長期有機與無機肥配施的黃壤稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征

楊葉華，黃興成*，朱華清，李 渝，張 松，張雅蓉，劉彥伶，蔣太明

（1 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，貴州貴陽 550006；2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部貴州耕地保育與農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)觀測實驗站，貴州貴陽 550006；3 貴定縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州貴定 551300；4 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，貴州貴陽 550006）

微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量傳遞等過程中具有至關(guān)重要的作用，其群落結(jié)構(gòu)能直接或間接地反映土壤肥力和生產(chǎn)力[1–3]。施肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最常見的管理措施，通過改變農(nóng)田土壤理化性狀、作物生長等來影響微生物的生長繁殖，是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素[4–6]。了解不同施肥下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的演變特征，對農(nóng)田土壤培肥及肥料高效利用具有重要意義。

受農(nóng)民施肥習(xí)慣影響，在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中常見的施肥模式有施用化肥、有機肥和有機無機肥配施，不同施肥模式對土壤微生物的影響結(jié)果不一[7]?；试谔嵘r(nóng)作物產(chǎn)量方面具有重要作用，且因其施用方便、見效快等特點而備受農(nóng)民青睞，單施化肥現(xiàn)象較為普遍。研究表明，長期氮磷鉀平衡施用有利于改善土壤微生物特性，增加土壤微生物群落豐富度和優(yōu)勢度，還能促進微生物功能多樣性[8]?；势┗蜻^量施用則不利于微生物生長，長期施用降低土壤微生物活性和多樣性[9]。有機肥作為優(yōu)質(zhì)的肥料，施用后能夠增加土壤有效養(yǎng)分和改善土壤理化性質(zhì)，為微生物創(chuàng)造良好的生態(tài)環(huán)境，有利于提高微生物總量、各類菌群的生物量、微生物活性和優(yōu)化微生物群落結(jié)構(gòu)[10–11]。針對中國農(nóng)田區(qū)域尺度施肥對微生物的影響研究表明，施用有機物料處理的土壤微生物磷脂脂肪酸含量、碳和氮含量是施用化肥的2倍以上[12]。更多的研究表明，有機無機肥配施更有利于土壤微生物生長。王偉華等[13]研究發(fā)現(xiàn)，有機無機肥配施能夠提高細(xì)菌、真菌、革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌磷脂脂肪酸含量和碳利用率，且有機肥的效果比秸稈效果更佳。唐海明等[14]研究表明，有機無機配施有利于維持稻田根際微生物群落多樣性，且高量有機肥效果更顯著。但有機無機肥配施對微生物的影響機理復(fù)雜，目前其影響機制還不明確，可能與土壤生物學(xué)性狀改善有關(guān)。此外，在有機無機肥配施的施肥模式下，土壤的生物學(xué)性狀還受土壤類型[15]、氣候條件等[16]因素影響。任鳳玲等[17]研究表明，亞熱帶季風(fēng)區(qū)施用有機肥比溫帶大陸氣候區(qū)和溫帶季風(fēng)氣候區(qū)施用更有利于提高農(nóng)田土壤微生物量；且中性土壤施用比酸性和石灰性土壤施用提高效果更好。因此，因地制宜研究有機無機肥配施對土壤微生物的影響，對區(qū)域農(nóng)田土壤施肥具有現(xiàn)實意義。黃壤是我國西南濕潤地區(qū)的主要耕作土壤，其中，貴州黃壤面積占全國25.3%，占貴州土壤面積46.4%，在貴州農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有至關(guān)重要地位[18]，但尚不明確有機無機肥配施下黃壤微生物群落組成特征?；诖?，本研究依托農(nóng)業(yè)農(nóng)村部貴州耕地保育與農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)觀測試驗站的長期定位試驗，采用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)，探討長期不同有機無機肥配施模式對黃壤性水稻土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，并了解其主要影響因子，為黃壤區(qū)耕地健康管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗點概況及試驗設(shè)計

試驗點位于貴州省貴陽市花溪區(qū)貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院內(nèi)“農(nóng)業(yè)農(nóng)村部貴州耕地保育與農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)觀測試驗站”的長期肥料定位試驗田(106°39′52″E，26°29′49″N)，地處黔中黃壤丘陵區(qū)，平均海拔 1071 m，年平均氣溫15.3℃，年降雨量1100～1200 mm，無霜期270天左右，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候。土壤類型為黃壤母質(zhì)上形成的水耕人為土(Anthrosols)，成土母質(zhì)為三疊系灰?guī)r與砂頁巖殘積物。試驗于1994年開始建設(shè)和勻地，1995年正式開展，各小區(qū)面積為201 m2。試驗前土壤化學(xué)性質(zhì)為：pH 6.75、有機質(zhì) 44.50 g/kg、全氮 1.96 g/kg、全磷 2.30 g/kg、全鉀13.8 g/kg、堿解氮 134 mg/kg、有效磷 13.4 mg/kg、速效鉀 294 mg/kg。

試驗共設(shè)14個處理，本研究選取其中5個處理：1)不施肥(CK)；2)全量化肥(NPK)；3)1/4牛廄肥+3/4化肥(1/4M+3/4NP)；4)1/2牛廄肥+1/2化肥(1/2M+1/2NP)；5)全量牛廄肥(M)。具體施肥量見表1。化肥選用尿素(N 46%)、普鈣(P2O516%)和氯化鉀(K2O 60%)；有機肥用牛廄肥，其平均含碳(C)10.4%、氮 (N) 2.7 g/kg、磷 (P2O5) 1.3 g/kg、鉀 (K2O)6 g/kg。種植制度為一季中稻，水稻移栽前按處理分別施用磷鉀肥或配施有機肥作基肥，施化肥處理在水稻生長期內(nèi)追施2次尿素。

表1 試驗處理與年施肥量Table 1 Test treatment and annual fertilization amount

1.2 樣品采集與測定方法

1.2.1 取樣方法 于2019年11月水稻收獲后，采集耕層(0—20 cm)土壤樣品并測定土壤容重。采用“S”形五點取樣法，隨機取5個位點土壤樣混合，每個處理3次重復(fù)。土樣混合均勻后過2 mm篩除去雜質(zhì)，一部分存在–80℃冰箱用于提取土壤DNA，剩余部分風(fēng)干后測定土壤養(yǎng)分含量。

1.2.2 土壤細(xì)菌測定 土壤樣品DNA提取根據(jù)FastDNA 試劑盒 (MP Biomedicals，Cleveland，USA)說明書進行操作，完成基因組DNA提取后，用ND 2000 分光光度計 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham,MA, USA)進行檢測。細(xì)菌 16S rRNA 的 V3～V4 區(qū)采用 338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進行擴增，通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對其PCR產(chǎn)物進行切膠回收。高通量測序委托上海派森諾生物科技有限公司采用Illumina Miseq高通量測序平臺完成，同時完成文庫構(gòu)建。

1.2.3 土壤理化性質(zhì)測定 土壤容重采用環(huán)刀法，pH采用用電位法(水土比2.5∶1)，土壤總有機碳采用重鉻酸鉀法，全氮采用半微量凱氏定氮法，堿解氮采用堿解擴散法，全磷、有效磷采用紫外可見分光光度法，全鉀、速效鉀采用火焰光度法[19]測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)序列碼將雙端序列分配給各個樣本，并使用 QIIME (v1.8.0, http://qimei.org/)過濾低質(zhì)量序列。雙端序列使用 FLASH (v1.2.7，http://ccb.jhu.edu/s oftware/FLASH/)組裝。USEARCH用于檢查和消除嵌合序列(Edgar，2010)。檢查后，應(yīng)用QIIME中的序列比對工具UCLUST以97%的序列相似度構(gòu)建操作分類單元(OTUs)豐度矩陣。基于矩陣，使用QIIME獲得每個樣本在門、綱、目、科和屬5個分類級別的分類組成和豐度。

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，使用單因素ANOVA方差分析計算檢驗差異顯著性(Duncan檢驗，P<0.05為差異顯著)。運用Canoco5.0軟件做主成分分析(PCA)和冗余分析(RDA)，采用Origin 2018 和 Excel 2010 繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 長期不同施肥處理對土壤養(yǎng)分的影響

長期施肥改變了土壤的物理化學(xué)性質(zhì)(表2)。與不施肥(CK)比較，施肥提高了土壤有機質(zhì)、全磷和有效磷含量，分別提高了21.22%～44.05%、22.43%～48.19和85.23%～146.94%。施肥導(dǎo)致土壤pH不同程度地降低，與CK相比降低了0.27～0.60個單位，其中單施有機肥(M)和有機無機肥配施(1/2M+1/2NP)處理降低幅度較大。結(jié)果還顯示，施用有機肥處理(1/4M+3/4NP、1/2M+1/2NP和M)顯著提高了土壤全氮、堿解氮和速效鉀含量，與CK相比，分別增加了26.32%～45.79%、31.42%～61.71%和18.67%～42.93%，但與對照相比全量化肥施用(NPK)對土壤全氮、堿解氮和速效鉀含量影響均不顯著。

表2 各處理土壤理化性質(zhì)Table 2 Soil physical and chemical properties in each treatment

2.2 長期不同施肥處理對土壤細(xì)菌α多樣性的影響

施肥顯著影響土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)(Shannon)、優(yōu)勢度指數(shù)(Simpson)和均勻度指數(shù)(Pielou)，對豐富度指數(shù)(Chao1)影響較小(表3)。與CK比較，氮磷鉀(NPK)施用降低了土壤細(xì)菌Simpson指數(shù)，但Shannon和Pielou指數(shù)與CK處理間差異不顯著。與CK比較，施用有機肥1/4M+3/4NP、1/2M+1/2NP和M處理的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Pielou指數(shù)均有提高，分別提高1.67%～1.86%、0.020%和0.73%～0.95%，不同有機肥處理間差異多不顯著。

表3 不同施肥處理細(xì)菌α多樣性指數(shù)Table 3 Soil bacterial α diversity index as affected by different fertilization treatments

2.3 細(xì)菌群落組成對長期不同施肥的響應(yīng)

在門水平上，共獲得48個細(xì)菌類群，其中相對豐度>1%的類群10個，共占菌群比重95.77%～96.68% (圖1a)。其中優(yōu)勢細(xì)菌門(相對豐度>10%)主要由酸桿菌門(Acidobacteria) 30.76%～36.44%、變形菌門(Proteobacteria) 22.81%～27.16%、綠彎菌門(Chloroflexi) 20.30%～24.30%組成，共占菌群比重79.08%～81.26%。放線菌門(Actinobacteria) 3.59%～4.73%、棒狀桿菌門(Rokubacteria) 3.12%～4.20%、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes) 2.31%～2.98%、擬桿菌門(Bacteroidetes) 1.41%～2.19%、亞硝酸鹽氧化菌門 (Nitrospinae) 0.68%～2.13%、Latescibacteria 1.01%～1.40%和硝化螺旋菌門(Nitrospirae) 0.89%～1.24%，共占菌群比重14.97%～16.68%。相比CK，1/4M+3/4NP增加了Proteobacteria、Bacteroidetes和Nitrospirae的相對豐度；1/2M+1/2NP降低了Gemmatimonadetes相對豐度；M和1/2M+1/2NP增加了Acidobacteria相對豐度；1/4M+3/4NP、1/2M+1/2NP和M降低了Rokubacteria和Nitrospinae的相對豐度，而NPK增加了Proteobacteria相對豐度，其他菌門差異不顯著。

圖1 不同處理細(xì)菌群落基于門(a)和綱(b)分類水平的柱狀堆疊圖Fig.1 Bacterial relative abundance of bacterial communities at the phylum (a) and class (b) classification levels under different treatments

在綱水平上，共獲得114個類群，平均相對豐度>1%的類群有16個(圖1b)。其中，Subgroup 6、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)、變形菌綱(Deltaproteobacteria)、γ-變形菌綱 (Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、母鏈菌綱[Blastocatellia(Subgroup 4)]、KD4-96和 NC10相對豐度分別為16.79%～20.97%、12.31%～14.75%、9.77%～11.23%、8.70%～11.66%、4.20%～5.82%、3.31%～4.78%、3.67%～4.46%和3.12%～4.46%，其他類群相對豐度則在0.68%～3.37%。與CK相比，NPK增加了Gammaproteobacteria相對豐度，其他菌綱差異不顯著；施用有機肥1/4M+3/4NP、1/2M+1/2NP和M增加了Alphaproteobacteria的相對豐度，降低了NC10和P9X2b3D02的相對豐度。

采用主成分分析對不同處理的群落組成進行差異分析(圖2)。結(jié)果顯示，在門和綱水平上，不施肥(CK)和單施化肥(NPK)處理的細(xì)菌群落組成較為相似，有機無機肥配施(1/4M+3/4NP、1/2M+1/2NP)處理的細(xì)菌群落組成較為相似。在門水平上，第1、2主成分軸對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成變異的解釋量分別為57.3%和15.8%，合計73.1% (圖2a)，綱水平解釋量為66.9% (圖2 b)。在屬水平上，第1、2主成分軸對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成變異的解釋量分別為84.1%和8.2%，合計92.3% (圖2c)。施用有機肥(1/4M+3/4NP、1/2M+1/2NP和M)處理的細(xì)菌群落組成相似，CK和NPK處理的細(xì)菌群落組成均與施用有機肥處理有差異。

圖2 不同處理基于細(xì)菌群落門(a)、綱(b)和屬(c)水平的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of bacterial communities at the phylum (a), class (b) and genus(c) levels under different treatments

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

采用冗余分析解析土壤理化性質(zhì)對門水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明不同施肥處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)明顯不同，CK和NPK處理相似，1/4M+3/4NP、1/2M+1/2NP、M處理相似(圖3)。結(jié)果還顯示，RDA分析的第一軸、第二軸解釋度分別為50.0%和10.0%，解釋度60.0%。在單因素影響中，土壤全氮(TN)、堿解氮(AN)、速效鉀(AK)、pH、有效磷(AP)和全磷(TP)是影響土壤細(xì)菌群落組成的重要因子，其中全氮(TN，47.6%，F(xiàn)=11.8，P=0.002)、堿解氮(AN，46.5%，F(xiàn)=11.3，P=0.002)和速效鉀(AK，35.6%，F(xiàn)=7.2，P=0.004)是關(guān)鍵因子。CK和NPK處理群落結(jié)構(gòu)在pH上的投影在正方向，而1/4M+3/4NP、1/2M+1/2NP和M處理在負(fù)方向上，說明有機肥處理通過降低pH與CK、NPK處理形成差異，而在TN、AN、AK上的投影上相反。TN、AN、AK、AP和TP與酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)呈明顯銳角，為正相關(guān)關(guān)系，與其他菌門呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，pH則相反。

圖3 不同處理基于土壤理化性質(zhì)和細(xì)菌群落門水平的冗余分析Fig.3 Redundancy analysis of based on soil chemical properties and dominant bacterial phyla

3 討論

土壤細(xì)菌α多樣性指數(shù)是表征土壤細(xì)菌群落多樣性和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，與不施肥(CK)和長期單施化肥(NPK)比較，單施有機肥(M)和有機無機肥配施(1/4M+3/4NP、1/2M+1/2NP)均促進了土壤細(xì)菌的生長和繁殖，土壤細(xì)菌的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Pielou指數(shù)的提高與此一致(表3)。Liu 等[20]在華北地區(qū)的研究結(jié)果也與本研究一致。原因可能是施用有機肥改善了土壤理化性質(zhì)，能夠提高土壤肥力，為土壤細(xì)菌提供了一個良好的生長環(huán)境，而長期施用化肥和不施肥下土壤退化嚴(yán)重，土壤環(huán)境營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，限制了細(xì)菌生長[21–23]。

不同施肥均會影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，總體上，處理間的細(xì)菌優(yōu)勢門和綱類群相似，但相對豐度存在一定差異(圖1)。不同施肥處理優(yōu)勢菌門(相對豐度>10%)為酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)，這與王娟娟等[24]研究得到的水稻土細(xì)菌群落優(yōu)勢類群相似?？赡苁且驗樵囼炌寥谰鶠榈咎镏行酝寥?，且同處中緯度亞熱帶季風(fēng)氣候，水熱條件類似，因此土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢菌群相似度較高。與CK比較，長期施肥不同程度地提高了變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度，試驗處理的相對豐度從高到底依次為NPK>1/4M+3/4NP>1/2M+1/2NP>M>CK。原因可能是長期施肥提高了土壤肥力，促進作物根系生長，進而影響了與根系生長關(guān)系密切的變形菌門[25]。Proteobacteria的相對豐度隨著有機肥替代量的增加而降低，且1/4M+3/4NP和NPK的Proteobacteria相對豐度顯著高于CK，說明在本研究中，Proteobacteria受化肥的影響更加顯著。與CK和NPK處理相比，施用有機肥處理均降低了棒狀桿菌門(Rokubacteria)和亞硝酸鹽氧化菌門(Nitrospinae)相對豐度，提高了擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度。Rokubacteria為近年被識別的土壤細(xì)菌門類，尚未明確施肥對其豐度和功能性的影響機理，但肯定了Rokubacteria合成抗生素的潛力[26]，從側(cè)面反映出長期施用有機肥可降低致病性細(xì)菌數(shù)量，對土壤健康有重要意義。亞硝酸鹽氧化菌門(Nitrospinae)是參與有機碳固定過程的重要細(xì)菌種類[27]，長期施用有機肥降低土壤Nitrospinae豐度的原因可能是施用有機肥處理增加了外源碳源，微生物的固碳作用減弱。而施用有機肥提高擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度的原因可能是有機肥為牛廄肥，動物的腸道中有較多的Bacteroidetes，牛糞發(fā)酵成的有機肥含有Bacteroidetes細(xì)菌[28]。近年來，隨著研究者對土壤微生物的深入研究，一些土壤碳循環(huán)[29]、氮循環(huán)[30]相關(guān)功能性細(xì)菌逐漸被認(rèn)識，但整體來看，功能性微生物仍處于探究階段，因此，在后續(xù)的研究中，應(yīng)系統(tǒng)對其進行研究。本研究通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，無論在細(xì)菌門水平還是綱水平上，1/4M+3/4NP、1/2M+1/2NP和M處理的土壤細(xì)菌群落組成相似度較高，CK和NPK聚類在一起，相似度高(圖2)，說明不同處理間土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異是施用有機肥造成的，劉平靜等[31]在土上的相關(guān)研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致。

另外，本研究結(jié)果還表明，長期不同施肥改變了土壤理化性質(zhì)，其中土壤全氮、堿解氮、速效鉀、pH、有效磷和全磷養(yǎng)分的差異是導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落組成差異的重要因子(圖3)。一些研究者的相關(guān)研究結(jié)果與本研究有所差異。如邢亞薇等[32]研究表明，土壤pH、全氮和有機碳含量是影響黃土旱塬農(nóng)田土壤微生物群落豐度的重要因子；李春越等[33]研究發(fā)現(xiàn)，黃土旱塬農(nóng)田土壤理化性質(zhì)對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異影響大小表現(xiàn)為為：全氮>全磷>pH>有機質(zhì)。產(chǎn)生差異的原因可能是不同試驗點的施肥量、施肥模式等存在差異，土壤的理化性質(zhì)對施肥的響應(yīng)不同導(dǎo)致。

4 結(jié)論

在貴州黃壤區(qū)，長期單施有機肥和有機無機肥配施能夠提高土壤肥力，改善土壤細(xì)菌的生長環(huán)境，顯著提高土壤細(xì)菌的多樣性、優(yōu)勢度和均勻度，并改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。施用有機肥對提升貴州黃壤區(qū)土壤肥力，促進農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和健康發(fā)展具有重要意義，是值得推薦的施肥模式。