甘肅省沙棘枝枯病病原菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性

陳 悅，王欣悅，胡建忠，閆曉玲，吳元華，韓嚴(yán)鋒，夏 博

（1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧 沈陽 110866；2. 水利部沙棘開發(fā)管理中心，北京 100038；3. 黃河水土保持西峰治理監(jiān)督局,甘肅 慶陽 745000）

沙棘Hippophae rhamnoides是一種兼具生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的多年生落葉灌木[1]。作為東北地區(qū)常用的綠化樹種之一，沙棘抗旱能力強(qiáng)且容易繁殖[2]，還具有防風(fēng)固沙、耐鹽耐堿的特性。在我國(guó)甘肅、青海、內(nèi)蒙古等西北和西南地區(qū)大面積種植沙棘對(duì)我國(guó)生態(tài)環(huán)境建設(shè)具有重要意義[3]。沙棘果實(shí)中含有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有“維生素C 之王”的美譽(yù)，較多大果沙棘品種的引進(jìn)和栽培滿足了人們對(duì)果品風(fēng)味的要求[4]。

沙棘枝枯病又被稱為干縮病，曾在俄羅斯大面積流行，是一種危害沙棘的世界性病害[5]。沙棘枝枯病導(dǎo)致沙棘葉片提早黃化脫落，樹勢(shì)早衰，縮短了沙棘的結(jié)果期，降低了果實(shí)品質(zhì)，枝條全部枯死后整株死亡，嚴(yán)重危害了沙棘的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)沙棘枝枯病菌進(jìn)行了大量研究，據(jù)報(bào)道，具有致病性的枝孢鐮刀菌Fusarium sporotrichiella和雙絲孢座菌Plowightia hippophaes可能導(dǎo)致了遼寧地區(qū)該病害的發(fā)生[6]。然而，河西走廊地區(qū)發(fā)生的沙棘枝枯病病原菌種類鮮見報(bào)道[7]。近年來，我國(guó)沙棘的種植面積不斷增加，一些大果沙棘品種在各地被廣泛種植，各種沙棘病害的發(fā)生面積也不斷擴(kuò)大。

自2018 年，甘肅省慶陽市沙棘栽培基地內(nèi)引種的20 個(gè)俄羅斯大果沙棘品種出現(xiàn)了嚴(yán)重的疑似沙棘枝枯病癥狀。秋季沙棘葉片提前褪綠并大量脫落，翌年春季大量枝條不再萌發(fā)，較多品種的大果沙棘死亡率超過了60%。2019 年7 月，該基地的20 個(gè)大果沙棘品種（5 ～6 年生）出現(xiàn)感病癥狀，感病沙棘葉片萎蔫黃化，枝干枯萎皺縮，大面積沙棘感病后枯死。為明確該病害的病原菌，本研究中以采集自甘肅省慶陽市的感病沙棘為材料，通過對(duì)病原菌的分離鑒定和致病性觀測(cè)，明確導(dǎo)致該病害發(fā)生的病原菌種類，并通過觀測(cè)統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基、溫度、光照、pH、碳源、氮源等條件下病原菌生長(zhǎng)情況和產(chǎn)孢量，對(duì)病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，旨在為該病害的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試病原樣本采集和觀測(cè)

采集感病沙棘病樣，放置于便攜式冰箱中。根據(jù)沙棘感病后枝條、葉片、根部和莖基部表現(xiàn)出的典型癥狀，對(duì)采集地沙棘枝枯病的發(fā)病癥狀進(jìn)行觀測(cè)和記錄，包括如下癥狀的描述[8]：變色（植物組織出現(xiàn)葉片發(fā)黃褪綠的癥狀）；落葉（葉片提早脫落）；枝條上出現(xiàn)凹陷病斑；枝條干枯皺縮。觀測(cè)和記錄發(fā)病沙棘的生長(zhǎng)勢(shì)，感病后是否死亡，部分植株感病后同一植株的其他分株的生長(zhǎng)有無影響，感病沙棘的樹齡等。

1.2 病原菌分離和純化

采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行病原菌的分離。將采集的沙棘病株樣品用蒸餾水沖洗干凈，自然晾干。在超凈工作臺(tái)上，用果木剪、解剖刀取病樣上病健交界處的4 mm×4 mm 樣品組織，并將其置于75%乙醇中浸泡消毒30 s，然后用無菌水沖洗干凈，再將其放入2.5%的NaClO 溶液中3 min，用無菌水漂洗3 次后，用已滅菌的濾紙把樣品表面水分吸干，最后將樣品放在pH 為7.0 的PDA培養(yǎng)基中，25 ℃條件下避光培養(yǎng)3 ～5 d。待組織長(zhǎng)出菌落后，采用單胞分離法進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.3 病原菌致病性檢測(cè)

采用科赫氏法則鑒定病原菌。將健康沙棘扦插枝條栽植在含有2.5 kg 無菌土的花盆里，每盆栽植3 根插條，土壤經(jīng)過福爾馬林（40%甲醛）熏蒸處理，密封24 h 消毒。每4 d 向花盆中澆1 次水，其間灌以霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液促進(jìn)生根。待沙棘扦插枝條長(zhǎng)出10 ～20 片葉時(shí)，使用75%的乙醇對(duì)沙棘莖基部進(jìn)行消毒，用解剖刀在樹干上劃出“丁”字形傷口，用0.5 cm 打孔器將單孢純化培養(yǎng)的菌株打成直徑0.5 cm 的菌餅，置于傷口上，用蘸取過無菌水的脫脂棉覆蓋傷口，使用保鮮膜密封保濕，以不含分離物的PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）作為對(duì)照，定期觀察沙棘發(fā)病情況。取回接后發(fā)病植株的病健交界位置進(jìn)行病原物的再分離。

1.4 病原菌形態(tài)特征觀察和描述

使用PDA 培養(yǎng)基，25 ℃恒溫培養(yǎng)單孢純化后的待測(cè)菌株。7 d 后，對(duì)菌落形態(tài)和顏色進(jìn)行觀察，在顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)及孢子形狀和大小等形態(tài)特征，結(jié)合真菌鑒定手冊(cè)和病原菌鑒定相關(guān)資料進(jìn)行初步鑒定[9]。

1.5 病原菌分子鑒定

1.5.1 分離物基因組DNA 的提取

在單孢純化后的菌落上打取直徑5 mm 的菌餅，將其置于PD培養(yǎng)液（馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液）中，封好封口膜，設(shè)置搖床參數(shù)為25 ℃、110 r/min，搖培5 d 后，用無菌濾紙過濾培養(yǎng)液，將過濾出的菌絲用無菌水沖洗3 次后置于50 mL 離心管中，在凍干機(jī)中凍干3 h，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２≡蚪MDNA 的提取方法參照真菌基因組快速抽提試劑盒（生工，上海）。

1.5.2 分離物基因組DNA 的擴(kuò)增和分析

利用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′）和鐮刀菌特異性引物EF-1H（5′-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3′）、EF-2T（5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′）進(jìn) 行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)[10]。2 對(duì)引物的PCR 擴(kuò)增體系（50 μL）：Taq PCR Master Mix 25 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O 19 μL。引物ITS1/ITS4反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，34 個(gè)循環(huán)。引物EF-1H/EF-2T 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取10 μL PCR 產(chǎn)物，進(jìn)行1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將剩余產(chǎn)物送至上海生工生物公司（長(zhǎng)春）測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，下載同源性較高的序列，用MEGE 7.0 軟件構(gòu)建病原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行分析。

1.6 病原菌生物學(xué)特性檢測(cè)

1.6.1 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

供試培養(yǎng)基為PDA、PSA（馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基）、PMA（馬鈴薯麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基）、OMA（燕麥瓊脂培養(yǎng)基）、CMA（玉米粉瓊脂培養(yǎng)基）、Czapek（察氏培養(yǎng)基）、WA（水瓊脂培養(yǎng)基）[11]。使用直徑5 mm 的無菌打孔器在培養(yǎng)5 d 的病原菌菌落邊緣打取菌餅，并將其分別轉(zhuǎn)接到供試的幾種培養(yǎng)基平板中央，每種培養(yǎng)基設(shè)置3個(gè)重復(fù)，25 ℃條件下恒溫遮光培養(yǎng)。每日采用十字交叉法對(duì)菌落直徑進(jìn)行測(cè)量，并于培養(yǎng)10 d 后采用血球計(jì)數(shù)法計(jì)算產(chǎn)孢量，重復(fù)3 次。

1.6.2 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

溫度條件設(shè)置為5、10、20、25、28、30、35 ℃。使用直徑5 mm 的無菌打孔器在培養(yǎng)5 d 的病原菌菌落邊緣打取菌餅，并將其轉(zhuǎn)接在PDA 培養(yǎng)基平板中央，用封口膜封好后分別置于不同的溫度條件下培養(yǎng)，每種溫度條件設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，恒溫遮光培養(yǎng)。每日采用十字交叉法對(duì)菌落直徑進(jìn)行測(cè)量，并于培養(yǎng)10 d 后采用血球計(jì)數(shù)法計(jì)算產(chǎn)孢量，重復(fù)3 次[12]。

1.6.3 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

光照條件設(shè)置為全天光照、全天黑暗、半天光照和半天黑暗。使用直徑5 mm 的無菌打孔器在培養(yǎng)5 d 的病原菌菌落邊緣打取菌餅，并將其轉(zhuǎn)接在PDA 培養(yǎng)基平板中央，置于人工控制的光照條件下培養(yǎng)，每種光照條件設(shè)置3 個(gè)重復(fù)[13]，培養(yǎng)溫度為25 ℃。每日采用十字交叉法對(duì)菌落直徑進(jìn)行測(cè)量，并于培養(yǎng)10 d 后采用血球計(jì)數(shù)法計(jì)算產(chǎn)孢量，重復(fù)3 次。

1.6.4 培養(yǎng)基pH 對(duì)菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

使用pH 計(jì)和配置好的1% NaOH 和1% HCl母液，將PDA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10、11 共9 個(gè)梯度。使用直徑為5 mm 的無菌打孔器在培養(yǎng)5 d 的病原菌菌落邊緣打取菌餅，并將其轉(zhuǎn)接在處理過的PDA 培養(yǎng)基平板中央，每個(gè)pH 梯度設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，25 ℃條件下恒溫遮光培養(yǎng)。每日采用十字交叉法對(duì)菌落直徑進(jìn)行測(cè)量，并于培養(yǎng)10 d后采用血球計(jì)數(shù)法計(jì)算產(chǎn)孢量，重復(fù)3次。

1.6.5 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

將葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、D-果糖、乳糖、可溶性淀粉共6 種碳源，以相當(dāng)于Czapek 培養(yǎng)基中20 g 蔗糖的含碳量，置換其中的蔗糖，將含不同碳源的培養(yǎng)基使用高壓滅菌鍋滅菌，倒成平板。使用直徑為5 mm 的無菌打孔器在培養(yǎng)5 d 的病原菌菌落邊緣打取菌餅，并將其轉(zhuǎn)接在處理過的Czapek 培養(yǎng)基平板中央，每處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，25 ℃恒溫遮光培養(yǎng)。每日采用十字交叉法對(duì)菌落直徑進(jìn)行測(cè)量，并于培養(yǎng)10 d 后采用血球計(jì)數(shù)法計(jì)算產(chǎn)孢量，重復(fù)3 次[14]。

1.6.6 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

以NH4Cl、(NH4)2SO4、NaNO3、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、尿素、甘氨酸共8 種物質(zhì)為氮源，以相當(dāng)于Czapek 培養(yǎng)基中2 g NaNO3的含氮量，置換其中的NaNO3，將含有不同氮源的培養(yǎng)基使用高壓滅菌鍋滅菌，倒成平板。使用直徑為5 mm的無菌打孔器在培養(yǎng)5 d 的病原菌菌落邊緣打取菌餅，并將其轉(zhuǎn)接在處理過的Czapek 培養(yǎng)基平板中央，每處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，25 ℃恒溫遮光培養(yǎng)。每日采用十字交叉法對(duì)菌落直徑進(jìn)行測(cè)量，并于培養(yǎng)10 d后采用血球計(jì)數(shù)法計(jì)算產(chǎn)孢量，重復(fù)3次[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病植株癥狀

發(fā)病的較細(xì)側(cè)枝通常出現(xiàn)樹皮皺縮的癥狀，一些枝條表皮會(huì)出現(xiàn)小顆粒的黑色點(diǎn)狀物（圖1）。短期內(nèi)對(duì)主枝和其他側(cè)枝的影響較小，通常在感病2 ～3 a 后枝條長(zhǎng)勢(shì)衰弱或干枯死亡（圖2）。如果發(fā)病枝條為主枝，將會(huì)導(dǎo)致整株沙棘逐漸發(fā)病，樹體逐漸枯萎死亡（圖3）。

圖1 沙棘枝枯病發(fā)病初期葉片癥狀Fig. 1 Leaf symptoms of sea buckthorn stem wilt at the initial stage of onset

圖2 沙棘枝枯病發(fā)病后期枝癥狀Fig. 2 Symptoms of sea buckthorn stem wilt in the later stage

圖3 沙棘枝枯病田間癥狀Fig. 3 Field symptoms of sea buckthorn stem wilt

對(duì)所調(diào)查感病沙棘的根部進(jìn)行解剖后發(fā)現(xiàn)，莖基部出現(xiàn)黑褐色病變特征（圖4），但在鄰近根系暫未觀測(cè)到黑褐色病變癥狀。重度感病沙棘的結(jié)實(shí)量明顯降低，病害嚴(yán)重影響了沙棘果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)。

圖4 沙棘枝枯病發(fā)病植株的莖基部橫截面Fig. 4 Cross section of stem base of sea buckthorn stem wilt

2.2 病原菌的鑒定

2.2.1 致病性鑒定

對(duì)所采集的感病沙棘植株進(jìn)行病原菌分離，共得到56 個(gè)菌株。選取經(jīng)過初步形態(tài)學(xué)鑒定的9 個(gè)代表菌株，經(jīng)室內(nèi)純化培養(yǎng)5 d 后，接種于盆栽的沙棘枝干上，試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1 可知：接種了G7-5-2、G7-5-3、G4-5-1、G6-5-2、G25-5-3菌株的沙棘植株均未表現(xiàn)出明顯的發(fā)病癥狀；接種了G4-5-3、G1-5-2、G5-5-2 菌株的沙棘植株零星發(fā)病，發(fā)病率在35%以下，其發(fā)病癥狀為韌皮部有凹陷病斑，葉片無癥狀；接種了G1-5-1 菌株的沙棘植株發(fā)病率達(dá)到84.6%，發(fā)病癥狀均為病斑連結(jié)成片，落葉嚴(yán)重，后期枝條干枯，與甘肅田間沙棘植株的發(fā)病癥狀一致。將接種了G1-5-1 菌株的沙棘植株發(fā)病部位的病健交界處進(jìn)行再分離培養(yǎng)，與原菌落形態(tài)一致，經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)其孢子形態(tài)也與原菌株孢子形態(tài)一致。根據(jù)科赫氏法則，所分離菌株G1-5-1 對(duì)沙棘存在典型的致病性，證明該菌株為沙棘枝枯病的病原菌。

表1 分離病原菌的盆栽接種試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Isolation number and potted inoculation test results

2.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株G1-5-1 在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d 后，在顯微鏡下進(jìn)行觀察，如圖5 所示。PDA 培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)迅速，菌絲致密且最初呈現(xiàn)粉白色（圖5A），并在平板底部產(chǎn)生粉紅色色素沉淀（圖5B）。產(chǎn)生的大型孢子中度彎曲，具有3 ～5 個(gè)明顯的隔膜，呈透明狀，壁厚，大小為(27.8±3.6) μm×(4.8±0.5) μm（n=30，n為孢子數(shù)量）。小型孢子形態(tài)豐富，呈梨形、橢圓形或梭形，基部常有乳突，(8.4±2.2) μm×(3.1±0.3) μm（n=30）。形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明，該菌株具有鐮刀菌的特征。

圖5 沙棘枝枯病病原菌形態(tài)Fig. 5 Morphology of the pathogen of sea buckthorn stem wilt

2.2.3 分子鑒定

測(cè)序結(jié)果顯示，ITS 片段長(zhǎng)度為523 bp，NCBI上 登 錄 號(hào) 為MN160235.1 和MN160237.1。EF 片段長(zhǎng)度為682 bp，NCBI 上登錄號(hào)為MN429075.1和MN429076.1。 將ITS 與EF 測(cè) 序 結(jié) 果 在GenBank 上進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明：菌株序列MN160235.1 與數(shù)據(jù)庫中基因登錄號(hào)AY188917 菌株的ITS 序列同源性為99.8%（圖6）；菌株序列MN429075.1 與數(shù)據(jù)庫中基因登錄號(hào)MH582286 菌株的EF 序列同源性達(dá)到100%（圖7）。在基于ITS 序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，G1-5-1 與擬枝孢鐮刀菌F. sporotrichioides的同源性達(dá)到100%；在基于EF 序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，G1-5-1 與擬枝孢鐮刀菌的同源性達(dá)到99%。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，可知引起甘肅省慶陽市沙棘枝枯病且致病力較強(qiáng)的G1-5-1 菌株為擬枝孢鐮刀菌。

圖6 基于ITS序列構(gòu)建的沙棘枝枯病病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 Phylogenetic tree constructed based on ITS sequences

圖7 基于EF序列構(gòu)建的沙棘枝枯病病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 7 Phylogenetic tree constructed based on EF sequences

2.3 病原菌的生物學(xué)特性

2.3.1 培養(yǎng)基對(duì)擬枝孢鐮刀菌菌落直徑和產(chǎn)孢量的影響

不同培養(yǎng)基上擬枝孢鐮刀菌的菌落直徑和產(chǎn)孢量分別如圖8 ～9 所示。由圖8 ～9 可見，擬枝孢鐮刀菌在7 種供試培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，不同種類的培養(yǎng)基對(duì)擬枝孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的影響存在顯著差異，對(duì)產(chǎn)孢量的影響差異顯著。病原菌菌絲在WA 和OMA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度較慢，且菌絲稀疏，在PDA、PSA、PMA、CMA 和Czapek培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度相對(duì)較快，在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)7 d 后菌落平均直徑可達(dá)75.6 mm。病原菌在CMA 培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大，培養(yǎng)10 d 后每毫升培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量可達(dá)5.24×105；在WA 和Czapek 培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量較低。

圖8 不同培養(yǎng)基上擬枝孢鐮刀菌的菌落直徑Fig. 8 Effects of different media on mycelial growth of F. sporotrichioides

圖9 不同培養(yǎng)基上擬枝孢鐮刀菌產(chǎn)的孢量Fig. 9 Effects of different media on sporulation of F. sporotrichioides

2.3.2 溫度對(duì)擬枝孢鐮刀菌菌落直徑和產(chǎn)孢量的影響

不同溫度條件下擬枝孢鐮刀菌的菌落直徑和產(chǎn)孢量如圖10 ～11 所示。由圖10 ～11 可見，在不同溫度條件下，擬枝孢鐮刀菌的菌落直徑和產(chǎn)孢量均有顯著差異。15 ～30 ℃均有孢子產(chǎn)生，最適菌絲生長(zhǎng)溫度為25 ℃，培養(yǎng)7 d 后菌落平均直徑達(dá)到76 mm，當(dāng)溫度為5 ℃時(shí)幾乎不生長(zhǎng)。產(chǎn)孢的最適溫度為25 ℃，培養(yǎng)10 d 后每毫升培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量為19.30×105。

圖10 不同溫度條件下擬枝孢鐮刀菌的菌落直徑Fig. 10 Effects of different temperatures on mycelial growth of F. sporotrichioides

圖11 不同溫度條件下擬枝孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量Fig. 11 Effects of different temperatures on sporulation of F. sporotrichioides

2.3.3 光照對(duì)擬枝孢鐮刀菌菌落直徑和產(chǎn)孢量的影響

不同光照條件下擬枝孢鐮刀菌的菌落直徑和產(chǎn)孢量如圖12 ～13 所示。由圖12 ～13 可見，不同光照條件對(duì)擬枝孢鐮刀菌的菌落直徑和產(chǎn)孢量的影響差異顯著。全黑暗的條件更有利于菌絲的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，全黑暗培養(yǎng)7 d 后菌落直徑可達(dá)74.6 mm，培養(yǎng)10 d 后每毫升培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量為15.56×105。在全光照培養(yǎng)條件下每毫升培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最少，為2.67×105。

圖12 不同光照條件下擬枝孢鐮刀菌的菌落直徑Fig. 12 Effects of different light on mycelial growth of F. sporotrichioides

圖13 不同光照條件下擬枝孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量Fig. 13 Effects of different light on sporulation of F. sporotrichioides

2.3.4 培養(yǎng)基pH 對(duì)擬枝孢鐮刀菌菌落直徑和產(chǎn)孢量的影響

不同培養(yǎng)基pH 條件下擬枝孢鐮刀菌的菌落直徑和產(chǎn)孢量如圖14 ～15 所示。由圖14 ～15 可見，在培養(yǎng)基pH 為3 ～11 時(shí)擬枝孢鐮刀菌的菌絲均可生長(zhǎng)，適宜菌絲生長(zhǎng)的培養(yǎng)基pH 為5 ～9，適宜產(chǎn)孢的培養(yǎng)基pH 為5 ～7。當(dāng)培養(yǎng)基pH 為6 時(shí)，每毫升培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最高，可到達(dá)31.41×105。說明偏酸環(huán)境更適宜擬枝孢鐮刀菌產(chǎn)孢。

圖14 不同培養(yǎng)基pH條件下擬枝孢鐮刀菌的菌落直徑Fig. 14 Effects of different pH on mycelial growth of F. sporotrichioidess

2.3.5 碳源對(duì)擬枝孢鐮刀菌菌落直徑和產(chǎn)孢量的影響

不同碳源條件下擬枝孢鐮刀菌的菌落直徑和產(chǎn)孢量如圖16 ～17 所示。由圖16 ～17 可見，6 種碳源對(duì)擬枝孢鐮刀菌的菌落直徑和產(chǎn)孢量的影響存在顯著差異。以蔗糖作為碳源時(shí)，擬枝孢鐮刀菌菌絲的生長(zhǎng)速度最快，其產(chǎn)孢量也達(dá)到最大，培養(yǎng)7 d 后菌落平均直徑可以達(dá)到72.8 mm，培養(yǎng)10 d 后每毫升培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量為10.69×105。培養(yǎng)10 d 后，以D-果糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最慢，菌落平均直徑為57.2 mm，以可溶性淀粉為碳源的每毫升培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最少，為2.35×105。

圖15 不同培養(yǎng)基pH條件下擬枝孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量Fig. 15 Effects of different pH values on sporulation of F. sporotrichioides

圖16 不同碳源條件下擬枝孢鐮刀菌的菌落直徑Fig. 16 Effects of different carbon sources on mycelial growth of F. sporotrichioides

圖17 不同碳源條件下擬枝孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量Fig. 17 Effects of different carbon sources on sporulation of F. sporotrichioides

2.3.6 氮源對(duì)擬枝孢鐮刀菌菌落直徑和產(chǎn)孢量的影響

不同氮源條件下擬枝孢鐮刀菌的菌落直徑和產(chǎn)孢量如圖18 ～19 所示。由圖18 ～19 可見，在8種氮源的培養(yǎng)基上，菌落直徑和產(chǎn)孢量均存在顯著差異。以酵母浸膏為氮源時(shí)擬枝孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)最快，以甘氨酸為氮源時(shí)產(chǎn)孢量最大。以尿素為氮源時(shí)擬枝孢鐮刀菌生長(zhǎng)最慢，以NaNO3為氮源時(shí)產(chǎn)孢量最少，培養(yǎng)10 d 后每毫升培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量為6.27×105。

圖18 不同氮源條件下擬枝孢鐮刀菌的菌落直徑Fig. 18 Effects of different nitrogen sources on mycelial growth of F. sporotrichioides

圖19 不同氮源條件下擬枝孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量Fig. 19 Effects of different nitrogen sources on sporulation of F. sporotrichioides

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，甘肅慶陽市沙棘枝枯病的病原菌為擬枝孢鐮刀菌。在PDA 培養(yǎng)基上擬枝孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)速度較快，菌落直徑為75.6 mm；在CMA 培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大，每毫升培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量達(dá)5.24×105。利于擬枝孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的條件：全黑暗條件、25 ℃、培養(yǎng)基pH 6、蔗糖碳源，酵母浸膏氮源。利于擬枝孢鐮刀菌菌絲產(chǎn)孢的條件：全黑暗條件、25 ℃、培養(yǎng)基pH 6、蔗糖碳源、甘氨酸氮源。擬枝孢鐮刀菌在多種培養(yǎng)基上均可以生長(zhǎng)、產(chǎn)孢，可利用多種碳源、氮源，對(duì)溫度的適應(yīng)性較好，能夠適應(yīng)不同的環(huán)境，沙棘枝枯病的防治難度較大。

沙棘病害種類眾多，沙棘枝枯病是沙棘較為嚴(yán)重的病害之一。通過對(duì)沙棘枝枯病病原菌的分離鑒定、形態(tài)特征觀察、分子生物學(xué)鑒定和致病性驗(yàn)證，結(jié)果表明引起甘肅沙棘枝枯病的致病菌為擬枝孢鐮刀菌。據(jù)報(bào)道，引起我國(guó)黑龍江省沙棘枝枯病的致病菌也是擬枝孢鐮刀菌[16]）。其他種類的鐮刀菌屬真菌也可能引起沙棘枝枯病。致病性接種試驗(yàn)的結(jié)果表明，三線鐮刀菌F. tricinctum和木賊鐮刀菌F. equiseti未對(duì)沙棘植株表現(xiàn)出強(qiáng)致病力，接種后田間發(fā)病植株未出現(xiàn)枝枯病癥狀，這可能與本試驗(yàn)中分離獲得的鐮刀菌種類較少有關(guān)，應(yīng)進(jìn)一步深入研究。

鐮刀菌是一類分布廣泛的真菌，可侵染多種植物，造成植物萎蔫甚至死亡，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[17]。鐮刀菌還可分泌多種毒素，如單端孢霉烯真菌毒素、玉米赤霉烯酮毒素[18]。這2種毒素是谷類飼料和青貯料中普遍存在的霉菌毒素，與人類的健康關(guān)系密切，能引發(fā)糧食中毒癥、食物中毒性白細(xì)胞缺乏（ATA）、樹節(jié)孢霉中毒癥等[19]。植物內(nèi)生真菌對(duì)多種植物病菌具有專一拮抗作用，現(xiàn)已成為生物防治中主要的微生物農(nóng)藥，對(duì)病原菌具有較好的拮抗作用[20]。目前，生物防治是綠色防控鐮刀菌病害的主要方法。例如，芽孢桿菌對(duì)鐮刀菌病害的防控效果較好，并且能夠?qū)χ参锏纳L(zhǎng)起到促進(jìn)作用[21]。

在不同碳源、氮源處理中，沙棘枝枯病的致病菌擬枝孢鐮刀菌在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)最佳，最適氮源為酵母浸膏；利于產(chǎn)孢的最適碳源為蔗糖，最適氮源為甘氨酸。前人研究結(jié)果表明：分離自紫花苜蓿根腐病的致病菌擬枝孢鐮刀菌的最適生長(zhǎng)碳源為葡萄糖，最適氮源為蛋白胨；在光暗交替的條件下，其菌絲生長(zhǎng)最好，光照條件下最有利于該病原菌產(chǎn)孢[22-23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，沙棘枝枯病病原菌擬枝孢鐮刀菌在25 ℃時(shí)產(chǎn)孢量最高，與浙江蓮藕腐爛病菌的最適產(chǎn)孢溫度相同[24]。在研究光照對(duì)病原菌生長(zhǎng)影響的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，全黑暗的條件利于擬枝孢鐮刀菌G1-5-1 菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)孢。因條件有限，本試驗(yàn)中僅以甘肅慶陽地區(qū)的發(fā)病沙棘為研究對(duì)象，為有效防控沙棘枝枯病，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)不同品種、不同地區(qū)的發(fā)病沙棘進(jìn)行研究。