線數(shù)據庫對35 個AceKCS 蛋白進行理化性質分析，結果見表1。

表1 AceKCS基因編碼蛋白質的理化性質Table 1 The AceKCS gene encodes the physicochemical properties of proteins

續(xù)表1Continuation of Table1

由表1 可知，AceKCS 蛋白氨基酸數(shù)量在600以內，其中最長的KCS 蛋白質為AceKCS30，其氨基酸數(shù)量為571，最短的為AceKCS21，其氨基酸數(shù)量為156。預測的相對分子質量為17.62 ～61.85 kDa，其中AceKCS21 的相對分子質量最低，AceKCS9 的相對分子質量最高。等電點為5.91 ～9.60，其中AceKCS26 的等電點最低，AceKCS2 的等電點最高。大多數(shù)AceKCS蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)小于40，較穩(wěn)定，有13 個AceKCS 蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)等于或大于40，較不穩(wěn) 定， 包 括AceKCS4、AceKCS7、AceKCS8、AceKCS9、AceKCS10、AceKCS12、AceKCS21、AceKCS23、AceKCS25、AceKCS28、AceKCS30、AceKCS31、AceKCS33。另外，AceKCS 蛋白大多具親水性，少數(shù)具疏水性。

AceKCS基因染色體定位結果如圖1 所示。由圖1 可見，35 個AceKCS基因分布于Chr1、Chr2、Chr3、Chr4、Chr5、Chr6、Chr7、Chr8、Chr9、Chr10、Chr12、Chr13 等12 條染色體上。Chr7 染色體上AceKCS基因分布最多，有14 個，占基因家族成員數(shù)量的40%，共有5 個串聯(lián)重復基因，包括AceKCS1～AceKCS3、AceKCS5～AceKCS6、AceKCS10～AceKCS18、AceKCS19～AceKCS20、AceKCS21～AceKCS23。

圖1 AceKCS基因的染色體定位Fig. 1 Chromosome mapping of AceKCS gene

對串聯(lián)重復基因進行進化分析，其中有10 對串聯(lián)重復基因的Ka/Ks大于0.250 且小于1.000，見表2。由表2 可知，AceKCS22和AceKCS23串聯(lián)基因的Ka/Ks為0.943，接近1.000。

表2 AceKCS基因的串聯(lián)重復基因及其Ka/KsTable 2 The tandem repeats of the AceKCS gene and Ka/Ks

2.2 AceKCS 基因家族成員的系統(tǒng)發(fā)育地位

用于構建物種系統(tǒng)發(fā)育樹的5 個物種的KCS基因共有152 個，其中元寶楓有35 個，擬南芥有21 個，蒜頭果有21 個，文冠果有17 個，甘藍型油菜有58 個。根據Joubès 等[20]對擬南芥KCS基因家族研究結果，古老的復制最終產生了8 個不同的亞組。通過系統(tǒng)發(fā)育分析，將152 個KCS基因分成α、β、γ、η、θ、ζ、δ、ε共8 個亞組，如圖2 所示。由圖2 可見，AceKCS基因家族成員在β亞組中無分布，其主要集中在ε亞組（AceKCS10、AceKCS11、AceKCS13～AceKCS18、AceKCS29、AceKCS32）、η亞組（AceKCS2、AceKCS4、AceKCS6、AceKCS9、AceKCS20、AceKCS22、AceKCS23、AceKCS26、AceKCS27、AceKCS30、AceKCS34）、θ亞組（AceKCS1、AceKCS3、AceKCS5、AceKCS12、AceKCS19、AceKCS21、AceKCS33、AceKCS35），且蒜頭果、文冠果、甘藍型油菜的KCS基因家族成員在亞組中的分布規(guī)律與元寶楓基本一致。

圖2 5個物種KCS家族基因成員的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of gene members of the KCS family in five species

2.3 AceKCS 基因啟動子區(qū)順式作用元件預測

可以通過預測啟動子區(qū)順式作用元件來預測基因的潛在功能及轉錄調控。AceKCS基因中的順式作用元件可分為以下4 類：光響應元件、植物生長發(fā)育相關元件、激素響應元件及脅迫響應元件。AceKCS基因中與植物生長發(fā)育、激素響應及脅迫響應相關的順式元件如圖3 所示。由圖3 可見：與植物生長發(fā)育相關的順式作用元件共有11 個，包括CCAAT-box、GCN4_motif、HDZip 1、as-1、CAT-box、AAGAA-motif、O2-site、CCGTCC-box、AT-rich element 等，與胚乳特異基因表達、植物細胞增殖分化、玉米醇溶蛋白代謝調節(jié)等有關；與激素響應相關的順式作用元件較多，包括MBSI、CGTCA-motif、TGACG-motif、TGAelement、GARE-motif、AuxRR-core、ABRE、ABRE3a、ABRE4、P-box、TGA-element、ERE 等，與類黃酮、茉莉酸甲酯、水楊酸、乙烯、生長素、赤霉素、脫落酸等的合成有關；與脅迫響應相關的順式作用元件有11 個，包括WUN-motif、ARE、LTR、W box、MBS、GC-motif、MYB、STRE、MYC、WRE3 等，其中MYB 和MYC 數(shù)量最多，其與干旱誘導、低溫響應、厭氧誘導及防御反應等非生物脅迫有關。

圖3 AceKCS基因家族成員啟動子區(qū)（2000bp）順式作用元件預測結果Fig. 3 Cis-acting element prediction of AceKCS gene family in promoter region (2 000 bp)

2.4 AceKCS 基因內含子-外顯子、保守域及序列Motif 分析

AceKCS基因主要由CDS（編碼區(qū)）和UTR（非翻譯區(qū)）組成，有14 個基因僅有CDS 而無UTR。AceKCS基因家族的基因結構如圖4 所示。利用NCBI 的Batch-CDD 批量搜索AceKCS基因的保守域，根據每個保守域的功能描述，可將所有保守域歸納為6 類，分別為3-酮脂酰輔酶a 合成酶（3-ketoacyl-CoA synthase）、MDR、FAE1_CUT1_RppA、Ribosomal_L18_L5e、ACP_syn_ Ⅲ_C、乙酰輔酶C- 乙酰轉移酶（acetyl-CoA C-acetyltransferase）。 其 中，F(xiàn)AE1_CUT1_RppA、ACP_syn_ Ⅲ_C、3-ketoacyl-CoA synthase和acetyl-CoA C-acetyltransferase 是KCS基因家族典型的保守域，具有較高的保守性，MDR 屬于中鏈脫氫酶家族，Ribosomal_L18_L5e 是一種核糖體蛋白。此外，將所有基因保守域及Motif 進行比較，發(fā)現(xiàn)AceKCS1與AceKCS3，AceKCS15與AceKCS17，AceKCS16與AceKCS18，AceKCS10、AceKCS29與AceKCS32的保守域、Motif 出現(xiàn)的位置及長度具有高度相似性（圖5）。

圖4 AceKCS基因家族保守結構域（左）和基因結構（右）Fig. 4 Conservative structure domain (left) and structure (right) of AceKCS gene family

圖5 AceKCS編碼蛋白質Motif分析結果Fig. 5 Motif analysis of the AceKCS protein

2.5 AceKCS 基因亞細胞定位預測

AceKCS基因家族表達主要集中在質膜、葉綠體（圖6），其次在細胞質、細胞核中表達，另外在內質網、高爾基體、線粒體、液泡膜以及胞外有少量表達，在細胞骨架表達的僅有AceKCS5；在過氧化物酶體中表達的僅有AceKCS1和AceKCS12；α、γ、δ、e、ζ亞組AceKCS基因在質膜高表達，AceKCS33、AceKCS34和AceKCS35在葉綠體高表達。

圖6 AceKCS基因亞細胞定位預測結果Fig. 6 Subcellular localization prediction of KCS gene family in A. truncatum

2.6 AceKCS 基因的時空表達

為了解AceKCS基因在元寶楓神經酸生物合成過程中的生物學功能，研究了AceKCS基因在根、莖、葉、花和4 個不同發(fā)育階段（授粉后100、130、160、190 d）種子中的時空表達模式。

剔除掉表達量為0 的基因，其余基因的表達模式如圖7 所示。由圖7 可見，有2 個基因（AceKCS15、AceKCS17）在根、莖、葉、花中表達量均為0，但在種子中特異性高表達。

圖7 AceKCS基因在不同組織器官中的表達Fig. 7 KCS gene expression in roots, steams, leaves flowers and four stages of seeds development in Chinese maple

AceKCS15、AceKCS17在授粉后100、130、160、190 d 4 個時期的種子中表達量的變化趨勢一致，均為授粉后100 d 時表達量最高，之后逐漸降低，如圖8 所示。

圖8 AceKCS15和AceKCS17在不同發(fā)育階段種子中的表達量Fig. 8 Expression levels of AceKCS15, AceKCS17 in seeds at different development stages

AceKCS15和AceKCS17均位于ε亞組，且具有相同的基因結構、保守結構域以及Motif，蛋白質3D 結構預測結果顯示兩者蛋白結構非常相似，如圖9 所示。

圖9 AceKCS15和AceKCS17編碼蛋白質的三維結構預測結果Fig. 9 Three-dimensional structure prediction of AceKCS15 and AceKCS17 proteins

此 外， 結 果 顯 示AceKCS25、AceKCS26、AceKCS27、AceKCS30、AceKCS31、AceKCS35在所有組織中均有表達且表達量較高。還有一些基因在所有組織中均有表達，但在莖、葉、花中表達量較高，如AceKCS1、AceKCS3、AceKCS6、AceKCS7、AceKCS24。

3 結論與討論

從元寶楓全基因組中鑒定出35 個AceKCSs，為便于功能分析，將其分為7 個亞組，各亞組均含有特異的保守結構域，可能具有不同的超長鏈脂肪酸延伸特性。AceKCS15和AceKCS17在種子中特異性高表達且表達模式一致，推測其可能是神經酸生物合成的關鍵基因，在神經酸生物合成中發(fā)揮著重要作用。

中國是世界上油料生產大國，也是第一消費大國。一直以來，我國食用植物油資源短缺，60%依賴進口[33]，食用油已成為對外依存度較高的大宗農產品，僅次于糧食。由于木本油料物種的高種實含油率、較強的適應性及木本植物油含有豐富的營養(yǎng)成分，發(fā)展優(yōu)質木本油料樹種是解決我國糧油安全的有效措施[34]，大力發(fā)展木本食用油產業(yè)，具有重要的現(xiàn)實意義[35-36]。近年來，隨著帕金森病等神經退行性疾病嚴重影響人們的健康和生活，加之有限的神經酸植物資源，以及含神經酸植物油的毒性和病理性試驗的局限性，元寶楓種仁油神經酸分子合成機制研究成為了熱點[37-42]。

脂肪酸合酶（FAE）是超長鏈單不飽和脂肪酸生物合成的關鍵酶，在植物中有2 種類型，即FAE（fatty acid elongase） 和ELO（fatty acid elongation），ELO 型酶多存在于動物細胞中，在植物中較為少見[43]。本研究中也未發(fā)現(xiàn)ELO 型KCS。大量研究結果已證明FAE/KCS 是一種限速酶，調節(jié)特定KCS 蛋白的表達會影響超長鏈脂肪酸的合成。Guo 等[21]和Huai 等[43]也已證實神經酸的生物合成是由KCS 決定的，而不是KCR、HCD 和ECR。在高含量神經酸植物資源中大量KCS基因的功能及其影響神經酸產生的機制需要進一步驗證。

目前，有關許多植物中FAE/KCS 基因家族的鑒定和分析已有報道，如擬南芥[20,44]、甘藍型油菜[25]、蒜頭果[27]、文冠果[45]、元寶楓[26]等。本研究組前期對36 個基因型的元寶楓種質種仁進行了脂肪酸成分分析，鑒定到高神經酸含量和低神經酸含量的種質，對鑒定種質的表型、脂肪酸含量和神經酸含量進行了分析，并對其進行了基因組分析和轉錄組測序，初步揭示了AceKCS基因的表達量與種仁神經酸含量正相關[39,46]。在此基礎上，本研究中進一步對元寶楓KCS基因家族成員進行了鑒定與功能分析。由于蒜頭果、文冠果也是我國特有的含神經酸的植物[45]，且關于其KCS基因家族已有研究報道，有關擬南芥、油菜中KCS基因家族的研究比較成熟，因此，本研究中參考蒜頭果、文冠果、擬南芥和甘藍型油菜4 個物種的KCS基因相關研究結果來分析元寶楓KCS基因功能。元寶楓KCS基因家族成員被分為7 個亞組，分別為α、γ、δ、ε、ζ、η和θ，在β亞組中 無AceKCS、XsKCS、MoKCS，僅 有BnKCS和AtKCS。根據以往文獻報道，BnKCS22與AtKCS18（FAE1）是直系親屬，在擬南芥中AtKCS18主要負責種子油中芥酸的合成[25]，因此推測β亞組的KCS基因僅負責長鏈脂肪酸合成，而超長鏈脂肪酸如神經酸的合成需要含有ε、η和θ亞組KCS蛋白結構域的基因才能進行，ε、η和θ亞組中每個KCS 蛋白在拓撲結構、跨膜結構域方面與其他亞組KCS 蛋白有顯著區(qū)別[20]。此外，在蒜頭果中，通過同源克隆方法從發(fā)育種子中分離出的KCS同源物MoKCS11，在擬南芥種子中特異性表達，導致約5%的神經酸積累[27]，因此推測神經酸生物合成關鍵KCS基因在ε、η和θ等3 個亞組中。AceKCS15和AceKCS17在發(fā)育的種仁中特異性高表達，表明其可能是神經酸合成的重要基因。Ma 等[26]通過對6 個發(fā)育階段（授粉后70、85、100、115、145 和180 d）種子中的脂肪酸進行分析發(fā)現(xiàn)，在授粉85 d 后芥酸（C22:1）和神經酸（C24:1）開始積累，在授粉115 d 后神經酸含量基本不變。通過基因表達分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)KCS基因在種子發(fā)育早期表達量高，之后逐漸降低，而KCS_Atru.Chr.4.2308、KCS_Atru.Chr.4.2307、KCS_Atru.Chr.4.2311基因的表達量在授粉后70 d時無表達或低表達，在授粉85 d 后表達量逐漸升高。將這3 個基因與AceKCS15和AceKCS17基因進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)KCS_Atru.Chr.4.2307基因與AceKCS15的比對得分為100%，KCS_Atru.Chr.4.2308和KCS_Atru.Chr.4.2311與AceKCS17同源性較高，進一步表明AceKCS15和AceKCS17是神經酸生物合成的關鍵基因。

KCS基因通過復制已經形成一個龐大的基因家族，在經歷了漫長的進化后積累了許多突變，導致基因功能的分化和更新，產生了特異性[21]。本研究結果表明，元寶楓KCS基因家族成員分布于12 條染色體上，共有5 個串聯(lián)重復事件，其中Chr7 上有3 個串聯(lián)重復事件，表明重復序列是元寶楓基因組的重要組成部分，也是其基因組進化的基礎。對串聯(lián)重復基因進行進化分析，找到21 個串聯(lián)基因對，其中有10 個串聯(lián)基因對的Ka/Ks大于0.25 而小于1.00，其余均小于0.25，說明KCS基因在進化過程中受到了強烈的純化選擇[47-48]。Guo 等[21]通過鑒定26 種植物的475 個KCS基因家族成員并分析KCS基因進化史也證明了這一觀點。另外，AceKCS22和AceKCS23這2 個基因的Ka/Ks為0.943，已接近1.000，表明KCS基因在片段重復的過程中不斷進化。

特異性啟動子是KCS基因在油料植物中過表達后提高神經酸含量的關鍵途徑[43]。在啟動子和內含子區(qū)域存在的順式元件模式決定了基因表達的水平[49]。本研究中通過KCS基因啟動子分析，發(fā)現(xiàn)在基因啟動子區(qū)有許多光響應元件、植物生長發(fā)育相關元件、植物激素響應元件和植物脅迫響應元件。植物激素響應元件中數(shù)量較多的有與茉莉酸甲酯MeJA 合成有關的CGTCA-motif、TGACG-motif，與水楊酸SA 合成有關的TCA、TCA-element，與赤霉素GA 合成有關的P box，與脫落酸ABA 合成有關的ABRE、ABRE3a、ABRE4。據報道，植物激素作為信號分子調節(jié)植物應對非生物脅迫[50]。生物膜是植物應對非生物脅迫的主要屏障，而脂肪酸是構成生物膜的必要成分，且膜中不飽和脂肪酸的比例與植物耐低溫等非生物脅迫的能力密切相關。例如：在植物受到非生物脅迫時，脂肪酸脫氫酶FAD 催化亞麻酸形成，并使其轉變?yōu)檐岳蛩幔瑥亩岣咧参锟估湫訹51]；另外，水楊酸可以誘導FAD 基因的表達以維持細胞膜脂肪酸不飽和度，提高細胞膜在低溫下的穩(wěn)定性[52]。脅迫響應元件較多的有MYB、MYC、APE、LTR。表明與植物激素及抗旱相關途徑可能通過直接或間接結合這些順式作用元件來調節(jié)AceKCS轉錄物。MYB 轉錄因子參與表皮生長物的積累[53]，且其與bZIP 轉錄因子在超長鏈單不飽和脂肪酸的生物合成中發(fā)揮著重要作用[26]。MYC 是bHLH 轉錄因子家族的一個亞家族，在植物生長發(fā)育調控、種子生產、蛋白質積累以及次生代謝物積累等方面發(fā)揮著重要作用[54]。本研究結果表明，元寶楓KCS基因的表達及超長鏈脂肪酸的積累是在植物受到非生物脅迫時由許多脅迫響應元件及激素響應元件共同調控，神經酸是該通路中的一種產物，挖掘關鍵KCS基因是研究神經酸的累積規(guī)律及變化機制的基礎。本研究中未對元寶楓關鍵KCS基因功能進行驗證，后續(xù)將通過關聯(lián)性分析及異源表達等驗證神經酸累積關鍵KCS基因功能。