局部晚期宮頸癌組織Notch通路蛋白表達(dá)與以順鉑為基礎(chǔ)的子宮動脈介入栓塞有效性的關(guān)系

皇甫政彤

局部晚期宮頸癌(LACC)是一種發(fā)病率僅次于乳腺癌的宮頸癌，在婦科惡性腫瘤中較為常見，我國也是宮頸癌高發(fā)的國家，每年新發(fā)病的患者約10萬，死亡率在60%，并且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，Ⅱb～Ⅳa期宮頸癌統(tǒng)稱為局部晚期宮頸癌[1]。Notch信號通路是一種參與機(jī)體及組織分裂更新活動的重要手段，Notch信號通路主要是參與機(jī)體以及組織分裂的活動，結(jié)構(gòu)具有保守性，在細(xì)胞的增生分裂過程中，發(fā)揮重要的作用，并且促進(jìn)上皮組織物質(zhì)交換速度。臨床研究表明子宮動脈介入栓塞是Ⅱb期以上中晚期宮頸癌首選的治療方法，但隨著該方法的廣泛應(yīng)用，栓塞藥物耐藥性的問題也日益突出[2]。有研究指出[3]，人體大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)展與自身Notch信號通路存在密切聯(lián)系。為了進(jìn)一步探討、驗(yàn)證LACC組織Notch通路蛋白表達(dá)與以順鉑為基礎(chǔ)的子宮動脈介入栓塞有效性的關(guān)系，本研究選取98例LACC患者和95例宮頸良性腫瘤患者開展對照研究，詳情如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，選取本單位2019年4月至2020年7月收治的98例LACC患者和95例宮頸良性腫瘤患者，分別記為惡性組和良性組。惡性組年齡30～69歲，平均(52.95±4.55)歲，其中62例年齡≥50歲，36例<50歲；臨床分期Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳa期分別為35、15、29、19例；最大腫瘤直徑4～10 cm，平均(5.45±0.95)cm，其中最大腫瘤直徑≥6 cm 56例；未分化16例、低分化31例、中分化33例、高分化18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例；治療情況：全身化療53例，放射治療45例。良性組年齡42～78歲，平均(53.11±4.65)歲，其中年齡≥50歲者60例，<50歲者35例；子宮肌瘤43例、卵巢囊腫30例、卵巢囊腺瘤22例。通過對比2組間數(shù)據(jù)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①惡性組符合局部晚期宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，良性組均為宮頸良性腫瘤患者；②患者的肌瘤的血供為:極富血流型、富血流型、一般血流型；③均簽署本研究知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重的精神疾病、認(rèn)知障礙等；②合并有心、肺、肝、腎等疾?。虎刍加懈腥拘约膊?，如肺炎、肝炎、流感等；④合并慢性病，如慢性呼吸系統(tǒng)疾病、糖尿病等；⑤合并乳腺癌、胃癌、肺癌等其他惡性腫瘤；⑥非富血流型肌瘤，肌瘤有較大間變、鈣化、壞死等，帶蒂的漿膜下肌瘤、闊韌帶肌瘤。

1.2 方法

蛋白表達(dá)檢測方法：主要試劑鼠抗人Notch1、Hes-1、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)單克隆抗體、酶標(biāo)記的兔抗鼠Notch1、Hes-1、CyclinD1多克隆抗體，MaxVisionTM試劑盒二步法免疫組化、二氨基聯(lián)苯胺法(DAB)顯色試劑盒購自愛必信上海生物科技有限公司，0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=7.5)、國產(chǎn)分析純試劑0.02 moL/L的枸椽酸鹽抗原修復(fù)液(pH=6.0)，采用雙蒸水配置。95例宮頸良性腫瘤組織在術(shù)中切取，98例LACC組織在治療前活檢獲取。所有組織樣板石蠟包埋，制片；采用二步法進(jìn)行染色，按試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。以已知標(biāo)準(zhǔn)片作為陽性對照，用磷酸緩沖液作陰性對照。判斷結(jié)果:采用雙盲法對光學(xué)顯微鏡下Notch1、Hes-1、CyclinD1染色的組織標(biāo)本進(jìn)行評估，當(dāng)出現(xiàn)黃色顆粒為陽性細(xì)胞；并觀察陽性細(xì)胞色度，根據(jù)百分比得分，陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0；陽性細(xì)胞數(shù)當(dāng)≥5%且<25%為1；當(dāng)陽性細(xì)胞數(shù)≥25%且<50%為2；當(dāng)陽性細(xì)胞數(shù)≥50%且<75%為3；染色強(qiáng)度的評分標(biāo)準(zhǔn)：不著色記為0分，藍(lán)色或黃色記為1分，紫藍(lán)色或棕黃色記為2分，藍(lán)黑色或黃褐色記為3分；根據(jù)兩者總分0～1為(-)，2～3弱陽性為(+)，4～5中度陽性為(++)，6～7強(qiáng)陽性為(+++)；陰性為(-)，陽性為(+～+++)。

介入栓塞：在腹股溝區(qū)進(jìn)行消毒鋪巾，局麻后，采用Seldinger技術(shù)穿刺一側(cè)股動脈，置導(dǎo)管鞘，在數(shù)字減影血管造影術(shù)透視下將Cobra 4-5F導(dǎo)管插入雙側(cè)骼內(nèi)動脈造影，采用碘佛醇或碘比醇對比劑，在腫瘤血供后，操作側(cè)動脈插管，導(dǎo)管成樣后，進(jìn)行同側(cè)操作。按腫瘤供血分配比例灌注藥物，瘤體滋養(yǎng)動脈栓塞，針對Ⅳa期直腸侵犯的病例加做腸系膜下動脈插管灌注化療。栓塞治療后，若進(jìn)行造影復(fù)查時(shí)發(fā)現(xiàn)靶動脈封鎖，未出現(xiàn)對比劑溢出，患者出血情況好轉(zhuǎn)，患者血紅蛋白指標(biāo)上升，則視為栓塞有效。以順鉑為基礎(chǔ)栓塞劑由直徑1 mm的明膠海綿顆粒和絲裂霉素或表柔比星以及對比劑充分混合制成，用量依據(jù)腫瘤體積而定；透視監(jiān)控下的栓塞，以不出現(xiàn)栓塞劑返流為宜。

癌組織中Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白陽性表達(dá)與介入栓塞治療有效性的關(guān)系分析方法：總結(jié)可能影響介入栓塞治療有效性的因素，包括性別、年齡、臨床分期、腫瘤直徑、分化程度、Notch1蛋白陽性表達(dá)、Hes-1蛋白陽性表達(dá)、CyclinD1蛋白陽性表達(dá)等，將其作為自變量，將介入栓塞治療效果作為因變量，分析2種變量的臨床關(guān)系。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)惡性組與良性組Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白表達(dá)。(2)惡性組介入栓塞的效果，完全緩解：肉眼觀察目標(biāo)腫塊完全消退；目標(biāo)腫塊體積縮小50%以上為部分緩解；腫瘤病灶的兩徑乘積縮小不足50%或增大不超過25%為病情穩(wěn)定；腫瘤病灶的兩徑乘積增大25%以上或者出現(xiàn)新病灶為病情進(jìn)展。完全緩解和部分緩解記為有效[5]。(3)分析惡性組癌組織Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白陽性表達(dá)與介入栓塞治療有效性的關(guān)系，統(tǒng)計(jì)介入栓塞治療無效的影響因素，并記錄各項(xiàng)因素的相對危險(xiǎn)度(OR)及95%置信區(qū)間(95%CI)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 惡性組與良性組Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白表達(dá)比較

惡性組與良性組Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白表達(dá)對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，惡性組Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白陽性表達(dá)率均高于良性組(P<0.05)，見表1、表2。

表1 惡性組與良性組Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白表達(dá)對比(例，%)

2.2 統(tǒng)計(jì)惡性組介入栓塞的效果

惡性組完全緩解21例，部分緩解30例，病情穩(wěn)定27例，病情進(jìn)展20例，惡性組以順鉑為基礎(chǔ)的子宮動脈介入栓塞無效率為47.96%(47/98)。

表2 惡性組與良性組Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白陽性表達(dá)率(例,%)

2.3 惡性組癌組織Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白陽性表達(dá)與介入栓塞治療有效性的關(guān)系

≥Ⅲb期、腫瘤直徑、未/低分化、癌組織Notch1蛋白陽性表達(dá)、癌組織Hes-1蛋白陽性表達(dá)、癌組織CyclinD1蛋白陽性表達(dá)均是影響惡性組介入栓塞治療效果的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表3，表4。

表3 惡性組介入栓塞治療效果的可能因素對比(例，%)

表4 惡性組介入栓塞治療效果的影響因素Logistic多元回歸分析

3 討論

LACC狹義的概念是指癌灶直徑≥4 cm的早期宮頸癌，由于腫瘤的體積較大，沒有經(jīng)過術(shù)前的治療而進(jìn)行手術(shù)，可能會導(dǎo)致病灶殘留，并且會出現(xiàn)較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及并發(fā)癥發(fā)生率。目前宮頸癌獲得治愈最有效的方法是手術(shù)根治性切除，其可以提高患者的遠(yuǎn)期生存率，而對于局部腫塊伴有周圍浸潤以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，往往會出現(xiàn)術(shù)后治療無效的情況。本研究發(fā)現(xiàn)以順鉑為基礎(chǔ)的子宮動脈介入栓塞無效率為47.96%，與劉保清等的報(bào)道結(jié)果接近[6]，提示以順鉑為基礎(chǔ)的子宮動脈介入栓塞治療效果不佳，因此需要進(jìn)一步探討影響介入栓塞治療無效的因素。

本研究發(fā)現(xiàn)惡性組Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白陽性表達(dá)率均高于良性組，提示在LACC患者中Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白陽性表達(dá)偏高。Notch是一種信號通路蛋白，可以通過氧化反應(yīng)，進(jìn)而合成一種限速酶類，增加花生四烯酸合成前列腺素的速度。有研究指出，Notch1在宮頸癌患者機(jī)體生理病變中發(fā)揮著重要的作用[7]。Hes-1、CyclinD1蛋白能夠影響癌癥細(xì)胞的活性，并且進(jìn)一步增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移侵襲能力。有研究表明[8]Hes-1、CyclinD1蛋白可調(diào)動蛋白水平，以調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞惡化程度。Notch受體與鄰近的相應(yīng)配體結(jié)合，進(jìn)一步改變Notch受體胞外段結(jié)構(gòu)，通過釋放胞外段，從而使Notch受體的胞外段與包內(nèi)部分離，Notch的包內(nèi)段在蛋白酶復(fù)合體催化作用下分解，并且轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，抑制因子相結(jié)合，進(jìn)而影響激活轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)靶基因(如Hes)等的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，抑制下游基因轉(zhuǎn)錄[9]。有研究指出[10]，Notch信號通路能夠調(diào)控人體內(nèi)正常細(xì)胞的增殖以及分化，與一些腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)，并且為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散提供了可靠的依據(jù)。本研究與上述相關(guān)報(bào)道和分析相符。

本研究還發(fā)現(xiàn)，癌組織Notch1蛋白陽性表達(dá)、癌組織Hes-1蛋白陽性表達(dá)、癌組織CyclinD1蛋白陽性表達(dá)是介入栓塞治療無效的影響因素。Notch1蛋白在人體腫瘤細(xì)胞的分化凋亡增殖過程中發(fā)揮著重要的作用，當(dāng)?shù)鞍壮掷m(xù)異常表達(dá)時(shí)，細(xì)胞則會出現(xiàn)異常分化，導(dǎo)致過度增殖，進(jìn)一步形成腫瘤。有研究表明[11]，Notch1能夠解除細(xì)胞生長的抑制，進(jìn)一步促進(jìn)宮頸癌腫瘤細(xì)胞的生長。Notch1蛋白通過互補(bǔ)協(xié)同的方式影響腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)新生血管的形成。Hes作為一種具有螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)人體干細(xì)胞的分化。在脊椎動物中，Hes-1蛋白表達(dá)最為廣泛，可以抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，在特定分化效應(yīng)基因的啟動子上發(fā)揮著重要的作用。Hes-1蛋白的表達(dá)受Notch信號的調(diào)節(jié)，也是Notch信號通路中最為重要的下游靶基因，影響以順鉑為基礎(chǔ)的子宮動脈介入性栓塞的有效性[12]。CyclinD1作為周期素家族中的主要成員，其基因定位在染色體上，由295氨基酸組成，與周期蛋白依賴性激酶(CDK)、成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(PRb)蛋白相結(jié)合，共同形成氨基酸序列。體外實(shí)驗(yàn)證明，CyclinD1蛋白通過結(jié)合并激活周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)、周期蛋白依賴性激酶6(CDK6)，使后者催化一系列關(guān)鍵底物，釋放轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)DNA合成，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞加速增殖[13]。因此，CyclinD1表達(dá)使CDK4、CDK6對PRb調(diào)節(jié)失常，導(dǎo)致細(xì)胞的生長和腫瘤的發(fā)展。因此在臨床實(shí)踐中針對LACC患者應(yīng)積極控制上述危險(xiǎn)因素，采取積極有效措施，抑制細(xì)胞生長和腫瘤的發(fā)展。

本研究還發(fā)現(xiàn)，≥Ⅲb期、腫瘤直徑、未/低分化也是惡性組介入栓塞無效的危險(xiǎn)因素，提示≥Ⅲb期、腫瘤直徑、未/低分化也是介入栓塞治療無效的影響因素。有研究指出[14]，以順鉑為基礎(chǔ)的子宮動脈介入栓塞與患者分期、腫瘤直徑、未/低分化等臨床特征顯著相關(guān)。順鉑在當(dāng)前的人類腫瘤的治療中發(fā)揮了重要的作用，同時(shí)，LACC的化療藥物也離不開順鉑通過誘導(dǎo)細(xì)胞死亡來抑制Notch信號進(jìn)一步影響子宮動脈介入栓塞的效果[15]。對于LACC診斷及后期干預(yù)治療，應(yīng)該結(jié)合患者臨床資料、腫瘤分期或臨床病理分期，判定治療后病情是否存在惡化，并根據(jù)≥Ⅲb期、腫瘤直徑、未/低分化的變化情況及時(shí)更換預(yù)后的治療干預(yù)方式。

綜上所述，LACC患者中Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白陽性表達(dá)率高，Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白表達(dá)狀態(tài)可能成為預(yù)測局部晚期宮頸癌同步放化療預(yù)后的分子生物學(xué)指標(biāo)。以順鉑為基礎(chǔ)的子宮動脈介入栓塞治療效果不佳，≥Ⅲb期、腫瘤直徑、未/低分化、Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白陽性表達(dá)均是LACC介入栓塞無效的危險(xiǎn)因素，因此針對LACC患者應(yīng)及時(shí)檢測Notch信號通路不同蛋白表達(dá)情況，預(yù)測介入栓塞的有效性。