人乳頭瘤病毒疫苗的研究現(xiàn)狀及前景

高飛，張姝玥，王致萍，夏寧邵，2

1.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361102；

2.廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361102

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是女性生殖道及皮膚黏膜常見病原體，其感染較常見，80%以上女性一生至少感染過1 次HPV。HPV 主要通過性接觸、皮膚-皮膚接觸、母嬰傳播3 種途徑進(jìn)行傳播。持續(xù)感染高危型HPV 可促進(jìn)鱗狀上皮細(xì)胞增殖，并有可能引起宮頸病變［1］。宮頸癌發(fā)病率在女性惡性腫瘤中高居第2 位，但我國青少年女性HPV 疫苗接種率仍然較低。因此，提高HPV 疫苗覆蓋率、增強(qiáng)民眾對(duì)宮頸癌和HPV 疫苗的了解和認(rèn)識(shí)迫在眉睫。本文簡述了HPV 的分子生物學(xué)和流行病學(xué)特征，梳理了國內(nèi)外HPV 疫苗的研究現(xiàn)狀，展望了HPV 疫苗的研究前景，旨在提供HPV 疫苗的探索思路，促進(jìn)新型疫苗的發(fā)展，提高接種率以響應(yīng)WHO 提出的全球消滅宮頸癌的目標(biāo)。

1 HPV 分子生物學(xué)

1.1HPV 基因組及編碼蛋白 HPV 屬乳頭瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，是一類無包膜的雙鏈環(huán)狀DNA 病毒?；蚪M長約8 000 bp，包括：①早期區(qū)域（early region，ER），編碼與病毒基因組復(fù)制、病毒顆粒合成及釋放周期相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白，可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化；②晚期區(qū)域（late region，LR），主要編碼衣殼蛋白；③上游調(diào)控區(qū)域（upstream regulatory region，URR），為非編碼區(qū)，含復(fù)制起點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，能夠調(diào)控基因表達(dá)。HPV 基因組的表達(dá)高度依賴于細(xì)胞分化，并在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上被嚴(yán)格調(diào)控。

ER 主要編碼E1、E2、E4、E5、E6、E7 六類早期蛋白。E1 與E2 蛋白形成高親和力的六聚體起始復(fù)合物，促使雙鏈解旋，啟動(dòng)病毒DNA 復(fù)制。E2 蛋白幫助病毒DNA 整合至宿主染色體中［2］，還可激活或抑制病毒轉(zhuǎn)錄；E4 蛋白在晚期表達(dá)。E4 與E1 共表達(dá)，可將分化細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G2 期。研究表明，E1 及E4 蛋白復(fù)合物還可促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞分解，從而釋放病毒粒子［3］。E5 蛋白是一種跨膜蛋白，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過激活如表皮生長因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖；其通過抑制主要可溶性復(fù)合分子形成病毒肽、干擾素κ（interferon κ，IFNκ）及生長信號(hào)通路來逃避宿主免疫［4-5］。E6 蛋白包含150 個(gè)氨基酸，由2 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)組成［6］。E7 蛋白是酸性磷蛋白，含約100 個(gè)氨基酸［7］。E6 和E7 蛋白的主要功能是通過調(diào)節(jié)增殖和分化的平衡，營造有利于病毒復(fù)制的細(xì)胞環(huán)境，同時(shí)維持感染基底細(xì)胞的儲(chǔ)存庫，是主要的病毒癌蛋白。具體來說，E6 蛋白與p53 蛋白相互作用［8］，E7 蛋白與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，pRb）相互作用［9］，協(xié)同靶向多種致癌蛋白、抑癌蛋白和小RNA（micro-RNA，mi-RNA）以破壞細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV 和低危型HPV 在啟動(dòng)子定位、啟動(dòng)子調(diào)控以及信使RNA（messenger RNA，mRNA）剪接模式上存在顯著差異，這些差異影響了E6、E7 基因的表達(dá)［10］。E6、E7 表達(dá)水平的升高與腫瘤嚴(yán)重程度的增加直接相關(guān)，這些基因表達(dá)的失調(diào)導(dǎo)致錯(cuò)誤的遺傳信息在受感染細(xì)胞中積累，并最終將病毒片段整合至宿主細(xì)胞染色體中。

晚期區(qū)域主要編碼2 類高度保守的晚期蛋白，分別為L1 主要衣殼蛋白（55 kD）和L2 次要衣殼蛋白（55 kD）。HPV 通過L1 與基底膜上的硫酸肝素蛋白聚糖結(jié)合感染上皮細(xì)胞；而L2 基因在體內(nèi)會(huì)影響L1 蛋白的表達(dá)、定位、轉(zhuǎn)運(yùn)和組裝。20 世紀(jì)90 年代初，有研究者發(fā)現(xiàn)，L1 在體外重組表達(dá)系統(tǒng)中能夠自發(fā)組裝成病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）［11］。5 個(gè)L1 首先形成五聚體，72 個(gè)五聚體通過二硫鍵、離子鍵等相互作用組裝成T = 7 的正二十面體結(jié)構(gòu)，直徑52~55 nm［12］，這種顆粒不含致癌病毒基因組，免疫功能與天然病毒粒子類似，是疫苗開發(fā)的一個(gè)重大發(fā)現(xiàn)。進(jìn)一步研究表明，接種L1 VLP 疫苗，即使沒有佐劑，也能引起持久的高滴度中和抗體［13］。因此，目前已上市的疫苗均是基于混合的多種型別HPV L1 VLP 制備的疫苗，可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答。

1.2HPV 生活史 HPV 在宿主黏膜和皮膚上皮細(xì)胞中感染及復(fù)制。不同類型HPV 具有相似的生活史。上皮細(xì)胞中的基底層細(xì)胞通過對(duì)稱分裂自我更新，不斷補(bǔ)充基底層，通過不對(duì)稱分裂產(chǎn)生子細(xì)胞，形成組織的分化層。HPV 充分利用上皮細(xì)胞這一特點(diǎn)，通過微裂縫進(jìn)入上皮細(xì)胞后利用細(xì)胞的還原性環(huán)境脫殼，將DNA 運(yùn)輸至細(xì)胞核內(nèi)［14］。病毒基因組在基底層細(xì)胞中保持低拷貝數(shù)，細(xì)胞分化期間，p97 啟動(dòng)子介導(dǎo)E6、E7 蛋白表達(dá)，p670 啟動(dòng)子上調(diào)，激活病毒增殖，病毒復(fù)制蛋白（E1、E2、E4 和E5）表達(dá)量增加，促進(jìn)病毒DNA 擴(kuò)增和衣殼蛋白合成［15］。最后，病毒粒子以鱗片的形式從上皮細(xì)胞表面脫落，釋放至環(huán)境中。在通常情況下，HPV 感染后癥狀并不明顯，也有少部分患者在感染HPV 后，會(huì)誘發(fā)上皮層增生，從而導(dǎo)致良性乳頭狀皮膚腫瘤。這種在自我更新細(xì)胞中建立低水平持續(xù)性感染，同時(shí)利用最終分化的細(xì)胞建立生產(chǎn)性感染的策略，是非常有效的，有利于HPV 長期感染和免疫逃逸。

1.3HPV 流行病學(xué)研究

1.3.1HPV 感染引發(fā)的相關(guān)疾病 HPV 主要通過性行為傳播，由于其特有的分子病毒學(xué)特征和免疫逃逸機(jī)制，傳播十分廣泛，人群感染率極高。

目前已分離出近450 種HPV 型別的基因組并進(jìn)行了測序［16］。根據(jù)病毒基因組結(jié)構(gòu)和組織嗜向性，HPV 主要分為5 個(gè)屬（α、β、γ、μ 和ν-HPV）。其中α屬（65 種）是從生殖器和口腔病變的皮膚或黏膜中分離出來的，能夠?qū)е掳┌Y。其他均來自皮膚標(biāo)本，主要為β-HPV（54 種）和γ-HPV（98 種）［17］，β-HPV和γ-HPV 在感染過程中，患者通常無癥狀，但呈免疫抑制狀態(tài)，有可能誘發(fā)產(chǎn)生皮膚乳頭狀瘤或增加皮膚癌的易感性。

世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）將12 種型別的HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58 和59）定義為1 類高危致癌類型，HPV68［18］被認(rèn)為是可能致癌的（2A 類）?；谂c已知致癌類型在進(jìn)化上的相似性，其他幾種HPV 類型（26、30、34、53、66、67、69、70、73、82、85 和97）也屬于高危進(jìn)化枝，被認(rèn)為是可能致癌的（2B 類）［19］，見表1。全世界每年因HPV 感染導(dǎo)致宮頸癌病例604 127 例，其中死亡341 831 例［20］。此外，HPV 也與其他部位癌癥有關(guān)，包括男性陰莖，女性陰道和外陰，男、女肛門轉(zhuǎn)化區(qū)、扁桃體、口咽和舌根。高危HPV 在不同感染部位表達(dá)不同，尤其是子宮頸鱗柱交接部更易生成腫瘤。

表1 國際癌癥評(píng)估研究機(jī)構(gòu)對(duì)HPV 的致癌風(fēng)險(xiǎn)和相關(guān)疾病的分類Tab.1 Classification of HPV according to oncogenic risk and associated diseases by the International Agency for Research on Cancer Evaluation

但大多數(shù)高危HPV 并不會(huì)導(dǎo)致被感染個(gè)體患癌，如輕度鱗狀上皮病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL），基本會(huì)在18 個(gè)月內(nèi)自行消退［21］。一般來說，低危型HPV 僅引起良性和自限性病變，但在特殊情況下，也會(huì)引發(fā)癌癥，如對(duì)于嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）［22］、疣狀表皮發(fā)育不全（epidermodysplasia verruciformis，EV）［23］者和器官移植受者等，由α、β、γ、μ 型HPV 引起的皮膚病將很難治愈。

1.3.2HPV 流行病學(xué)現(xiàn)狀 HPV 是目前導(dǎo)致女性癌癥的最常見病原體，99%的宮頸癌均與該病毒相關(guān)。因此，HPV 已成為全球當(dāng)前亟待解決的公共衛(wèi)生問題。

調(diào)查顯示，在全球范圍宮頸細(xì)胞學(xué)檢查正常的女性中，2020 年HPV 感染率為15.6%，但各地HPV流行率存在一定差異。WHO 報(bào)告顯示，五大洲中，女性HPV 感染率最高的為非洲（17.5%）和亞洲（15.5%），其次為歐洲（15%）、美洲（14.3%）和大洋洲（11.8%）［20］。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)展中地區(qū)女性HPV感染率（16.4%）高于發(fā)達(dá)地區(qū)（11.6%）［20］。HPV 流行率與婦女年齡相關(guān)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在所有地區(qū)，HPV 流行高峰通常出現(xiàn)在35 歲以下，老年婦女發(fā)病率降低，但在一些國家，特別是非洲、南美和北美以及歐洲地區(qū)，HPV 流行率在45 歲或45 歲以上出現(xiàn)第2 個(gè)高峰［24］，這種延遲增加的原因尚不明確。

在男性中，全球HPV 感染率與女性相似（3.5%~45% vs.2% ~ 44%）［25］，傳播速率也相似。2014 年進(jìn)行的一項(xiàng)研究中，經(jīng)調(diào)查統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在4 065 名來自非洲、美洲、亞洲和歐洲的健康男性中，9.0%為HPV 攜帶者［26］。與異性戀男性相比，同性戀和已感染艾滋病病毒的男性的HPV 感染風(fēng)險(xiǎn)更高，其HPV肛周感染發(fā)病率更高（≥90%）；然而在異性戀男性中，性伴侶數(shù)量決定了HPV 感染風(fēng)險(xiǎn)的高低［27］。此外，HPV 流行率與男性年齡相關(guān)性不大，年輕及年長男性的HPV 感染率一樣高，且隨年齡變化很?。?0］。

宮頸癌在中國女性最常見的癌癥中排名第6。僅在2020 年，中國就報(bào)告了109 741 例宮頸癌新發(fā)病例和590 60 例死亡病例，占全球?qū)m頸癌確診病例（604 127 例）的18.2%和死亡病例（341 831 例）的17.3%［20］。

69.1%的浸潤性宮頸癌歸因于HPV16 或18。在中國宮頸細(xì)胞學(xué)檢查正常的女性中，45 ~ 54 歲是HPV 流行高峰。中國HPV 感染的總體流行率為15.54%。各地區(qū)流行率存在一定差異，華東、華北、華中、華南、西南、西北、東北地區(qū)，HPV 感染的患病率分別為15.99%、18.43%、12.96%、13.51%、12.92%、12.57%和19.85%［28］。

數(shù)據(jù)分析顯示，世界范圍內(nèi)最流行的5 種HPV型別分別為HPV16、HPV18、HPV52、HPV31 和HPV-58，在中國細(xì)胞學(xué)檢查正常女性中，最常見的5種 型 別 分 別 為HPV52、HPV16、HPV58、HPV33 和HPV18［20］。

2 HPV 疫苗研究現(xiàn)狀

2.1已上市HPV 疫苗 HPV 感染是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。HPV 疫苗是降低HPV 感染和隨后癌癥發(fā)病率的重要手段。盡管2020 年美國青少年中HPV 疫苗接種率（≥1 劑）從2019 年的71.5%提高至75.1%，3 針HPV 疫苗接種率從2019 年的54.2%增加至58.6%［29］，但接種率仍不理想，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于2030 年“健康人群”的目標(biāo)，即90%的女孩在15 歲之前完成HPV 疫苗全程接種。

截至2022 年6 月，已上市HPV 疫苗有5 種，分別為2006 年上市的四價(jià)疫苗Gardasil?（Merck公司生產(chǎn)）［30］、2007 年上市的二價(jià)疫苗Cervarix?（GlaxoSmithKline 公司生產(chǎn)）［31］、2014 年上市的九價(jià)疫苗Gardasil?9（Merck 公司生產(chǎn)）［32］、2019 年上市的二價(jià)疫苗馨可寧?（Cecolin?，廈門大學(xué)聯(lián)合廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司研發(fā)生產(chǎn)）、2022 年上市的二價(jià)疫苗沃澤惠?（玉溪澤潤生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)），疫苗詳情見表2，這5 種疫苗均為基于L1 自發(fā)組裝的VLP 進(jìn)行研制的預(yù)防性HPV 疫苗，但表達(dá)系統(tǒng)和佐劑存在不同，見表3。

表2 全球已上市的5 種HPV 疫苗的特點(diǎn)Tab.2 Characteristics of five kinds of HPV vaccines licensed for use in the world

表3 HPV 疫苗不同表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比Tab.3 Comparison of advantages and disadvantages of different expression systems of HPV vaccine

2019 年發(fā)布的首個(gè)中國國產(chǎn)二價(jià)HPV 疫苗（馨可寧?）為中國及其他發(fā)展中國家的全國性HPV疫苗接種規(guī)劃帶來了希望。盡管進(jìn)口疫苗，如二價(jià)疫苗Cervarix?、四價(jià)疫苗Gardasil?和九價(jià)疫苗Gardasil?9 自2016 年以來已在中國獲得許可，但這些疫苗價(jià)格昂貴且供應(yīng)有限，主要由18 ~ 45 歲婦女購買，而9 ~ 14 歲女性大部分仍未接種疫苗。新疫苗馨可寧?每劑售價(jià)約為Cervarix?價(jià)格的1 ／ 2，卻與Cervarix?療效相似。馨可寧?因其免疫原性已被證明非劣效于3 劑接種方案被批準(zhǔn)用于9 ~ 14歲女孩的2 劑接種計(jì)劃。Gardasil?、Cervarix?、馨可寧?、沃澤惠?4 種疫苗預(yù)防HPV16 ／ 18 型相關(guān)癌前病變的保護(hù)率（95%置信區(qū)間）分別為100%（32.3%，100%）、87.3%（5.3%，99.7%）、100%（32.3%，100%）和78.59%（23.29%，96.06%）。Gardasil?、Cervarix?和馨可寧?3 種疫苗預(yù)防HPV16 ／ 18 型相關(guān)6 個(gè)月持續(xù)性感染的保護(hù)率（95%置信區(qū)間）分別為75.9%（43.5%，91.1%）、96.8%（88.0%，99.6%）、97.7%（86.2%，99.9%），表明馨可寧?的2 個(gè)關(guān)鍵性保護(hù)性數(shù)據(jù)均高于或等于其他HPV 疫苗。馨可寧?和沃澤惠?對(duì)于9 ~ 14 歲女性可采用2 劑次接種，但馨可寧?采用原核表達(dá)系統(tǒng)，生產(chǎn)成本更低，產(chǎn)量更高，很好地解決了進(jìn)口疫苗昂貴且供應(yīng)有限的問題。

2.2處在臨床階段的HPV 疫苗

目前除已上市的5 款HPV 疫苗外，國內(nèi)外許多HPV 疫苗也已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。其中，國內(nèi)疫苗以基于L1 的重組多價(jià)HPV 疫苗為主，包含二價(jià)、三價(jià)、四價(jià)、九價(jià)、十一價(jià)、十四價(jià)、十五價(jià)等不同價(jià)數(shù)，目前已有多種疫苗進(jìn)入Ⅲ期臨床階段，除此之外，還有2 種治療性疫苗進(jìn)入Ⅰ期臨床階段。而國外臨床階段的疫苗以治療性疫苗為主，針對(duì)宮頸癌、頭頸癌、口咽癌等多種HPV 導(dǎo)致的實(shí)體癌癥進(jìn)行治療，目前多處于Ⅰ和Ⅱ期臨床階段，僅2 種疫苗進(jìn)入Ⅲ期臨床。

2.2.1國內(nèi)臨床階段HPV 疫苗現(xiàn)狀 目前國內(nèi)處于臨床階段的疫苗可分為預(yù)防性和治療性疫苗2類，預(yù)防性疫苗占多數(shù)，其中基于L1 的重組多價(jià)HPV 疫苗共15 種。處于Ⅲ期臨床階段的疫苗共8種，其中包含九價(jià)疫苗5 種。另外，2022 年3 月31日，國藥集團(tuán)HPV 十一價(jià)疫苗進(jìn)入Ⅲ期臨床階段，也成為第1 種進(jìn)入Ⅲ期臨床階段的價(jià)數(shù)高于九價(jià)的疫苗。多價(jià)重組HPV 疫苗采用的表達(dá)系統(tǒng)包括漢遜酵母、畢赤酵母、大腸埃希菌和昆蟲細(xì)胞，其中漢遜酵母表達(dá)的疫苗共8 種，畢赤酵母表達(dá)的疫苗共2 種，大腸埃希菌表達(dá)的疫苗共4 種，昆蟲細(xì)胞表達(dá)的疫苗為1 種。除此之外，還有2 種治療性疫苗進(jìn)入Ⅰ期臨床階段，分別為治療用HPV16 型重組腺病毒載體疫苗和靶向HPV16 ／ 18 E6 ／ E7 蛋白的治療性樹突狀細(xì)胞疫苗。見表4。

表4 國內(nèi)臨床階段HPV 疫苗匯總Tab.4 Summary of HPV vaccines at clinical stages in China

2.2.2國外臨床階段HPV 疫苗現(xiàn)狀 相比于國內(nèi)多家公司大力研制的預(yù)防性HPV 疫苗，國外處于臨床階段的疫苗則以治療性疫苗為主。其中AAVLPHPV 和PANHPVAX 2 種預(yù)防性疫苗均基于HPV L2 研發(fā)，而治療性疫苗則多基于HPV E6 和E7 蛋白研發(fā)，也有少數(shù)針對(duì)E2 蛋白。根據(jù)疫苗類型可分為以下4 類：蛋白和多肽疫苗、重組載體疫苗、核酸疫苗、樹突狀細(xì)胞疫苗。其中以核酸疫苗為主，其中多數(shù)為DNA 疫苗。DNA 疫苗與誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性中和抗體的預(yù)防性疫苗不同，針對(duì)HPV 誘導(dǎo)的惡性腫瘤的治療性DNA 疫苗通常編碼不同HPV 抗原，通過誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)來消除持續(xù)性感染患者體內(nèi)HPV 感染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞［33］。蛋白和多肽疫苗主要通過E6 和E7 的合成肽段來誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，與DNA 疫苗相比免疫原性較強(qiáng)，但對(duì)細(xì)胞毒性更大。重組載體疫苗通過將目的蛋白肽段構(gòu)建至載體蛋白上并通過載體蛋白對(duì)目的蛋白進(jìn)行運(yùn)輸和展示，可顯著提高免疫原性，但安全性相對(duì)較低。樹突狀細(xì)胞疫苗通過導(dǎo)入樹突狀細(xì)胞的靶抗原基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并呈遞至細(xì)胞表面，激發(fā)CD4+、CD8+細(xì)胞反應(yīng)，利用患者自身免疫系統(tǒng)的潛力來消除腫瘤細(xì)胞［34］。目前治療性疫苗多處于Ⅰ和Ⅱ期臨床階段，但臨床難以達(dá)到較好治療效果，僅VGX-3100 和MVA-E2 2 種疫苗進(jìn)入Ⅲ期臨床。VGX-300 是 針 對(duì)HPV16 ／ 18 的E6 和E7 設(shè) 計(jì) 的DNA 疫苗，在VGX-3100 的臨床試驗(yàn)中，91%患者在治療完成后18 個(gè)月的評(píng)估中有效消除了HPV DNA［35］。MVA-E2 是用改良型痘苗病毒安卡拉株作為載體的遞送E2 蛋白的重組載體疫苗，其臨床結(jié)果表明，接受MVA-E2 治療的患者中有89.3%可有效消除HPV DNA［36］。雖然2 種治療性疫苗均擁有不錯(cuò)的治療效果，但想要成功上市仍面臨一些問題，特別是對(duì)于治療晚期HPV 陽性的癌癥，雖然在許多臨床試驗(yàn)中疫苗對(duì)部分患者可達(dá)到某種程度的效果，但有效果患者與無效果患者之間的潛在差異仍未解決［37］。在解決這些問題后，HPV 治療性疫苗最終可成功上市，并為HPV 陽性癌癥患者帶來希望。見表5。

表5 國外臨床階段HPV 疫苗匯總Tab.5 Summary of HPV vaccines at clinical stages abroad

3 HPV 疫苗研究前景

目前已經(jīng)上市的HPV 預(yù)防性疫苗面臨的最大問題是保護(hù)型別有限且跨型別交叉保護(hù)效果差，因此，想要獲得對(duì)更多HPV 型別的保護(hù)效果，就必須增加抗原種類，但增加抗原種類就意味著更高的免疫劑量，也會(huì)帶來更多的不良反應(yīng)及風(fēng)險(xiǎn)。之前疫苗的臨床數(shù)據(jù)可以看出，與默克四價(jià)疫苗（846 ／ 1 000人）相比，接種默克九價(jià)疫苗的志愿者產(chǎn)生局部不良反應(yīng)（905 ／ 1 000 人）人數(shù)更多［38］，提示HPV 疫苗的研發(fā)不能一味通過增加抗原種類來提高價(jià)數(shù)，而應(yīng)該從免疫原入手，設(shè)計(jì)出能夠“以一防多”的交叉抗原，或打破傳統(tǒng)預(yù)防性疫苗均以L1 作為免疫原的思路，使用具有更廣譜性的L2 蛋白作為免疫原，最終實(shí)現(xiàn)HPV 預(yù)防性疫苗的跨型別保護(hù)，為通用疫苗的設(shè)計(jì)提供更多可能性。

與預(yù)防性疫苗不同，對(duì)于治療性疫苗來說，在清除已感染細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞免疫比體液免疫發(fā)揮了更重要的作用，HPV 感染后機(jī)體對(duì)感染細(xì)胞的自發(fā)清除過程與強(qiáng)烈的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)相關(guān)，主要涉及免疫細(xì)胞包括表達(dá)CD4+和CD8+的Ⅰ型輔助性T 細(xì)胞和細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）等［39］。理想的治療性疫苗策略是靶向誘發(fā)癌癥的HPV E6 ／ E7 蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的腫瘤特異性Ⅰ型T 細(xì)胞反應(yīng)并通過CTL 對(duì)受感染細(xì)胞進(jìn)行消除。但治療性疫苗目前也面臨著許的問題，如個(gè)體差異大、抗原性弱、安全性低、成本高等，由于不同種類疫苗的差異和優(yōu)劣勢各不相同，多種免疫原或藥物的聯(lián)合治療可能是解決這些問題的關(guān)鍵。目前也有多項(xiàng)臨床試驗(yàn)結(jié)合不同免疫原及藥物進(jìn)行了嘗試，同時(shí)一些新型免疫原的設(shè)計(jì)以及表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化也均為解決上述問題提供了思路。

3.1HPV 疫苗的新型研發(fā)策略

3.1.1預(yù)防性HPV 疫苗的新型研發(fā)策略 目前市面上保護(hù)范圍最廣的HPV 預(yù)防性疫苗是默克公司的Gardasil?9，在全球范圍內(nèi)對(duì)宮頸癌的保護(hù)率為89.9%，但仍有許多可能導(dǎo)致宮頸癌的高危型別不在其保護(hù)范圍內(nèi)，且HPV 不同型別在不同國家和地區(qū)也呈現(xiàn)不同的流行情況，如在非洲HPV35 的流行率排名第5，在歐洲流行率排名第6，占比分別為3.4%和1.4%，但其并不在九價(jià)疫苗的保護(hù)范圍內(nèi)，這也導(dǎo)致Gardasil?9 在一些國家和地區(qū)保護(hù)效果降低，如在澳大利亞，Gardasil?9 對(duì)宮頸癌的保護(hù)率僅為86.5%，顯著低于平均水平［40］。

為了提高疫苗價(jià)數(shù)，增強(qiáng)保護(hù)率，急需解決HPV型別間無法誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉中和抗體的問題。廈門大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)于2017 年的研究指出［41］，HPV58 和HPV59 的環(huán)區(qū)上存在一些關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)，將這些位點(diǎn)進(jìn)行突變會(huì)降低型特異性中和抗體結(jié)合能力，而將這些特定表位移植至其他近緣HPV L1 環(huán)區(qū)后，HPV 的VLP 可與上述型特異性抗體發(fā)生結(jié)合，即特定的關(guān)鍵表位氨基酸移植可在近緣型別之間構(gòu)建出新的免疫表位，實(shí)現(xiàn)單個(gè)VLP 的跨性別保護(hù)，也為在不增加抗原種類的條件下增加疫苗保護(hù)率提供了可能。

隨后廈門大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)于2018 年的進(jìn)一步研究指出［42］，為實(shí)現(xiàn)“以一防多”的新型疫苗設(shè)計(jì)，將18 種常見高危型別以及2 種低危型別HPV 根據(jù)進(jìn)化親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近分成了7 組，希望通過特定表位移植的方式讓1 個(gè)抗原可以刺激產(chǎn)生2 或3 種型別HPV 的中和抗體。首先對(duì)HPV33 ／ 52 ／ 58 這組分子進(jìn)行探索，以3 種型別野生型L1 為骨架，將其余2個(gè)型別分別選擇1 個(gè)不同的環(huán)區(qū)對(duì)骨架環(huán)區(qū)進(jìn)行替換，構(gòu)建環(huán)區(qū)移植的嵌合VLP，其中HPV58-33BC-52HI 這個(gè)嵌合分子在小鼠及食蟹猴模型中均可誘導(dǎo)出與野生型VLP 混合免疫組相當(dāng)水平的中和抗體。這一研究結(jié)果為開發(fā)新一代HPV 預(yù)防性疫苗提供了方向，運(yùn)用嵌合VLP 的策略，可通過構(gòu)建7組嵌合VLP 分子免疫產(chǎn)生對(duì)于20 個(gè)型別的中和抗體水平，可在抗原種類低于Gardasil?9 的情況下，對(duì)宮頸癌的保護(hù)率提高至99%。

為進(jìn)一步提高單個(gè)HPV VLP 的保護(hù)范圍，廈門大學(xué)又開展了雜合體研究［43］，研究指出，HPV L1 五聚體形成VLP 是通過175 和428 位半胱氨酸形成的二硫鍵，在突變HPV L1 的175 或428 位點(diǎn)后，L1五聚體無法組裝形成VLP，當(dāng)2 種不同型別五聚體分別突變這2 個(gè)位點(diǎn)后再進(jìn)行組裝，便可形成包含2 種不同型別五聚體的雜合VLP，免疫雜合VLP 可誘導(dǎo)產(chǎn)生雜合五聚體對(duì)應(yīng)型別的抗體，這一設(shè)計(jì)思路理論上最多可將72 種不同型別的五聚體雜合至同一VLP 顆粒上，達(dá)到“以一防多”的目的。若是將嵌合與雜合策略進(jìn)行結(jié)合，便可進(jìn)一步提高單一免疫原的保護(hù)范圍，為設(shè)計(jì)更廣泛保護(hù)的疫苗提供了設(shè)計(jì)思路。

與L1 不同，L2 蛋白N-末端表位可誘導(dǎo)產(chǎn)生廣泛的交叉中和保護(hù)性抗體，是非常有潛力的HPV 疫苗候選分子，但單獨(dú)使用L2 蛋白或肽段進(jìn)行免疫產(chǎn)生的抗體滴度相對(duì)較低，無法保護(hù)機(jī)體免受HPV 感染。為解決這一問題，提高L2 的免疫原性呈遞，研究者們嘗試了許多方法，如HPV VLP 呈遞、非HPV VLP 呈遞、多聯(lián)肽納米顆粒呈遞、融合免疫刺激劑等。SCHELLENBACHER 等［44］的研究表明，將HPV16 L2 RG1 表位（aa 17~36）插入HPV 16 L1 的DE 環(huán)中，構(gòu)建的RG1-VLP 分子可在不影響誘導(dǎo)產(chǎn)生HPV16高滴度中和抗體的情況下，誘導(dǎo)針對(duì)HPV18 ／ 31 ／33／45／52／58／26／70 的強(qiáng)交叉中和效價(jià)。YADAV等［45］和ZHAI 等［46］借助噬菌體MS2 VLP-L2 顆粒為載體，將L2 肽段插入載體構(gòu)建顆粒化重組抗原，并將MS2-31L2（20-31）16L2（17-31）VLP 和MS2-L2（69-86）VLP 進(jìn)行混合免疫，混合的MS2-L2 VLP 中和保護(hù)小鼠免受與約87% 宮頸癌相關(guān)的6 種HPV類型感染。JAGU 等［47］在細(xì)菌中高水平表達(dá)了一種多聚體蛋白（11-88x8），其融合了8 種多肽，對(duì)應(yīng)以下8 個(gè)型別的L2 殘基：HPV6、HPV16、HPV18、HPV31、HPV39、HPV5、HPV56 和HPV73，在免疫兔抗血清中，發(fā)現(xiàn)了對(duì)HPV18 的中和效果，這也為更廣譜的交叉保護(hù)帶來了思路。綜上所述，顆粒化載體展示和多肽融合的策略均能有助于提高L2 的免疫原性，且L2 的保守性會(huì)刺激產(chǎn)生具有交叉保護(hù)效果的中和抗體，與基于L1 的預(yù)防性疫苗相比，基于L2 的疫苗通常是單價(jià)的，因此更利于生產(chǎn)，成本也會(huì)更低，相信在能夠解決穩(wěn)定性、免疫原性和個(gè)體差異問題后，基于L2 的疫苗會(huì)成為推動(dòng)全球疫苗接種的關(guān)鍵一環(huán)。

3.1.2治療性HPV 疫苗的新型研發(fā)策略 與HPV預(yù)防性疫苗依賴體液免疫產(chǎn)生高滴度中和抗體不同，HPV 的治療性疫苗針對(duì)的是由HPV 感染所導(dǎo)致的宮頸癌、肛門癌、頭頸癌、口腔癌等實(shí)體癌，通過刺激機(jī)體細(xì)胞免疫來消滅病變細(xì)胞。其中的關(guān)鍵是將E6 和E7 的抗原高特異性地附著在組織相容性復(fù)合MHC 分子上，與抗原特異性T 細(xì)胞受體相互作用后，引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［48］。無論是蛋白和多肽疫苗、重組載體疫苗、核酸疫苗還是樹突狀細(xì)胞疫苗，均面臨免疫原性弱，個(gè)體差異性大等問題。目前較好的解決方案是將疫苗與手術(shù)、化學(xué)療法、放射性療法等其他療法一同使用進(jìn)行聯(lián)合治療，在臨床階段的研究中，也有將免疫激活性單抗藥物以及多種抗原聯(lián)合使用的策略，這也提示多種抗原及藥物的聯(lián)合治療可能是解決免疫原性的最佳方案。

值得一提的是，目前免疫相關(guān)的機(jī)制研究尚未處于完全成熟階段，因此很多時(shí)候無法對(duì)抗原設(shè)計(jì)和呈遞提供很好的指導(dǎo)性意見，隨著免疫學(xué)發(fā)展，對(duì)免疫機(jī)制的更深入了解，會(huì)為提高抗原免疫原性及抗原遞呈效率提供更多思路，同時(shí)為疫苗設(shè)計(jì)提供更多、更成熟的新型策略。也希望治療性疫苗能夠早日上市，為已感染HPV 的患者帶來福音。

3.2疫苗佐劑的研究 佐劑是疫苗中不可或缺的成分，有提高疫苗免疫原性、穩(wěn)定性的作用。目前Gardasil?9 疫苗采用的AS04 佐劑包含氫氧化鋁和單磷酰脂質(zhì)A（3-O-desacyl-4’-monophosphoryl lipid A，MPL），與僅用明礬佐劑的相同抗原相比，誘導(dǎo)了更高水平的抗體，這依賴于AS04 激活Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）［49］。同時(shí)，對(duì)于HPV 疫苗新型佐劑的探索也從未止步，LABIANO 等［50］的研究探討了激動(dòng)劑CD40 抗體作為佐劑用于癌癥治療的效果。激動(dòng)性CD40 mAb 的初步臨床試驗(yàn)表明，其在無致殘毒性的情況下具有臨床活性，具有作為疫苗佐劑的潛力。另一類潛在的佐劑是干擾素基因蛋白刺激劑（stimulator of interferon gene，STING）激動(dòng)劑。STING 是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的跨膜蛋白，其激活會(huì)觸發(fā)對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA 的Ⅰ型干擾素反應(yīng)［51］。環(huán)狀二核苷酸（cyclic dinucleotide，CDN）是普遍存在的小分子第2 信使，由細(xì)菌合成，可調(diào)節(jié)多種過程，是一類相對(duì)較新的佐劑，已被證明可提高疫苗效力。CDN 通過直接結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留受體STING 激活先天免疫，激活誘導(dǎo)干擾素β（IFNβ）和核因子-κB（NF-κB）表達(dá)的信號(hào)通路炎性細(xì)胞因子［52］，從而達(dá)到提高免疫反應(yīng)的效果，也是具有潛力的新型佐劑。除此之外，還有很多能夠刺激人體免疫途徑的小分子藥物正在被嘗試用作疫苗佐劑，安全性和毒性評(píng)估對(duì)于佐劑的研究也至關(guān)重要，只有在具有良好的有效性和安全性的條件下，新型佐劑才有可能用于疫苗中。

4 總結(jié)與展望

目前雖然已經(jīng)上市了5 種HPV 預(yù)防性疫苗，并且有數(shù)十種預(yù)防性和治療性疫苗正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，但HPV 預(yù)防性疫苗面臨的最大問題仍未解決，即廣譜通用預(yù)防性疫苗的研制。為了解決這個(gè)問題，科研人員通過多種策略來進(jìn)行探索，包括優(yōu)化免疫原、優(yōu)化佐劑、聯(lián)合藥物治療等方式，相信很快就可研發(fā)出更高效的預(yù)防性疫苗。同時(shí)，治療性疫苗的研究也取得了一定的進(jìn)展，對(duì)于已經(jīng)感染HPV并出現(xiàn)實(shí)體瘤的患者，隨著免疫學(xué)的不斷發(fā)展，免疫機(jī)制的不斷完善，會(huì)有更多的治療性疫苗方案以及更多的個(gè)性化治療策略來幫助患者擺脫癌癥困擾。WHO 于2020 年11 月17 日發(fā)布《加速消除宮頸癌全球戰(zhàn)略》，全球194 個(gè)國家首次承諾消除一種癌癥。戰(zhàn)略設(shè)定2030 年HPV 疫苗接種覆蓋率達(dá)90%、篩查覆蓋率達(dá)70%以及宮頸癌前病變和宮頸癌治療可及性達(dá)90%。在全體科研工作者的努力下，宮頸癌將成為人類歷史上第一個(gè)可以消滅的癌癥。