歐洲鰻肌肉蛋白營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)及體外模擬消化特性

孫夢(mèng)瑩，石林凡，2，3，任中陽(yáng)，2，3，陳 俊，2，3，郝更新，2，3，翁武銀，2，3*

（1 集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 福建廈門 361021 2 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心 福建廈門 361021 3 廈門市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建廈門 361021）

鰻鱺（Anguilla）是一種江河性洄游魚類，在全世界有19 種，其中日本鰻、歐洲鰻和美洲鰻屬于重要的養(yǎng)殖品種[1]。我國(guó)是鰻鱺養(yǎng)殖、生產(chǎn)和出口大國(guó)，2019年福建和廣東兩省的鰻鱺年產(chǎn)量高達(dá)20 萬(wàn)t[2]。

高蛋白和高脂肪是鰻鱺肌肉的主要特征[3]，對(duì)鰻鱺加工產(chǎn)品的品質(zhì)有重要影響。通常，富含油脂的鰻鱺主要被加工成烤鰻產(chǎn)品[4]。烤鰻加工中鰻鱺肌肉蛋白和脂質(zhì)不僅會(huì)發(fā)生分解和氧化反應(yīng)，而且彼此間會(huì)發(fā)生相互作用，影響鰻鱺加工產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。有研究報(bào)道，脂質(zhì)在熱加工中容易發(fā)生氧化，在脂質(zhì)次生氧化物的間接作用下蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)容易發(fā)生變化[5]。然而，關(guān)于加熱對(duì)鰻鱺肌肉蛋白消化特性的影響研究尚未見報(bào)道。

蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值主要取決于必需氨基酸的種類、含量和組成，以及蛋白質(zhì)消化和代謝的量，而吸收的氨基酸可以調(diào)節(jié)機(jī)體的新陳代謝[6-7]。Zhou 等[8]研究加熱處理對(duì)金華火腿肌原纖維蛋白體外模擬消化的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)100 ℃加熱的火腿中肌原纖維蛋白消化率高于70 ℃處理的火腿，而低于120 ℃處理的火腿。適度加熱促進(jìn)蛋白多肽鏈的展開，而過(guò)度加熱導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)和聚集，對(duì)蛋白質(zhì)的消化率和生物活性產(chǎn)生影響[9]。還有研究表明，過(guò)度加熱導(dǎo)致食源性碳量子點(diǎn)的形成，抑制胃蛋白酶和胰蛋白酶的活性，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的消化[10]。

目前鰻鱺加工產(chǎn)品主要是烤鰻，產(chǎn)品單一且以出口為主。鰻鱺產(chǎn)業(yè)抵御市場(chǎng)的風(fēng)險(xiǎn)能力非常薄弱。有關(guān)鰻鱺加工的研究主要集中在鰻鱺產(chǎn)品的質(zhì)量安全和監(jiān)控等方面。鰻鱺肌肉蛋白的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)鮮有報(bào)道。本研究以歐洲鰻為原料，評(píng)價(jià)鰻鱺肌肉蛋白的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，以及加熱對(duì)鰻鱺蛋白消化特性的影響，旨在為研發(fā)高品質(zhì)的鰻鱺熱加工產(chǎn)品提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

歐洲鰻購(gòu)于當(dāng)?shù)厮a(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)。乙腈及甲醇，美國(guó)INC 公司；鄰苯二甲醛、氯甲酸-9-芴甲基酯，美國(guó)Agilent 公司；鹽酸、胰酶、胃蛋白酶，中國(guó)上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulphate，SDS）、丙烯酰胺，美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200 高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent 公司；AI600 多色熒光凝膠成像儀，美國(guó)GE Healthcare公司；Avanti J-25 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司；SK-SO35 多功能蒸汽焗爐，日本山崎（國(guó)際）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鰻鱺肌肉蛋白的提取 鰻鱺水溶性蛋白（water-soluble protein，WP）的提取參考Zheng 等[11]的方法。取鰻鱺白肉切成小塊，按質(zhì)量體積比為1 ∶15 加入蒸餾水后進(jìn)行勻漿，利用高速冷凍離心機(jī)離心，獲得的上清液在碎冰上靜置并去除凍結(jié)的油脂，經(jīng)冷凍干燥后制備成WP。鰻鱺鹽溶性蛋白（salt-soluble protein，SP）的提取參考了Bertram等[12]的方法。將上述離心后的沉淀加入與20 mmol/L PBS（pH 7.0）混合配制為50 g/L 的溶液并進(jìn)行勻漿，再次離心，獲得的沉淀和0.6 mol/L KCl溶液混合配制為100 g/L 的溶液并勻漿，離心后收集上清液，用蒸餾水透析除鹽，冷凍干燥后制備成SP。

1.3.2 鰻鱺油脂的提取 鰻鱺油脂的提取參考Lin 等[13]的方法并稍作修改。取鰻鱺白肉切成小塊，按質(zhì)量體積比為1 ∶10 加入蒸餾水并進(jìn)行勻漿，沸水浴15 min 后進(jìn)行離心，在上清液中加入質(zhì)量濃度為20 g/L 的白色硅藻土，4 ℃保存120 min 后，再次離心，獲得的上清液冷凍干燥后作為本研究的鰻鱺油脂使用。

1.3.3 基本成分測(cè)定 水分測(cè)定參照GB 5009.3-2016 直接干燥法；粗蛋白質(zhì)測(cè)定參照GB 5009.5-2016 凱氏定氮法；粗脂肪測(cè)定參照GB 5009.6-2016 索氏抽提法；灰分測(cè)定參照GB 5009.4-2016馬福爐灼燒法。

1.3.4 氨基酸組成分析及其營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

1.3.4.1 氨基酸組成的測(cè)定 參照Shi 等[14]報(bào)道

的氨基酸測(cè)定方法。樣品用6 mol/L HCl 溶解，在充滿氮?dú)獾南苤杏?10 ℃消化22 h，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去酸后再用0.02 mol/L HCl 溶解，經(jīng)0.22 μm 水系膜過(guò)濾后，利用高效液相色譜儀測(cè)定樣品的氨基酸組成。色譜柱為Agilent Zorbox Eclipse AAA 柱（4.6 mm×150 mm）；流動(dòng)相A 為40 mmol/L的磷酸二氫鈉（pH 7.8），流動(dòng)相B 為有機(jī)相（乙腈∶甲醇∶超純水=45∶55∶10，V/V）；流速為2 mL/min，梯度洗脫；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為338.10 nm 和262.16 nm。其中，色氨酸采用堿水解后再利用高效液相色譜儀測(cè)定。

1.3.4.2 氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià) 根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織（food and agriculture organization of the united nations/world health organization，F(xiàn)AO/WHO） 推薦的氨基酸評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模式和雞蛋蛋白質(zhì)的氨基酸模式，分別按以下公式計(jì)算氨基酸評(píng)分（essential amino acid scores，EAAS）、必需氨基酸指數(shù)（essential amino acid index，EAAI）、生物價(jià)（biological value，BV）和蛋白質(zhì)效率比（protein efficiency ratio，PER）[15]。

式中：n——比較的EAA 個(gè)數(shù)；a，b，c，...，h——待評(píng)蛋白質(zhì)的EAA 含量（g/100g）；ae，be，ce，...，he——雞蛋蛋白質(zhì)相應(yīng)的EAA 含量（g/100g）。

1.3.5 模擬烤鰻加熱處理 將WP 和SP 分別與油脂按照鰻鱺肌肉基本成分組成的比例（脂肪20%、蛋白15%和水分65%）混合后，模擬烤鰻的加熱條件（80 ℃烘烤10 min，然后95 ℃蒸煮5 min，最后90 ℃烘烤3 min），對(duì)鰻鱺肌肉、WP 和SP 進(jìn)行加熱，制備的樣品冷卻至室溫后供以下試驗(yàn)使用。

1.3.6 體外模擬消化 參照Cinq-Mars 等[16]的方法進(jìn)行體外模擬胃腸液消化試驗(yàn)。將樣品分散于pH 1.5 的鹽酸水溶液中，配制的樣品溶液按質(zhì)量比3∶100（酶/蛋白）加入胃蛋白酶，混勻后在37 ℃恒溫振蕩水槽中酶解60 min。獲得的模擬胃消化液利用1 mol/L NaOH 將消化液的pH 值調(diào)至7.5，按質(zhì)量比4 ∶100（酶/蛋白）加入胰酶，混勻后在37 ℃恒溫振蕩水槽中酶解60 min。在消化過(guò)程中對(duì)消化液進(jìn)行電泳分析，并對(duì)消化產(chǎn)物的游離氨基酸進(jìn)行分析。

1.3.6.1 Tricine-SDS-PAGE 利用含有2% SDS、8 mol/L 尿素和20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）的蛋白變性劑溶解消化產(chǎn)物，根據(jù)Sch?gger[17]報(bào)道的方法進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE 分析。

1.3.6.2 游離氨基酸的測(cè)定 游離氨基酸的測(cè)定參照Liu 等[18]報(bào)道的方法并稍作修改。樣品溶液加入相同體積100 g/L 磺基水楊酸，混勻后室溫靜置120 min，離心后獲得的上清液于55 ℃下濃縮蒸干，再用0.02 mol/L HCl 溶解，按照1.3.4.1 節(jié)的方法對(duì)氨基酸組成進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 17.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA 方差分析，顯著性檢驗(yàn)方法為Duncan 多重檢驗(yàn)，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰻鱺肌肉組分分析

表1顯示了鰻鱺肌肉的基本成分。除了水分以外，鰻鱺肌肉中脂肪含量最高，表明鰻鱺屬于多脂魚類，這與羅鳴鐘等[3]的研究結(jié)果類似。通常魚類肌肉的水分含量為73%～82%[19]。然而，在鰻鱺肌肉中水分含量卻只有67.06%，這可能是鰻鱺肌肉脂肪含量高達(dá)19.72%的緣故。也有研究表明，大西洋鮭魚肌肉脂肪含量越高的部位水分含量越低[20]。

表1 鰻鱺肌肉基本成分（%，濕重；n=3）Table 1 Compositions of eel muscle（%，wet weight；n=3）

2.2 氨基酸組成分析

蛋白質(zhì)的氨基酸組成是決定蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要依據(jù)，因此對(duì)鰻鱺肌肉及其WP 和SP 的氨基酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。在鰻鱺肌肉WP的EAA 中，賴氨酸占比最高，其次是亮氨酸。類似的趨勢(shì)也在鰻鱺SP 的EAA 中觀察到。除了纈氨酸和苯丙氨酸，SP 中的其它6 種EAA 占比都高于WP。有研究報(bào)道，賴氨酸可以促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育和礦物質(zhì)的吸收，進(jìn)而增強(qiáng)免疫力[21]，亮氨酸可以調(diào)節(jié)肌肉中蛋白質(zhì)的合成[22]。Mohanty 等[23]對(duì)27種食用魚類肌肉氨基酸進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冷水魚魚肉的賴氨酸高達(dá)16.1%，海水魚魚肉的亮氨酸高達(dá)10.4%，而黃鰭結(jié)魚的賴氨酸和亮氨酸分別為7.6%和9.4%，與鰻鱺肌肉最接近，這可能是黃鰭結(jié)魚和鰻鱺都屬于淡水魚的緣故。鰻鱺肌肉EAA 介于WP 和SP 之間。鰻鱺肌肉中EAA 占總氨基酸比例達(dá)到37.81%，高于FAO/WHO（2013）的成人氨基酸標(biāo)準(zhǔn)模式（27.60%），說(shuō)明鰻鱺肌肉是滿足成人食用的優(yōu)質(zhì)蛋白。鰻鱺肌肉的必需氨基酸指數(shù)（EAAI）為84.27，高于其它魚類如草魚（72.43）[24]，表明鰻鱺肌肉的必需氨基酸組成較為合理，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。根據(jù)EAAI 值的結(jié)果，還可以發(fā)現(xiàn)鰻鱺SP 的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高于WP。蛋白質(zhì)對(duì)人體的BV 與EAA 的含量密切相關(guān)，因此p-BV 值大小趨勢(shì)與EAAI 相同。通常，PER 大于2.0 被認(rèn)為是高質(zhì)量的蛋白質(zhì)，1.5～2.0 為中等質(zhì)量的蛋白質(zhì)，而小于1.5 則認(rèn)為低質(zhì)量的蛋白質(zhì)[25]。鰻鱺肌肉的p-PER 為1.93，與羅非魚（1.93）相近[26]，低于鯖魚與鯡魚[27]。這是由于歐洲鰻養(yǎng)殖在淡水中，因此其肌肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與淡水魚相近，但是，SP 的p-PER 高達(dá)3.90，可以與海水魚類蛋白相媲美。

表2 鰻鱺肌肉及其分離蛋白的氨基酸組成、必需氨基酸指數(shù)（EAAI）、蛋白質(zhì)效率比（p-PER）和生物價(jià)（p-BV）（g/100 g，蛋白干重；n=3）Table 2 Amino acid profiles，essential amino acid index（EAAI），predicted protein efficiency ratio（p-PER），and predicted biological value（p-BV） of eel muscle and its isolated protein（g/100 g，dry weight basis；n=3）

參考FAO/WHO（2013）的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸模型，對(duì)鰻鱺肌肉及其提取蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如表3所示。WP 的第一限制氨基酸為甲硫氨酸+半胱氨酸，鰻鱺肌肉和SP 中的第一限制氨基酸為纈氨酸。除苯丙氨酸+酪氨酸外，SP 中必需氨基酸評(píng)分（EAAS）均高于WP，鰻鱺肌肉EAAS 介于WP 和SP 之間。鰻鱺肌肉的EAAS 評(píng)分最高的為色氨酸，據(jù)報(bào)道，色氨酸可以增強(qiáng)人體的免疫能力，其代謝產(chǎn)物褪黑素更是具有抗氧化和抗衰老等多種生理功能[28]。值得注意的是，除色氨酸外，苯丙氨酸+酪氨酸的評(píng)分也很高，結(jié)果表明鰻鱺肌肉必需氨基酸均衡性好。

表3 鰻鱺肌肉及其分離蛋白的必需氨基酸評(píng)分（EAAS，%）Table 3 Essential amino acid scores（EAAS，%）of eel muscle and its isolated protein

2.3 體外模擬消化

2.3.1 Tricine-SDS-PAGE 利用Tricine-SDSPAGE 對(duì)鰻鱺蛋白的體外模擬消化過(guò)程進(jìn)行評(píng)價(jià)（圖1）。鰻鱺WP 分子質(zhì)量為12～97 ku 范圍內(nèi)可觀察到多條清晰的蛋白條帶。當(dāng)WP 經(jīng)胃蛋白酶消化15 min 后，只有97，55，45 和12 ku 及以下出現(xiàn)較淡的蛋白條帶。伴隨消化時(shí)間的延長(zhǎng)，SDS-PAGE 中的蛋白條帶數(shù)量逐漸減少（圖1a）。當(dāng)模擬胃消化產(chǎn)物經(jīng)胰酶消化15 min 后，僅在55 ku 處出現(xiàn)較淡的蛋白條帶。當(dāng)鰻鱺SP 經(jīng)胃蛋白酶消化15 min 后，大于100 ku 的蛋白條帶立即消失（圖1b）。隨著胃蛋白酶消化時(shí)間的延長(zhǎng)，除了80 ku 附近的蛋白條帶以外其它蛋白條帶逐漸變淡。當(dāng)模擬胃消化產(chǎn)物經(jīng)胰酶消化后，30 ku 以上的蛋白條帶迅速消失，30 ku 以下的涂布狀條帶隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸變淡。這些結(jié)果表明，WP比SP 更容易被胃蛋白酶消化降解。Minkiewicz 等[29]在比較鯉魚肌肉的肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的體外模擬消化時(shí)，也發(fā)現(xiàn)肌漿蛋白比肌原纖維蛋白容易消化。鰻鱺肌肉除了WP 和SP 以外，還富含膠原蛋白，因此伴隨胃蛋白酶的消化，膠原蛋白逐漸明膠化并溶解出來(lái)，在SDS-PAGE 中會(huì)呈現(xiàn)出一些與WP 和SP 消化不一樣的蛋白條帶（圖1c）。然而，這些蛋白條帶在胰酶消化中也都逐漸消失。

鰻鱺WP 和SP 與油脂混合后經(jīng)過(guò)加熱后，體外模擬消化的結(jié)果如圖1c，1d，1f 所示。加熱后的WP 在SDS-PGAE 中只出現(xiàn)小于10 ku 的蛋白條帶，但隨胃蛋白酶的消化蛋白條帶數(shù)量先增加后減少（圖1d）。這可能是在與油脂加熱過(guò)程中WP出現(xiàn)聚集和交聯(lián)，但在胃蛋白酶消化中逐漸溶解出來(lái)。然而，與油脂共同加熱的WP 明顯比未加熱的WP 不易被胃蛋白酶消化（圖1a 和1d）。雖然SP 與油脂加熱后沒有出現(xiàn)WP 那樣產(chǎn)生大分子，但是與油脂共同加熱的SP 在胃蛋白酶消化中比未加熱的SP 多了一些蛋白條帶（圖1e）。模擬胃消化產(chǎn)物經(jīng)胰酶消化后，WP 只有在55 ku 附近存在一些蛋白條帶，而SP 卻出現(xiàn)更多的蛋白條帶。這些結(jié)果表明了與油脂共同加熱后，SP 還是比WP 不容易消化。相對(duì)于未加熱的鰻鱺肌肉，經(jīng)過(guò)加熱的鰻鱺肌肉也出現(xiàn)了WP、SP 與油脂共加熱類似的現(xiàn)象（圖1f）。

圖1 鰻鱺肌肉及其蛋白體外模擬消化產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE 圖譜Fig.1 Tricine-SDS-PAGE patterns of in vitro digested products of eel muscle and its isolated protein

2.3.2 游離氨基酸 對(duì)鰻鱺肌肉及其蛋白體外模擬消化產(chǎn)物中的游離氨基酸組成進(jìn)行分析，結(jié)果如表4所示。未加熱的WP 和SP 經(jīng)體外模擬消化后，其消化產(chǎn)物中都有高含量的亮氨酸和苯丙氨酸等游離氨基酸。WP 消化產(chǎn)物中還富含精氨酸和賴氨酸，而SP 消化產(chǎn)物中富含丙氨酸和酪氨酸。亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸為必需氨基酸，精氨酸和酪氨酸則屬于半必需氨基酸，而且丙氨酸常用作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，它們?cè)跈C(jī)體免疫能力的增強(qiáng)、肌肉蛋白的合成與分解中起到重要的作用[22，30-32]。同樣，在鰻鱺肌肉模擬消化產(chǎn)物中主要游離氨基酸也是精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和賴氨酸，占游離氨基酸總量的66.60%，表明這些游離氨基酸可能可以作為評(píng)價(jià)鰻鱺肌肉消化產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)。

不管鰻鱺肌肉WP，還是鰻鱺肌肉SP，它們與油脂共同加熱再經(jīng)過(guò)體外模擬消化后，模擬消化產(chǎn)物中的游離氨基酸總量均出現(xiàn)一定程度的增加，表明加熱后可以促進(jìn)蛋白消化。Semedo 等[33]研究蒸煮、烘烤和油炸對(duì)魚肉體外模擬消化影響時(shí)，也發(fā)現(xiàn)不管采用哪種加熱方式加熱后的魚肉都更容易被消化。而且，加熱會(huì)使鰻鱺肌肉蛋白消化產(chǎn)物中的酪氨酸含量出現(xiàn)一定程度的下降（表4），這可能是魚肉在熱加工中形成的食源性碳量子點(diǎn)抑制了酪蛋白的消化[10]。值得注意的是，經(jīng)過(guò)加熱后模擬消化產(chǎn)物中的主要游離氨基酸的比例都出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)，也表明鰻鱺肌肉蛋白與油脂共同加熱后會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)價(jià)值出現(xiàn)一定程度的下降。

表4 鰻鱺肌肉及其蛋白體外模擬消化產(chǎn)物的游離氨基酸組成（g/100 g，干重；n=3）Table 4 Free amino acid in vitro digested products of eel muscle and its isolated protein（g/100 g dry weight；n=3）

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)鰻鱺肌肉WP 和SP 的氨基酸組成分析，利用體外模擬消化分析蛋白與油脂加熱前后的消化特征。結(jié)果表明，鰻鱺WP 中精氨酸含量明顯高于SP，而SP 中必需氨基酸和呈味氨基酸高于WP，且SP 的氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高于WP。不管是加熱還是未加熱，鰻鱺肌肉WP 均比SP 容易被消化。經(jīng)過(guò)加熱后，蛋白模擬消化產(chǎn)物中游離氨基酸占比明顯增加，表明加熱可以促進(jìn)鰻鱺肌肉蛋白質(zhì)的消化降解。然而，根據(jù)模擬消化產(chǎn)物的游離氨基酸的分析結(jié)果，表明加熱會(huì)導(dǎo)致鰻鱺肌肉蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值下降。