CPNE7在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義△

師鑫鵬 李 賓 羅曉勇

(1.鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院放療科 洛陽 471009；2.河南洛陽市腫瘤臨床診療研究中心 洛陽 471009)

結(jié)直腸癌(CRC) 作為臨床常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤疾病，其全球發(fā)病率居全部惡性腫瘤的第3位，而死亡率排名第2，對人們生存質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。臨床上，腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展是一個多生物學(xué)機制共同參與的復(fù)雜過程，涉及表觀遺傳、基因、蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄等多路徑的異常改變。而近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展及腫瘤病理學(xué)機制研究進程的不斷推進，在相關(guān)基因、細胞因子檢測的基礎(chǔ)上，探討其表達水平與腫瘤疾病發(fā)生、病情特征及預(yù)后的關(guān)系，以提高腫瘤疾病臨床診治效果成為臨床研究的熱點。CPNE7為磷脂結(jié)合蛋白 Copine 家族的重要成員，在EMT、細胞分化等過程中發(fā)揮重要作用[1]。目前，CPNE7在結(jié)直腸癌中的表達及其作用研究少見報道，本研究主要探討結(jié)直腸癌中CPNE7表達及其臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

回顧性選擇2020年1月-2021年12月期間于我院行外科手術(shù)治療的90例結(jié)直腸患者為研究對象。經(jīng)手術(shù)獲取結(jié)直腸癌組織標(biāo)本和癌旁正常黏膜組織標(biāo)本(距離癌組織邊緣>5cm)，將標(biāo)本放置液氮中冷凍保存?zhèn)溆?。患者病歷資料：男58例，女32例；年齡50～68歲，平均年齡(58.45±2.31)歲。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)手術(shù)病理檢查確診；(2)本研究方案經(jīng)患者知悉，且簽署知情同意書；(3)原發(fā)性病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前有腫瘤相關(guān)放化療及免疫治療史者；(2)合并其他嚴(yán)重疾病者；(3)所收集的病歷資料不能滿足本研究需求者。

1.2 方法

1.2.1CPNE7表達檢測

實驗試劑、細胞系及組織樣本準(zhǔn)備齊全后予以腫瘤細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37℃，5% CO2的濕化培養(yǎng)箱。培養(yǎng)完成后，采用Western blotting免疫印跡法檢測標(biāo)本組織(結(jié)直腸癌組織和癌旁組織)和腫瘤細胞系中CPNE7的表達，采用免疫組化檢測結(jié)直腸癌組織芯片中CPNE7的表達。(1)免疫印跡檢測：參照免疫印跡檢測程序予以標(biāo)本組織和腫瘤細胞裂解、提取全蛋白，并予以蛋白濃度測定，孵育后用化學(xué)發(fā)光法檢測印跡。(2)免疫組化：取結(jié)直腸癌組織芯片烤片、脫蠟、脫水、修復(fù)抗原、孵育、PBS沖洗，滴加一抗、抗兔二抗后再孵育1h，與DAB反應(yīng)后復(fù)染，脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封片。(3)建立CPNE7穩(wěn)定過表達株：取CPNE7特異性引物行RT-PCR擴增，獲得與CPNE7對應(yīng)的cDNA，并予以亞克隆，同時建立穩(wěn)定的細胞系。(4) 劃痕及Transwell侵襲實驗：將腫瘤細胞接種后予以劃痕、培養(yǎng)，后開展侵襲實驗，于顯微鏡下對發(fā)生侵襲的細胞數(shù)量進行計數(shù)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1CPNE7在結(jié)直腸癌細胞系及組織中的表達

根據(jù)免疫印跡檢測結(jié)果，統(tǒng)計CPNE7在結(jié)直腸癌細胞系及組織中的表達。

1.3.2CPNE7在結(jié)直腸癌組織芯片中的表達

本組90例患者共取180份組織芯片進行檢測。采用公式H-score=Σpi(i+1)計算腫瘤組織CPNE7表達水平，其中i表示著色強度，pi為(陽性細胞數(shù)量/切片總細胞數(shù)量)×100%。

1.3.3CPNE7表達水平與腫瘤病理特征及預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)患者病歷資料的收集，統(tǒng)計患者腫瘤病理特征，包括腫瘤分化、浸潤、位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期，并統(tǒng)計患者總生存時間(OS)，分析CPNE7表達水平與腫瘤病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)數(shù)據(jù)記錄為百分比[n(%)]， 采用χ2檢驗。采用Kaplane-Meier法分析CPNE7表達水平與患者總生存時間(OS)的關(guān)系，log-rank檢驗。

2 結(jié)果

2.1 CPNE7在結(jié)直腸癌細胞系及組織中的表達

免疫印跡檢測6個結(jié)直腸癌細胞株：SW480、 SW620、HT29、LOVO、RKO和HCT116，及正常結(jié)直腸上皮細胞株HCoEpiC中CPNE7表達。結(jié)果顯示，CPNE7在結(jié)直腸癌細胞株中的表達明顯高于HCoEpiC(圖1A)。檢測8個結(jié)直腸癌組織及對應(yīng)癌旁正常組織中CPNE7表達水平，結(jié)果顯示，CPNE7在結(jié)直腸癌組織中的表達遠高于癌旁正常組織(圖1B)。

2.2 CPNE7在結(jié)直腸癌組織芯片中的表達

90例患者共180份樣本中，共84例(93.33%)患者出現(xiàn)腫瘤組織中CPNE7表達量高于癌旁組織(P<0.05)，見圖2。同時，H-score計算結(jié)果顯示：腫瘤組織中CPNE7高表達率為50.00%，高于癌旁組織的7.78%(P<0.05)，見表1。

圖2 結(jié)直腸癌組織芯片中CPNE7的表達

表1 結(jié)直腸癌組織芯片中CPNE7的表達[n(%)]

2.3 CPNE7與結(jié)直腸癌病理特征及預(yù)后的關(guān)系

在不同性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤位置、腫瘤浸潤深度上，CPNE7表達水平均無明顯差異(P>0.05)；但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N1、N2者CPNE7高表達率均高于N0者(P<0.05)，TNM分期Ⅲ期者CPNE7高表達率高于I期、Ⅱ期者(P<0.05)，見表2。

表2 CPNE7表達與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 CPNE7表達與患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，CPNE7表達水平與患者預(yù)后相關(guān)(P<0.05)，見圖3。

3 討論

根據(jù)IARC調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2020年，全球癌癥死亡病例為996萬例，癌癥已經(jīng)成為人類健康的最大威脅之一[2]。近年來隨著腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療和生物醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)技術(shù)的快速發(fā)展，標(biāo)志著精準(zhǔn)醫(yī)療時代的到來，從分子生物學(xué)機制探討腫瘤細胞及組織中的基因表達模式，并分析促癌基因產(chǎn)生的促癌效應(yīng)及對腫瘤細胞的影響，對腫瘤疾病的診斷、治療及預(yù)后評估具有重要的意義。CPNE蛋白為具有特殊生物學(xué)特征的DNA結(jié)合區(qū)，其中CPNE7基因位于人類染色體7p22.1[3]，目前國外已有大量前沿文獻報道證實，CPNE7對多種腫瘤細胞的增值、遷移和侵襲具有調(diào)控作用，臨床上通過對調(diào)控機制的研究，以尋找特異性靶點，可為腫瘤的靶向治療提供重要信息[4]。

本研究主要探討CPNE7在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義，研究結(jié)果顯示：CPNE7在結(jié)直腸癌細胞株中的表達明顯高于正常結(jié)直腸上皮細胞株，且在結(jié)直腸癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，提示CPNE7在結(jié)直腸癌組織中呈高表達態(tài)勢。在基因表達學(xué)上，其表達過程是將遺傳特征通過生物學(xué)效應(yīng)合成一定的產(chǎn)物，并發(fā)揮多種生物學(xué)作用[5]。在正常組織及細胞中，基因通過調(diào)控機制使其相應(yīng)蛋白維持在正常水平，并發(fā)揮正常的細胞表型，如低增值、低遷移、低侵襲；而在腫瘤組織及細胞中，基因表達模式發(fā)生異常，造成腫瘤細胞出現(xiàn)惡性表型，如高增值、高遷移、高侵襲，并通過其表達差異產(chǎn)生促癌效應(yīng)，促進腫瘤病情的進展[6-7]。從本研究結(jié)果來看，CPNE7在結(jié)直腸癌組織及細胞中的高表達，是造成結(jié)直腸癌細胞出現(xiàn)惡性表型的重要機制之一，提示CPNE7在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的生物學(xué)作用。

通過對基因、蛋白及腫瘤標(biāo)志物的檢測以判斷腫瘤病情及評估患者預(yù)后是當(dāng)前腫瘤防治體系的重要組成部分[8]。本研究結(jié)果顯示：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N1、N2者CPNE7高表達率均高于N0者(P<0.05)，TNM分期Ⅲ期者CPNE7高表達率高于I期、Ⅱ期者(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，CPNE7表達水平與患者預(yù)后相關(guān)(P<0.05)。提示CPNE7在結(jié)直腸癌組織中的表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移類型、TNM分期及生存預(yù)后密切相關(guān)。CPNE 家族蛋白在腫瘤病理機制中的生物學(xué)作用較為復(fù)雜，有研究報道指出CPNE7可促進NF-κB 活性顯著增強，而NF-κB在腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲及血管生成中發(fā)揮主要作用[9]，因此，在間接角度上，CPNE7可通過對NF-κB 活性的調(diào)控發(fā)揮促腫瘤細胞生長的作用，進而推進腫瘤病情的進展及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。也有研究報道強調(diào)，CPNE7是促乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要基因，也為其獨立的預(yù)后指標(biāo)[10]。因此，臨床上通過對結(jié)直腸癌患者CPNE7基因的檢測不僅能夠為腫瘤疾病的診斷、病情判斷及預(yù)后評估提供參考，同時能夠?qū)⑵渥鳛橹匾闹委煱悬c，針對性的研發(fā)對細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移具有抑制作用的靶向化合物，可有效預(yù)防腫瘤病情的進展，對改善患者預(yù)后具有重要的意義。

綜上所述，CPNE7在結(jié)直腸癌組織中高表達，與臨床病理關(guān)系密切且預(yù)后不良，為結(jié)直腸癌的早期診斷、預(yù)后判斷和治療提供了新思路。