長期不同施肥下褐土養(yǎng)分及酶活性的生態(tài)化學(xué)計量特征

陳浩寧，周懷平，文永莉，向 云，程 曼*

（1 山西大學(xué)黃土高原研究所，山西太原 030006；2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，山西晉中 030031）

生態(tài)化學(xué)計量學(xué)通過將生態(tài)計量和化學(xué)計量原理相結(jié)合，綜合考慮自然選擇、資源配置和消費(fèi)者驅(qū)動營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)理論等[1–2]，研究物質(zhì)和能量在生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)生物和環(huán)境因子的相互作用下是如何保持平衡的。生態(tài)計量學(xué)常與生態(tài)系統(tǒng)的功能過程和生物行為相聯(lián)系[3]，生物可以通過自身化學(xué)計量特征、群落結(jié)構(gòu)、生態(tài)酶活性等方面的改變，以響應(yīng)變化的底物計量特征[4]。生態(tài)酶研究主要集中在與有機(jī)質(zhì)水解有關(guān)的 β-1, 4-葡萄糖苷酶 (β-1, 4-glucosidase, BG)、β-1, 4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 (β-1, 4-N-acetylglucosidase, NAG)、亮氨酸氨基肽酶 (leucine aminopeptidase,LAP)、堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP)等。土壤系統(tǒng)中水解酶活性及比值常與養(yǎng)分濃度或元素化學(xué)計量相聯(lián)系，可作為反映微生物群落代謝活動對養(yǎng)分需求及養(yǎng)分有效性之間的生物地球化學(xué)平衡指標(biāo)[5–6]。Allison等[7]深入研究調(diào)控土壤水解酶生產(chǎn)的環(huán)境因子，提出“進(jìn)化經(jīng)濟(jì)原則”。Sinsabaugh等[8]提出生物地球化學(xué)平衡模型，探討環(huán)境養(yǎng)分的有效性、酶活性和微生物生長效率之間的關(guān)系，指出在全球尺度上酶化學(xué)計量比BG∶(NAG+LAP)為1.41，BG∶ALP 為 0.62，(NAG+LAP) ∶ALP 為0.44[9]。Tian等[10]對土壤元素化學(xué)計量的研究表明，我國土壤C∶N、C∶P、N∶P平均為11.9、136和9.3。孫騫等[11]研究發(fā)現(xiàn)黃土高原旱作農(nóng)耕區(qū)土壤C∶N、C∶P、N∶P平均為5.52、15.56和2.79。

內(nèi)穩(wěn)性是生態(tài)化學(xué)計量學(xué)存在的前提[12]，即當(dāng)土壤中可利用資源的計量比發(fā)生變化時，微生物可以通過改變生態(tài)酶計量比從有機(jī)質(zhì)中獲取資源來維持自身生物量比的穩(wěn)定[13]?！百Y源分配理論”指出，微生物會將更多的能量和養(yǎng)分分配于獲取限制性資源酶的生產(chǎn)[14]，因此，土壤酶活性及酶計量比可作為反映微生物代謝受能量和養(yǎng)分限制程度的敏感指標(biāo)。在農(nóng)田系統(tǒng)中，對土壤養(yǎng)分和生態(tài)酶活性關(guān)系的研究主要是通過長期肥料單施或混施調(diào)節(jié)底物有效性實現(xiàn)。由于不同施肥處理養(yǎng)分投入比和種類的差異，使C、N和P在生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)部生物和環(huán)境之間循環(huán)的不確定性增加，會影響微生物群落結(jié)構(gòu)和酶活性表達(dá)，從而改變農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能[15–16]。目前關(guān)于長期施肥對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)影響的研究主要集中于土壤肥力、微生物群落組成和土壤酶活性等方面，也有一些關(guān)于農(nóng)田的元素計量范圍的研究[17–19]。而將元素計量與酶計量結(jié)合，可從微生物資源限制角度探討褐土農(nóng)田元素循環(huán)的生物地球化學(xué)特征。依托山西壽陽旱地農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)野外科學(xué)觀測研究站，借助生態(tài)化學(xué)計量學(xué)手段，研究褐土元素和酶活性生態(tài)化學(xué)計量對長期不同施肥處理的響應(yīng)特征，探討長期不同施肥土壤養(yǎng)分的限制性及酶活性表達(dá)的反饋機(jī)制，為進(jìn)一步調(diào)控褐土碳、氮、磷元素平衡，改善農(nóng)田土壤肥力和實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗站位于山西省壽陽縣宗艾鎮(zhèn)(37°58′N，113°06′E)，海拔 1130 m，土壤類型為褐土，成土母質(zhì)為馬蘭黃土，土層深厚。年平均氣溫7.4℃，無霜期約130天，年平均降雨量501 mm，年際間變化較大，干燥指數(shù)1.3，屬于半濕潤偏旱區(qū)。長期定位試驗布設(shè)前(1992年)耕層土壤(0—20 cm)基本化學(xué)性質(zhì)為有機(jī)碳13.81 g/kg、全氮1.05 g/kg、全磷0.76 g/kg、全鉀 14.10 g/kg、有效氮 118 mg/kg、有效磷4.84 mg/kg、pH 8.4。

1.2 試驗設(shè)計

長期定位施肥試驗開始于1992年，試驗布設(shè)參考徐明崗等編著的《中國農(nóng)田土壤肥力長期試驗網(wǎng)絡(luò)》[20]。采用氮、磷、有機(jī)肥三因素四水平正交法設(shè)計施肥小區(qū)，共18個處理，隨機(jī)排列，無重復(fù)，各小區(qū)面積為66.7 m2。試驗用氮肥為尿素(N 46%)，磷肥為過磷酸鈣(P2O514%)，有機(jī)肥為新鮮牛糞(有機(jī)質(zhì) 90.5～127.3 g/kg、全氮 3.39～4.97 g/kg、全磷1.37～1.46 g/kg、全鉀 14.1～34.3 g/kg)，每年秋季玉米收獲后結(jié)合耕翻一次性施入。本研究選取其中9個處理，即無施肥對照處理(CK)；4個氮磷化肥處理 N1P1、N2P2、N3P3和 N4P4；4個有機(jī)肥處理N2P1M1、N3P2M3、N4P2M2和 M6。各處理施肥量見表1。

表1 1992—2016年各處理年均施肥量(kg/hm2)Table 1 Annual fertilizer input in each treatment from 1992 to 2016

1.3 樣品采集與測定

分別于1992年播種前和各施肥處理2001、2006、2016年秋季玉米收獲后采集0—20 cm土層土壤樣品，各施肥小區(qū)按“S” 形5點(diǎn)采樣混合形成一個土樣，去除土樣中可見植物殘體及石塊，將土樣分成兩份，一份在自然條件下風(fēng)干后過2 mm篩測定土壤化學(xué)性質(zhì)，另一份過1 mm篩后保存在4℃冰箱內(nèi)用于測定土壤酶活性。

土壤基礎(chǔ)化學(xué)性質(zhì)測定參考《土壤農(nóng)化分析》[21]。采用微孔板熒光法[22]測定土壤BG、NAG和ALP活性，底物分別為4-MUB-β-glucopyranoside、4-MUBN-acetyl-β-D-glucosaminide 和 4-MUB-phosphate，MUB可以在365 nm波長激發(fā)，在450 nm處檢測到熒光[23]，通過土壤酶水解反應(yīng)將其釋放，檢測熒光量來表征土壤酶活性。酶活性計算參考DeForest[23]的方法，單位為nmol/(g·h)，并將酶活性值通過log對數(shù)變換以滿足正態(tài)分布。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)用 Microsoft Excel 2019 整理，Origin 2018作圖。不同施肥處理土壤生態(tài)酶活性及化學(xué)計量比之間顯著性差異通過SPSS 19.0單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD實現(xiàn)，土壤元素、酶活性及化學(xué)計量比之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析研究，通過逐步回歸進(jìn)一步分析土壤元素與酶活性之間的關(guān)系。

本研究中土壤有機(jī)碳、全氮和全磷之間的比值分別以C∶TN、C∶TP、TN∶TP表示，考慮到施肥對農(nóng)田土壤養(yǎng)分資源的影響，故計算有機(jī)碳與有效養(yǎng)分之間的計量比C∶AN、C∶AP、AN∶AP。由于有機(jī)碳與有效養(yǎng)分之間的比值差異過大，故對其進(jìn)行對數(shù)變換，將AN∶AP值擴(kuò)大10倍以避免變換產(chǎn)生負(fù)值。土壤酶計量比通過lnBG/lnNAG、lnBG/lnALP和lnNAG/lnALP計算得出。向量角度 (vector angle)>45°越大表示微生物受磷限制越強(qiáng)，向量長度(vector length)越長表示微生物受碳限制越嚴(yán)重。向量角度 (vector angle) 和向量長度 (vector length) 通過公式 (1)和公式 (2)計算[24]：

2 結(jié)果與分析

2.1 長期不同施肥下土壤養(yǎng)分化學(xué)計量比變化特征

表2顯示，與試驗初期(1992年，數(shù)據(jù)見1.1部分)相比，高量有機(jī)肥處理(M6)土壤有機(jī)碳含量的年增長速率最快，為0.36 g/(kg·a)，說明高量有機(jī)肥投入可以促進(jìn)土壤有機(jī)碳固存。2001—2016 年，與CK、單施化肥處理相比，化肥配施有機(jī)肥處理土壤全氮和有效氮含量無明顯變化，高量有機(jī)肥處理土壤全氮和有效氮含量明顯提高，這表明旱作玉米中氮磷化肥處理基本可以維持土壤氮庫穩(wěn)定，有機(jī)肥的投入則可促進(jìn)土壤氮庫和有效氮累積。整體上，土壤全磷含量隨化肥和有機(jī)肥投入量增加而增加。與試驗初期相比，連續(xù)施肥24年后高量有機(jī)肥處理土壤有效磷年增長速率為8.78 mg/(kg·a)，顯著高于CK和化肥處理，這表明長期施肥處理有利于提高土壤全磷和有效磷含量，有機(jī)肥處理的提高效果更優(yōu)(表2)。

表2 長期不同施肥下土壤有機(jī)碳及全量和有效態(tài)氮、磷含量Table 2 The contents of organic C, and total and available N and P in soils under different long-term fertilization treatments

圖1A顯示，土壤C : TN在各化肥和CK處理之間不存在顯著差異，有機(jī)肥處理以N2P1M1、N3P2M3和M6處理土壤C: TN較CK處理顯著降低了23.1%～30.2% (P<0.05)。圖1B和C顯示，土壤C∶TP和TN∶TP比均隨化肥投入量增加而降低。其中，在N4P4處理土壤C∶TP較CK處理顯著降低了23.3%(P<0.05)，TN∶TP降低了17.6% (P>0.05)；同時4個化肥處理和4個有機(jī)肥處理之間土壤C∶TP均不存在顯著差異，而土壤TN∶TP在M6處理顯著高于其他各處理 (P<0.05)。圖1D顯示，土壤C∶AN的變化范圍為2.11～2.29 (均值)，各處理之間彼此不存在顯著差異。圖1E和F顯示，土壤C∶AP和AN∶AP隨化肥和有機(jī)肥投入量增加而降低，且4個有機(jī)肥處理土壤C∶AP和AN∶AP較4個化肥處理降低的幅度更大。綜上表明，長期定位施肥試驗顯著改變了褐土農(nóng)田土壤元素庫結(jié)構(gòu)，其中化肥處理土壤全磷相對提升更顯著，而有機(jī)肥在對土壤有效養(yǎng)分的改善作用上明顯優(yōu)于單施化肥，并隨投入量增加土壤C∶AP和AN∶AP顯著降低。

圖1 長期不同施肥處理土壤元素計量比變化特征Fig.1 Characteristics of stoichiometric ratios of soil elements under different long-term fertilization treatments

2.2 長期不同施肥下土壤酶活性及化學(xué)計量比變化特征

2.2.1 土壤酶活性特征 圖2中，長期不同施肥處理土壤 BG 活性為 2.47～4.28 nmol/(g·h)。CK 和單施化肥4個處理BG活性隨施肥年限增加而降低。經(jīng)過24年褐土長期施肥后，M6處理BG活性為4.17 nmol/(g·h)，顯著高于其他處理。土壤NAG和ALP活性分別為 0.65～2.95 和 1.27～3.10 nmol/(g·h)，除N1P1處理外，CK和其他化肥處理NAG和ALP活性在年限的變化上均以2016年最低。24年長期試驗后，M6處理土壤NAG活性顯著高于其他各施肥處理，ALP活性以N1P1和M6處理顯著高于CK處理。雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)，施肥年限、肥料化學(xué)性質(zhì)與投入配比、年限與肥料之間的交互作用是影響褐土土壤酶活性的關(guān)鍵因子。綜上說明長期施用大量氮磷化肥會抑制土壤酶活性，有機(jī)肥施用可以起到改善作用。

圖2 長期不同施肥下土壤酶活性變化特征Fig.2 Changes of soil eco-enzymatic activities under different long-term fertilization treatments

2.2.2 土壤酶活性化學(xué)計量比特征 圖3中，N2P2、N3P3和N4P4化肥處理土壤酶計量比lnBG/lnANG略高于有機(jī)肥處理，lnNAG/lnALP略低于有機(jī)肥處理，但各處理彼此間不存在顯著差異(P>0.05)。通過與1992年 (試驗開始年) 酶計量值比較，發(fā)現(xiàn)施肥試驗后本研究區(qū)土壤lnBG/lnNAG較1992年整體升高了37.3%～116.7%，lnNAG/lnALP降低了32.0%～53.1%。

由長期不同施肥處理土壤酶化學(xué)計量向量角度和向量長度(圖4)可知，相比于1992年，各施肥處理下向量角度均＞45°，向量長度增加了11.1%～52.4%，長期定位試驗加劇了褐土中微生物代謝的磷和碳限制。長期定位試驗向量角度和向量長度在各處理彼此間不存在顯著差異 (P>0.05)。其中，化肥施用以N1P1(低量) 處理下向量角度和長度最低，有機(jī)肥施用以 M6處理最低，而 N2P2、N3P3和 N4P4處理向量角度和長度均高于各有機(jī)肥處理。以上說明，相比大量單施化肥，低量施用下土壤微生物代謝的磷和碳限制程度較弱，同時有機(jī)肥處理特別是高量有機(jī)肥可以有效緩解微生物的磷和碳限制。

2.3 土壤元素及其計量比與酶活性及其計量比之間的相關(guān)性分析

由表3可知，有機(jī)碳(C)、全磷 (TP) 及有效磷(AP) 與酶活性及化學(xué)計量比之間均不存在顯著相關(guān)關(guān)系，全氮(TN) 與BG、NAG和lnNAG/lnALP之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，有效氮(AN)與BG、NAG和ALP酶、lnBG/lnNAG和lnNAG/lnALP呈顯著或極顯著的相關(guān)關(guān)系。從生態(tài)化學(xué)計量角度看，C∶TN和C∶AN與lnBG/lnNAG之間存在極顯著正相關(guān)，C∶TP和C∶AP與lnBG/lnALP之間相關(guān)關(guān)系未達(dá)到顯著水平，TN∶TP與lnNAG/lnALP之間存在顯著正相關(guān)，AN∶AP與lnNAG/lnALP之間不存在顯著相關(guān)關(guān)系。

表3 土壤養(yǎng)分含量及其計量比與酶活性及其計量比之間的相關(guān)系數(shù)(r)Table 3 The correlation coefficient between soil nutrient contents and their stoichiometric ratios and enzyme activities and their stoichiometric ratios (r)

進(jìn)一步逐步回歸發(fā)現(xiàn)，AN分別解釋了BG 36.6%、NAG 42.7%、ALP 14.9% 和 lnNAG/lnALP 41.9% 的變異，AN和TP共同解釋了lnBG/lnNAG 43.4%的變異了(表4)，說明有效氮在調(diào)節(jié)褐土農(nóng)田土壤酶活性及化學(xué)計量比上發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

表4 酶活性及計量比與土壤養(yǎng)分的逐步回歸分析Table 4 Stepwise regression of soil enzyme activities and their stoichiometric ratios and soil nutrients

3 討論

3.1 土壤元素化學(xué)計量特征對長期不同施肥的響應(yīng)

土壤C∶TN作為預(yù)測有機(jī)質(zhì)分解作用和碳氮飽和診斷指標(biāo)，影響著碳氮循環(huán)過程[25]，土壤C∶TN的高低與有機(jī)質(zhì)的分解速率成反比[2]。長期24年施肥試驗土壤C∶TN為12.86 (均值)，高于中國土壤平均值 (11.9)[10]，符合耕層土壤有機(jī)質(zhì)碳氮比變化范圍(8∶1～15∶1)[2]，褐土有機(jī)質(zhì)礦化速率表現(xiàn)出相對緩慢的特點(diǎn)[26]。有機(jī)肥投入下土壤C∶TN (11.29，均值)顯著低于CK處理 (14.54，均值)，說明有機(jī)肥施用可以加速土壤有機(jī)質(zhì)分解。這是因為有機(jī)肥施用后有效緩解了微生物碳限制 (圖4B)，促進(jìn)了微生物生長繁殖，顯著提高的生物量 (較CK處理提高50%～76%[27–28])刺激其對有機(jī)質(zhì)礦化的強(qiáng)度和土壤可溶性有機(jī)碳的消耗。

一般認(rèn)為，土壤C∶TP可以反映微生物礦化有機(jī)質(zhì)過程中磷素的釋放與固持之間的平衡[26]，較低的碳磷比意味著微生物分解有機(jī)質(zhì)釋放有效磷的潛力較大，本區(qū)域土壤C∶TP為16.28 (均值)，顯著低于中國土壤的136[10]。楊振興等[29]研究發(fā)現(xiàn)，長期施用化肥主要增加了HCl-P和Residual-P兩種形態(tài)磷，而在褐土中這兩者都是極易被固定的類型。本區(qū)域土壤C∶TP隨化肥投入量增加而降低，高量化肥處理(N4P4) 顯著低于CK處理，說明長期單施化肥會降低土壤磷素利用率，易形成難溶的穩(wěn)定態(tài)磷而大量固存于土壤，這與王傳杰等[17]的研究結(jié)果相似，圖4A中不斷增加的磷限制也證明了此觀點(diǎn)。

土壤TN∶TP常用來確定土壤養(yǎng)分的限制因子和限制閾值[2, 26]。本研究中土壤 TN∶TP 為 1.31 (均值)，顯著低于中國土壤9.3[10]，說明本區(qū)域磷素含量相對豐富。土壤TN∶TP隨化肥投入量增加而降低，N4P4(1.02) 顯著低于 N1P1(1.28) 和 N2P2(1.20) 處理，這是由于化肥處理褐土磷素容易以難溶的穩(wěn)定態(tài)固定于土壤中，并隨化肥投入量增加磷庫固定越大[29]，而TN則基本保持穩(wěn)定(表2)，造成土壤TN∶TP顯著降低，也表明化肥處理對土壤磷庫影響作用更大。高量有機(jī)肥處理 (M6) 土壤 TN∶TP (均值1.74) 顯著高于 CK (1.23) 和各化肥處理 (1.15)，可能是有機(jī)肥的投入促進(jìn)了磷庫活化并為土壤帶來大量有機(jī)氮[30]，造成土壤TN∶TP相對升高。本研究施肥處理TN∶TP變化趨勢與前人研究結(jié)果[18–19]基本一致。對比不同施肥處理土壤C∶AP與AN∶AP之間的差異，發(fā)現(xiàn)土壤有效磷較有機(jī)碳和有效氮增幅更大，且有機(jī)肥在提高土壤養(yǎng)分有效性特別是有效磷含量上的效果更優(yōu)于化肥處理。

綜上可知，長期不同定位施肥試驗顯著改變了褐土元素化學(xué)計量關(guān)系。單施化肥主要促進(jìn)了磷素固持，造成土壤C∶TP和TN∶TP顯著降低；有機(jī)肥則可促進(jìn)褐土有機(jī)質(zhì)分解，改善養(yǎng)分供應(yīng)的連續(xù)性，顯著提高土壤有效磷含量。

3.2 土壤酶活性化學(xué)計量特征對長期不同施肥的響應(yīng)

本研究中酶化學(xué)計量C∶N∶P大致為5∶2∶3，區(qū)別于全球尺度1∶1∶1[9]，反映出長期施肥條件下褐土可利用的碳磷元素相對缺乏，整體較高的BG和ALP活性也說明微生物可以通過調(diào)控酶的表達(dá)來適應(yīng)資源稀缺的土壤環(huán)境。

不同施肥處理下土壤酶計量比、向量角度和長度特征，可以反映微生物生長和代謝過程中能量和資源限制差異[13,24]?！百Y源分配理論”指出，土壤中資源的有效性與土壤酶的相對活性之間存在耦合關(guān)系，當(dāng)環(huán)境底物充沛而有效資源稀缺時，微生物會將更多的能量 (C)和養(yǎng)分 (N、P)分配于獲取限制性資源酶的生產(chǎn)[14,31]。本研究中 N2P2、N3P3和 N4P4處理下，土壤 lnBG/lnNAG、酶向量角度和長度略高于各有機(jī)肥處理(P>0.05)，而 lnNAG/lnALP 略低于各有機(jī)肥處理 (P>0.05)，這是因為化肥處理作物產(chǎn)量顯著增加的同時大量消耗土壤中可溶性有機(jī)碳和有效磷[17]，且無機(jī)磷施入褐土后容易與鈣、鎂等元素結(jié)合而降低磷素的可利用性，加劇微生物代謝活動中碳和磷限制 (圖4A)，微生物在與植物競爭能量和資源的過程中會將更多的目標(biāo)放在BG和ALP生產(chǎn)上，造成lnBG/lnNAG更高，lnNAG/lnALP更低。而有機(jī)肥的投入刺激了土壤有機(jī)質(zhì)分解并大幅提高了AP含量 (圖1)，可以滿足微生物生長對能量和資源的需求，有效緩解碳和磷限制，造成BG和ALP活性相對降低，這與崔繼文等[32]研究結(jié)果基本一致。藍(lán)賢瑾等[33]在紅壤的研究結(jié)果表明，長期有機(jī)肥處理顯著提高了微生物對氮素需求，從而刺激分泌更多NAG改變了酶化學(xué)計量比，與本研究NAG活性和向量角度的變化具有相似性。

圖4 長期施肥處理下土壤酶化學(xué)計量向量角度和向量長度變化Fig.4 Vector angle and vector length of soil enzymatic stoichiometry under different long-term fertilization treatments

另一方面，本研究酶化學(xué)計量的變化可能與長期施肥引起微生物學(xué)特征改變有關(guān)。前人研究發(fā)現(xiàn)，BG和ALP活性相對升高與微生物群落中真菌相對富集存在顯著相關(guān)性[5,34]。真菌更高的生物量C∶N意味著對C需求更大[35]，本研究中長期化肥處理土壤相對更高的有機(jī)碳含量或許為真菌富集提供了機(jī)會，有利于BG活性相對提高，而有機(jī)肥施用則使土壤向高質(zhì)方向發(fā)展 (圖1)，為好營養(yǎng)的細(xì)菌富集創(chuàng)造條件。最近，Chen等[36]研究指出，酶催化的土壤有機(jī)質(zhì)分解更有可能是由編碼水解酶的微生物功能基因驅(qū)動的，功能基因相對豐度改變的影響反映在相應(yīng)的酶活性上。Luo等[37]針對C∶N∶P計量平衡與土壤生態(tài)功能穩(wěn)定性的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，土壤元素含量與編碼水解酶的功能基因之間存在顯著相關(guān)性。據(jù)此我們推斷，本研究中土壤酶化學(xué)計量lnBG/lnNAG和lnNAG/lnALP在長期化肥和有機(jī)肥處理之間的差異，可能與肥料性質(zhì)對土壤C∶N∶P和生態(tài)功能的作用程度不同有關(guān)，造成編碼水解酶的微生物功能基因豐度調(diào)整，從而引起酶活性相對改變。

綜上，土壤酶計量比和向量特征揭示，褐土施肥處理后微生物代謝整體面臨強(qiáng)烈的磷限制，且化肥處理易加劇微生物碳和磷限制，有機(jī)肥可緩解土壤微生物資源限制程度。本區(qū)域酶活性化學(xué)計量變化符合Allison等[7]提出的酶生產(chǎn)“進(jìn)化經(jīng)濟(jì)原則”。

3.3 土壤元素和酶活性化學(xué)計量關(guān)系研究

相關(guān)性分析和逐步回歸結(jié)果表明，有效氮對BG、NAG、ALP活性和酶化學(xué)計量lnBG/lnNAG與lnNAG/lnALP有很好的解釋作用。前人研究發(fā)現(xiàn)，以蛋白質(zhì)為主體的水解酶合成需要足夠的氮素供應(yīng)[38]；處于資源脅迫中的微生物會減少對獲取環(huán)境中非稀缺資源酶的投資[31]。除高量有機(jī)肥處理外，其他施肥處理土壤有效氮含量較1992年有不同程度的降低 (參見1.1部分)，但基本可以滿足微生物生存需求，相應(yīng)的會減少NAG合成[31]；本區(qū)域微生物代謝整體受到碳、磷限制的影響，會將更多的氮素用于生產(chǎn)并維持相對更高的BG和ALP活性 (圖3)，造成有效氮與lnBG/lnNAG和lnNAG/lnALP之間存在極顯著相關(guān)性 (P<0.01)。以上結(jié)果表明土壤酶活性表達(dá)存在資源依賴性，有效氮在調(diào)節(jié)褐土酶活性和酶化學(xué)計量的變化上發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

另外發(fā)現(xiàn)，本研究中所涉及的因子均不能很好地解釋酶計量lnBG/lnALP變異，AN∶AP與lnNAG/lnALP之間也不存在相關(guān)關(guān)系，說明本研究通過水解酶和元素計量之間的關(guān)系，來研究農(nóng)田土壤微生物資源需求與元素生物地球化學(xué)循環(huán)存在一定不足。一方面，可能是環(huán)境中各種生物或非生物因子(土壤團(tuán)聚體、溫度、微生物群落組成等[31])具有更強(qiáng)烈的間接干擾作用，影響了酶活性比與土壤元素組成間的相關(guān)性[5]，而這些因子在本研究中并未測定。另一方面，本研究的特殊性在于農(nóng)田持續(xù)的外源底物供應(yīng)，往往比土壤原有底物更容易被生物利用，從而擾亂了土壤中酶系統(tǒng)對原有底物的響應(yīng)特征。

4 結(jié)論

長期不同施肥顯著改變了褐土元素的化學(xué)計量特征。施用化肥主要促進(jìn)了土壤磷素固持，造成元素計量比C∶TP和TN∶TP顯著降低。施用有機(jī)肥可以促進(jìn)有機(jī)質(zhì)分解，提升有效磷含量，顯著降低土壤C∶AP與AN∶AP。

施肥加劇了土壤磷對微生物代謝的限制，化肥易加劇微生物碳和磷限制，有機(jī)肥可緩解土壤微生物資源限制程度。

褐土區(qū)土壤酶活性表達(dá)存在強(qiáng)烈的資源依賴性，有效氮在調(diào)節(jié)褐土酶活性和酶化學(xué)計量的變化上發(fā)揮著關(guān)鍵作用。