miR-370對肺癌細(xì)胞增殖、遷移活力的調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制研究

韓春全 黃 瓊

(漳州市第三醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 漳州 363000)

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤，發(fā)病率、死亡率均呈明顯上升趨勢[1-2]，雖然手術(shù)切除、放化療、靶向藥物等綜合治療的開展使患者的生存時間得以延長，但多數(shù)患者會因為基因突變而出現(xiàn)耐藥性、進(jìn)而影響療效及預(yù)后。因此，尋找新的治療靶點是肺癌相關(guān)研究的關(guān)注熱點。微小RNA(microRNAs，miRs)是一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的小分子RNA，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到不同作用。劉馨[3]的研究報道，肺癌組織中miR-370的表達(dá)顯著下調(diào)，EGFR的表達(dá)顯著上調(diào)且miR-370與EGFR的表達(dá)具有負(fù)相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步的雙熒光素酶實驗證實miR-370能夠與EGFR基因3’UTR結(jié)合，表明miR-370能夠靶向抑制EGFR的表達(dá)。EGFR是一種酪氨酸激酶受體，在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中能夠刺激癌細(xì)胞的增殖、遷移[4-7]，但miR-370是否通過靶向EGFR抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移尚未明確。為此，本實驗將以肺癌A549細(xì)胞株為對象，具體分析miR-370靶向EGFR調(diào)控癌細(xì)胞增殖、遷移的作用及機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞

肺癌A549細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2試劑

miR-370 mimic、陰性對照(NC)mimic購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，EGFR質(zhì)粒、空白質(zhì)粒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，miRNA提取分離試劑盒、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量檢測試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，細(xì)胞增殖活力MTS法檢測試劑盒購自Promega公司，EGFR的單克隆抗體購自Abcam公司。

1.1.3儀器

熒光定量PCR儀購自Bio-rad公司，酶標(biāo)儀購自Bio-tek公司，顯微鏡購自Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組

A549細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM中貼壁培養(yǎng)，常規(guī)消化傳代后接種在培養(yǎng)板中并分組干預(yù)，方法如下：對照組用不含mimic、質(zhì)粒的DMEM處理，NC mimic組轉(zhuǎn)染NC mimic、miR-370 mimic組轉(zhuǎn)染miR-370 mimic，空白質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒，空白質(zhì)粒+miR-370 mimic組同時轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒和miR-370 mimic，EGFR質(zhì)粒+miR-370 mimic組同時轉(zhuǎn)染EGFR質(zhì)粒和miR-370 mimic。

1.2.2miR-370表達(dá)的檢測

傳代后的A549細(xì)胞接種在12孔培養(yǎng)板中，按照方法1.2.1部分分組干預(yù)48h，棄去培養(yǎng)基、保留細(xì)胞，采用miRNA提取分離試劑盒分離細(xì)胞中的miRNA，采用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用miRNA熒光定量檢測試劑盒配置PCR反應(yīng)體系并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增miR-370及U6，根據(jù)擴(kuò)增曲線計算miR-370的表達(dá)水平。

1.2.3細(xì)胞增殖活力的檢測

傳代后的A549細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板中，按照方法1.2.1項下分組干預(yù)48h，采用MTS法檢測細(xì)胞增殖活力，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上檢測490nm波長的吸光值、記為OD490。

1.2.4細(xì)胞遷移活力的檢測

傳代后的A549細(xì)胞接種在12孔培養(yǎng)板中，用黃槍頭在細(xì)胞板底部中央做一劃痕，在顯微鏡下觀察劃痕、拍照記錄并計算劃痕面積A0；按照方法1.2.1部分分組干預(yù)48h，在顯微鏡下觀察劃痕、拍照記錄并計算劃痕面積A24，按照(A0-A24)/A0計算相對愈合面積。

1.2.5EGFR表達(dá)的檢測

傳代后的A549細(xì)胞接種在12孔培養(yǎng)板中，按照方法1.2.1項下分組干預(yù)48h，棄去培養(yǎng)基、保留細(xì)胞，采用RIPA裂解液提取細(xì)胞中的蛋白并測定蛋白含量，取30μg蛋白進(jìn)行western blot檢測，先進(jìn)行電泳，而后電轉(zhuǎn)移至NC膜，5%脫脂牛奶室溫封閉NC膜1h，1∶1000稀釋的EGFR單克隆抗體4℃孵育NC膜過夜；次日，1∶1000稀釋的HRP二抗室溫孵育NC膜1h，最后顯影得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值計算表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，3組間計量資料的比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-370 mimic對A549細(xì)胞中miR-370表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)染miR-370 mimic后，miR-370 mimic組A549細(xì)胞中miR-370的表達(dá)水平明顯高于對照組及NC mimic組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組A549細(xì)胞中miR-370表達(dá)的比較

2.2 miR-370 mimic對A549細(xì)胞增殖活力的影響

轉(zhuǎn)染miR-370 mimic后，miR-370 mimic組A549細(xì)胞的OD490水平明顯低于對照組及NC mimic組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 3組A549細(xì)胞OD490水平的比較

2.3 miR-370 mimic對A549細(xì)胞遷移活力的影響

轉(zhuǎn)染miR-370 mimic后，miR-370 mimic組A549細(xì)胞的相對愈合面積明顯低于對照組及NC mimic組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表3。

圖1 3組A549細(xì)胞的劃痕圖像

2.4 miR-370 mimic對A549細(xì)胞EGFR表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)染miR-370 mimic后，miR-370 mimic組A549細(xì)胞中EGFR的表達(dá)水平明顯低于對照組及NC mimic組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、表4。

圖2 3組A549細(xì)胞EGFR的蛋白電泳圖

表4 3組A549細(xì)胞中EGFR表達(dá)水平的比較

2.5 過表達(dá)EGFR對miR-370 mimic調(diào)節(jié)A549細(xì)胞增殖、遷移的影響

與空白質(zhì)粒組比較，空白質(zhì)粒+miR-370 mimic組A549細(xì)胞的OD490水平、相對愈合面積明顯降低(P<0.05)；與空白質(zhì)粒+miR-370 mimic組比較，EGFR質(zhì)粒+miR-370 mimic組A549細(xì)胞的OD490水平、相對愈合面積明顯增加(P<0.05)，見表5。

表5 3組A549細(xì)胞OD490水平、相對愈合面積的比較

3 討論

miRs是具有廣泛生物學(xué)功能的非編碼小分子RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)并產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。近年來，miRs在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用受到了越來越多關(guān)注，靶向原癌基因的miRs能夠發(fā)揮抑癌作用、靶向抑癌基因的miRs能夠發(fā)揮促癌作用，增加抑癌miRs表達(dá)或減少促癌miRs表達(dá)成為了治療惡性腫瘤的新靶點[8-10]。

miR-370是一種具有抑癌作用的miR，已有研究報道，miR-370對結(jié)腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞的增殖及遷移具有抑制作用[11-14]。國內(nèi)劉馨[3]的研究報道，肺癌組織中miR-370的表達(dá)顯著下調(diào)，提示miR-370能夠在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起到抑癌作用，但國內(nèi)尚無miR-370直接調(diào)控肺癌細(xì)胞增殖、遷移的相關(guān)基礎(chǔ)研究。本實驗選擇肺癌A549細(xì)胞是實驗對象，經(jīng)熒光定量PCR證實轉(zhuǎn)染miR-370 mimic能夠增加細(xì)胞中miR-370的表達(dá)后，進(jìn)一步觀察了細(xì)胞的增殖活力和遷移活力。經(jīng)MTS發(fā)生測定增殖活力可知：增加miR-370表達(dá)能夠抑制A549細(xì)胞的增殖；經(jīng)劃痕實驗測定遷移活力可知：增加miR-370表達(dá)能夠抑制A549細(xì)胞的遷移。以上結(jié)果表明，miR-370對肺癌細(xì)胞的增殖和遷移具有抑制作用，與其在肺癌組織中低表達(dá)的趨勢吻合，說明miR-370在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起抑癌作用。

國內(nèi)劉馨的研究對miR-370的靶基因進(jìn)行了初步探究，該研究通過雙熒光素酶報告基因的檢測證實miR-370靶向結(jié)合EGFR基因的3'UTR。EGFR在肺癌細(xì)胞的增殖、遷移中均起到促進(jìn)作用，miR-370靶向EGFR的作用與其抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移的作用吻合。本實驗在劉馨的研究基礎(chǔ)上觀察了miR-370在肺癌細(xì)胞中調(diào)控EGFR表達(dá)的作用，在增加miR-370的表達(dá)后，A549細(xì)胞中EGFR的表達(dá)水平明顯降低，說明miR-370能夠抑制肺癌細(xì)胞中EGFR的表達(dá)，與既往研究報道m(xù)iR-370靶向EGFR基因3'UTR的結(jié)果吻合。在此基礎(chǔ)上，本實驗還設(shè)計了表達(dá)EGFR的質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染miR-370 mimic的同時也轉(zhuǎn)染了表達(dá)EGFR的質(zhì)粒，在增加EGFR的表達(dá)后、miR-370抑制A549細(xì)胞增殖及遷移的作用發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，由此證實miR-370通過靶向抑制EGFR表達(dá)的方式抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移。

綜上所述，miR-370能夠降低肺癌細(xì)胞的增殖、遷移活力，抑制EGFR表達(dá)是miR-370發(fā)揮上述作用的分子機(jī)制之一。