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    大蒜硫醚對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的抑制作用

    2022-07-19 12:03:14檀德宏吳朝霞紀(jì)淑娟
    中國食品學(xué)報(bào) 2022年6期
    關(guān)鍵詞:硫醚氫鍵大蒜

    呂 航,可 欽,檀德宏,周 倩,吳朝霞,紀(jì)淑娟,白 冰*

    (1 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 沈陽 110866 2 赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院 內(nèi)蒙古赤峰 024005)

    大蒜為百合科蔥屬植物。大蒜不僅是重要的調(diào)味品,還具有抗氧化[1-2]、抗菌[3]、抗炎[4-5]、抗癌[6]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[7-8],調(diào)節(jié)血糖[9]、血脂[10]、降壓[11]等功能。研究表明,大蒜的生物活性主要是源自于其含量較高的有機(jī)硫化物,目前在大蒜中檢測出30多種硫化物[12]。其中大蒜油是一種揮發(fā)油,主要由一些揮發(fā)性硫化物組成,包括二烯丙基二硫醚(Diallyl Disulfide,DADS)、二烯丙基三硫醚(Diallyl Trisulfide,DATS)[13]。

    葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glucose 6 Phosphate Dehydrogenase,G6PD)是戊糖磷酸途徑的限速酶,可催化D-葡萄糖-6-磷酸氧化為6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯。戊糖磷酸途徑可提供增殖所需的核苷酸前體和NADPH,在腫瘤細(xì)胞增殖過程中,G6PD 的表達(dá)都是上調(diào)的,以滿足腫瘤細(xì)胞的生長需要[14-16]。G6PD 在腫瘤細(xì)胞中的過表達(dá)和活性增加,進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤組織的快速擴(kuò)張[17-19]。對G6PD 活性的抑制成為控制腫瘤增殖的一種重要方式,因此對G6PD 抑制劑的研究也日漸增多。類固醇類抑制劑,如脫氫表雄甾酮(DHEA)[20]、表雄甾酮(EA)[21]等被證實(shí)可抑制G6PD 活性。來自大蒜的脂溶性硫化物DADS 和DATS 對G6PD 的抑制研究目前鮮有報(bào)道。

    本研究以大蒜油的主要成分DADS/DATS 為研究對象,利用分子熒光實(shí)時(shí)監(jiān)測技術(shù)揭示DADS/DATS 對G6PD 的活性具有部分抑制效果。以酶動(dòng)力學(xué)原理分析其抑制類型,采用分子熒光光譜揭示DADS/DATS 對G6PD 的熒光淬滅機(jī)制,并分析結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)和相互作用力。利用3D 和2D 分子對接技術(shù)印證DADS/DATS 對G6PD 的作用力種類和結(jié)合方式。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器

    大蒜(白皮大蒜),沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場;大蒜油(提取自大蒜),沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院食品化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供;二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚(優(yōu)級純),美國Sigma 公司;葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(150 U/mg,微生物來源),上海源葉公司;D-葡萄糖-6-磷酸,上海麥克林公司;氧化型輔酶NAD,北京索萊寶公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純,國藥公司。

    7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,安捷倫科技有限公司;F-4600 分子熒光光譜儀,日本日立公司;紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用公司;XMTD-8222 型電熱恒溫水浴鍋,上海精宏公司;FA224 電子天平,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C 型pH 計(jì),上海儀電公司;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海中光儀器儀表有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 大蒜油的提取 提取方法參照文獻(xiàn),略有改動(dòng)[22]。新鮮大蒜去皮洗凈搗碎,取適量蒜泥,40 ℃pH 6.5 條件下使大蒜內(nèi)蒜氨酸和蒜氨酸酶充分反應(yīng)1 h。按料液比1∶4(V/V)加入無水乙醇,40 ℃下超聲提取30 min,過濾并濃縮得到大蒜油。

    GC-MS 方法參照文獻(xiàn),略有改動(dòng)[23]:色譜柱:DB-17MS(30 m×0.25 μm);載氣:He(純度99.999%);EI 離子源溫度:230 ℃;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;監(jiān)測器溫度:250 ℃;程序升溫條件:90 ℃保持1 min,10 ℃/min 速度升溫至250 ℃;樣品濃度:1 μL/L;進(jìn)樣量:1 μL;不分流模式。

    1.2.2 大蒜油、DADS、DATS 對G6PD 活性的影響 通用Tris-HCl 緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.5)。大蒜油/DADS/DATS 經(jīng)乙醇溶解,分別配制成大蒜油(50~200 μL/mL)、DADS/DATS(1.25~5 mmol/L)。G6PD(0.1 mg/mL)分別與大蒜油/DADS/DATS 以1 ∶1(V/V)混勻,37 ℃水浴30 min,作為酶處理液。

    G6PD 酶活測定體系,Tris-HCl 緩沖液400 μL、D-葡萄糖-6-磷酸100 μL(0.03 mg/mL)、NAD溶液20 μL(10 mg/mL),最后加入酶處理液40 μL,加蓋搖勻,迅速放入分子熒光光譜儀,激發(fā)波長350 nm,每5 s 記錄460 nm 熒光強(qiáng)度,連續(xù)測定195 s。

    1.2.3 DADS、DATS 對G6PD 抑制類型分析 反應(yīng)體系,Tris-HCl 緩沖液120 μL、D-葡萄糖-6-磷酸50 μL(0.01~0.05 mg/mL),NAD 溶液10 μL(10 mg/mL),最后加入酶處理液20 μL,加蓋搖勻,立即監(jiān)測340 nm 處吸光值。繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖,判定抑制類型。

    1.2.4 DADS、DATS 對G6PD 蛋白的熒光淬滅 G6PD(0.5 mg/mL)與DADS/DATS(0~5 mmol/L)等體積混合,分別在298,308,318 K 水浴10 min。取此溶液100 μL,加入Tris-HCl 緩沖液400 μL,加蓋搖勻,迅速放入分子熒光光譜儀,激發(fā)波長280 nm,掃描290~450 nm 范圍的熒光光譜。

    1.2.5 熒光淬滅機(jī)理分析 結(jié)合Stern-Volmer 方程(1),在298,308,318 K 下,以未處理的G6PD的熒光強(qiáng)度(F0)與加入DADS/DATS 后G6PD 的熒光強(qiáng)度(F)的比值對DADS/DATS 濃度([Q])作圖。

    式中:Ksv——淬滅常數(shù);Kq——淬滅速率常數(shù);τ——生物分子的平均熒光壽命(10-8s)。

    1.2.6 DADS、DATS 與G6PD 的結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù) 以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作圖,根據(jù)式(2)可求結(jié)合常數(shù)(Ka)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)。

    以lnKa對1/T 作圖,根據(jù)式(3)可求焓變?chǔ)、熵變?chǔ),由式(4)可求吉布斯自由能變?chǔ)。

    1.2.7 分子對接技術(shù) G6PD 晶體結(jié)構(gòu)取自PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(PDBID:2BHL),DADS、DATS 的分子結(jié)構(gòu)來自ZINC 數(shù)據(jù)庫(1531082,1633229)。利用軟件Autodock4.2 進(jìn)行分子對接,使用拉馬克遺傳算法,選擇自由能最低的結(jié)合模式分析,利用PYMOL 和LIGPLOT 軟件導(dǎo)出結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 大蒜油的GC-MS 分析

    圖1為大蒜油的總離子流圖和質(zhì)譜圖,主要包含2 種硫醚:DADS(圖1c 峰1)、DATS(圖1c 峰2)。DADS、DATS 保留時(shí)間分別為4.9,6.8 min。圖1a 和圖1b 分別為保留時(shí)間4.9,6.8 min 時(shí)的質(zhì)譜圖,質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了質(zhì)量/電荷比(m/z)為41,73,113,146,178 的主要碎片,m/z 41 對應(yīng)CH2=CHCH2-,m/z 73 對應(yīng)CH2=CH-CH2-S-。146(Ma)和178(Mb) 分別為DADS(C6H10S2,146) 和DATS(C6H10S3,178)的分子離子碎片。

    圖1 大蒜油總離子流圖(TIC)(c)及DADS(a)、DATS(b)的質(zhì)譜圖(MS)Fig.1 Total ion current chromatogram(TIC)(c) and mass spectrum(MS) of DADS(a),DATS(b)

    2.2 大蒜油/DADS/DATS 對G6PD 活性抑制作用

    如圖2a~2c 所示,利用分子熒光光譜儀實(shí)時(shí)監(jiān)測了大蒜油對G6PD 活性的影響,熒光強(qiáng)度與酶活成正比,發(fā)現(xiàn)50~200 μL/mL 的大蒜油具有部分抑制G6PD 活性作用。進(jìn)一步考察大蒜油主要成分DADS/DATS 對G6PD 活性的影響,1.25~5 mmol/L 的DADS/DATS 均具有抑制G6PD 活性的作用,且呈濃度依賴關(guān)系。

    圖2 不同濃度的大蒜油(a)、DADS(b)、DATS(c)對G6PD 活性影響Fig.2 Impact on G6PD activity of different concentrations of garlic oil(a),DADS(b),DATS(c)

    2.3 DADS/DATS 對G6PD 的抑制類型

    Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線,如圖3a 和3b,在反應(yīng)體系中加入不同濃度的DADS/DATS 后得到一簇斜率不同,交于第二象限的直線。交點(diǎn)未落在X 軸(非競爭性抑制)或者Y 軸(競爭性抑制),判斷DADS/DATS 對G6PD 的抑制類型為可逆抑制中的混合性抑制,即兼具競爭性抑制和非競爭性抑制。說明DADS/DATS 可通過兩種方式對G6PD 產(chǎn)生抑制:一種方式是與底物競爭G6PD 的結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生競爭性抑制,另一種方式是和G6PD的非活性部位結(jié)合形成復(fù)合物產(chǎn)生非競爭性抑制。

    圖3 DADS(a)/DATS(b)對G6PD 抑制的Lineweaver-Burk 圖Fig.3 Lineweaver-Burk plots for G6PD inhibition types of DADS(a)/DATS(b)

    2.4 DADS/DATS 對G6PD 的熒光淬滅

    圖4a 和4b 為298 K 時(shí)不同濃度的DADS/DATS 作用下的G6PD 的熒光光譜,隨著DADS/DATS 濃度(0~5 mmol/L)的增大,333 nm 處G6PD蛋白的熒光強(qiáng)度逐步降低,說明DADS/DATS 與G6PD 蛋白產(chǎn)生了相互作用,導(dǎo)致了熒光的淬滅。

    圖4 不同濃度的DADS(a)/DATS(b)作用下的G6PD 熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of G6PD with different concentrations of DADS(a)/DATS(b)

    2.5 DADS/DATS 對G6PD 的熒光淬滅機(jī)理

    熒光淬滅分為動(dòng)態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅,為判斷其淬滅類型,分別在298,308,318 K 3 個(gè)溫度下,以F0/F 對[Q](方程式1)作圖,繪制Stern-Volmer曲線,如圖5a 和5b。由曲線的斜率可求Ksv和Kq,列于表1。對于DADS/DATS 而言,隨著溫度的升高,Ksv值減小,且Kq值均大于淬滅劑對大分子物質(zhì)的最大碰撞速率常數(shù)2×1010mol/L/s。因此,DADS/DATS 對G6PD 蛋白的熒光淬滅屬于靜態(tài)淬滅。

    表1 不同溫度下DADS/DATS 與G6PD相互作用的KSV 和Kq 值Table 1 KSV and Kq values of the interaction between DADS/DATS and G6PD at different temperatures

    圖5 不同溫度下DADS(a)/DATS(b)與G6PD 相互作用的Stern-Volmer 曲線Fig.5 Stern-Volmer curves of the interaction between DADS(a)/DATS(b) and G6PD at different temperatures

    2.6 DADS/DATS 與G6PD 相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

    分別在298,308,318 K 3 個(gè)溫度下,以lg[(F0-F)/F]對lg[Q](方程式2)作圖,如圖6a 和6b。通過曲線截距和斜率可求DADS/DATS 與G6PD的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n,如表2。所有n 值均接近于1,說明DADS/DATS 和G6PD 之間存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在308,318 K 時(shí),DADS 的Ka值大于DATS 的Ka值,說明在308,318 K 時(shí),DADS 與G6PD 之間的結(jié)合力較強(qiáng)。

    圖6 不同溫度下DADS(a)/DATS(b)與G6PD 相互作用的雙對數(shù)曲線Fig.6 Double logarithmic curves of the interaction between DADS(a)/DATS(b)and G6PD at different temperatures

    表2 不同溫度下DADS/DATS 與G6PD相互作用的Ka 和n 值Table 2 Ka and n values of the interaction between DADS/DATS and G6PD at different temperatures

    2.7 DADS/DATS 與G6PD 相互作用的熱力學(xué)參數(shù)和作用力

    淬滅劑小分子與生物大分子之間可通過氫鍵、靜電作用力、疏水相互作用和范德華力等相互作用。可通過反應(yīng)的焓變?chǔ)、熵變?chǔ)、吉布斯自由能變?chǔ) 來判斷作用力類型。以lnKa對1/T(方程式3)作圖,如圖7a 和7b??赏ㄟ^曲線斜率和截距求出ΔH 和ΔS,再根據(jù)熱力學(xué)方程(方程式4)可求ΔG,熱力學(xué)參數(shù)列于表3。對于DADS,ΔH>0,且ΔS>0,說明DADS 和G6PD 主要是通過疏水相互作用結(jié)合的;對于DATS,ΔH<0,且ΔS<0,說明DATS 和G6PD 主要是通過氫鍵和范德華力結(jié)合的。ΔG 值均小于0,說明DADS/DATS 與G6PD 相互作用都是自發(fā)進(jìn)行的。

    表3 不同溫度下DADS/DATS 與G6PD作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of the interration between DADS/DATS and G6PD at different temperatures

    圖7 不同溫度下DADS(a)/DATS(b)與G6PD 相互作用的Van't Hoff 曲線Fig.7 Van't Hoff curves of the interaction between DADS(a)/DATS(b) and G6PD at different temperatures

    2.8 DADS/DATS 與G6PD 蛋白的分子對接

    進(jìn)一步利用分子對接技術(shù)解釋DADS/DATS與G6PD 的相互作用機(jī)制。在對接結(jié)果中選擇結(jié)合能最低的構(gòu)象作為最優(yōu),進(jìn)一步分析相互作用機(jī)制。結(jié)果表明DADS 和DATS 均可進(jìn)入G6PD分子內(nèi)部。其中DADS 與G6PD 結(jié)合能為-2.69 kcal/mol,結(jié)合性能較好,見表4。

    表4 DADS/DATS 與G6PD 蛋白分子對接的結(jié)合能Table 4 The binding energies of the docking of DADS/DATS and G6PD

    DADS 與G6PD 結(jié)合的3D 圖和2D 圖,如圖8a 和8b,揭示出DADS 與G6PD 蛋白結(jié)合位點(diǎn)周圍存在多個(gè)貢獻(xiàn)較大的氨基酸殘基。Ala-377、Val-376、Phe-216、Gly-222、Phe-221、Pro-223 等疏水性氨基酸殘基可通過疏水作用與DADS 結(jié)合,Arg-219、Asn-218、Lys-275、Arg-215、Trp-225等極性氨基酸殘基可通過靜電吸引與DADS 結(jié)合。

    圖8c 和8d 分別是DATS 與G6PD 結(jié)合的3D圖和2D 圖。同樣地,Phe-253、Gly-254、Ala-335、Ile-472、Ile-255、Leu-469、Leu-305 等疏水性氨基酸殘基與Arg-175、Lys-476、Arg-257、Thr-334、Thr-333、Glu-473 等極性氨基酸殘基,分別對DATS 形成疏水作用和靜電吸引;且Phe235 還可與DATS 中心位置的S 形成氫鍵,鍵長為3.2?,作用力以氫鍵為主。這些結(jié)果與熱力學(xué)分析表明的DADS/DATS 和G6PD 相互作用的結(jié)論相吻合。因此,DADS 與G6PD 通過疏水作用和靜電吸引等方式實(shí)現(xiàn)相互作用的,以疏水相互作用為主;DATS與G6PD 通過疏水作用、靜電吸引、氫鍵等方式實(shí)現(xiàn)相互作用,以氫鍵為主,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)DADS/DATS對G6PD 活性的抑制。

    圖8 DADS 和DATS 分別與G6PD 相互作用的分子對接圖Fig.8 Molecular docking of G6PD interacted with DADS and DATS

    3 結(jié)論

    本研究從大蒜中提取了大蒜油并通過酶活實(shí)時(shí)監(jiān)測、酶動(dòng)力學(xué)分析、熒光光譜法以及分子對接等技術(shù)研究了DADS/DATS 與G6PD 蛋白的相互作用機(jī)制。結(jié)果表明,DADS/DATS 均可部分抑制G6PD 的活性,且該抑制作用屬于混合性抑制;DADS/DATS 均可使G6PD 蛋白產(chǎn)生內(nèi)源熒光淬滅,且為靜態(tài)淬滅;分子熒光光譜和3D/2D 分子對接技術(shù)共同揭示了DADS 與G6PD 以疏水作用和靜電力相互作用,且以疏水作用為主,DATS 與G6PD 蛋白以疏水作用、靜電力和氫鍵相互作用,且以氫鍵為主。

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