響應(yīng)面法優(yōu)化茅巖莓茶黃酮的提取條件

王鑫俁，王菲，賈天賜，項(xiàng)冰，楊朝齊，楊磊

響應(yīng)面法優(yōu)化茅巖莓茶黃酮的提取條件

王鑫俁，王菲，賈天賜，項(xiàng)冰，楊朝齊，楊磊

（遼寧石油化工大學(xué) 石油化工學(xué)院，遼寧 撫順 113001）

為探討茅巖莓茶中黃酮的最佳提取工藝，以茅巖莓茶為原料，采用單因素和響應(yīng)面結(jié)合的方法，通過(guò)乙醇溶液浸提茅巖莓茶黃酮，對(duì)其提取條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，液料比為25 mL/g，水浴溫度為85 ℃，水浴時(shí)間為40 min；此時(shí)，黃酮得率為162.72 mg/g，與模型所給預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明優(yōu)化方法合理可行。

茅巖莓茶； 黃酮； 提?。?響應(yīng)面法

茅巖莓茶又名長(zhǎng)壽藤，學(xué)名為顯齒蛇葡萄，葡萄科，為野生藤本植物[1]，生長(zhǎng)于張家界800～1 500 m云霧山的紅砂巖中[2]。茅巖莓茶藥食兩用，不僅對(duì)上呼吸道感染、慢性支氣管炎、急慢性咽炎的治療有很好的效果，還能調(diào)節(jié)血壓、平衡血糖、降低血脂、軟化血管[3]。研究表明，茅巖莓茶中含有一種天然植物霜，主要成分為黃酮[4]。黃酮類化合物具有殺菌抗炎、抗氧化、抗癌、降脂降壓等多種保健效果[5?7]。

目前，科技工作者對(duì)黃酮類化合的研究越來(lái)越重視，因其特有的生物活性和藥用價(jià)值，研發(fā)了多種多樣的黃酮類保健品和藥物，滿足了相關(guān)人群的需求。因此，本文以黃酮含量較為豐富、現(xiàn)階段相關(guān)研究報(bào)道較少的茅巖莓茶為原料，研究茅巖莓茶黃酮提取的最佳條件，為其今后深入的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

茅巖莓茶，靈周茶葉有限公司；蘆丁，色譜純，合肥博美生物科技有限公司；乙醇（體積分?jǐn)?shù)為95%）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AR124CN電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；All basic分析研磨機(jī)，德國(guó)IKA公司；DUG?9021A電熱恒溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SB25?12DTD超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV?2600可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼克（上海）儀器有限公司；HH?4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；TDL?40B臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1茅巖莓茶黃酮提取 取茅巖莓茶于50 ℃電熱恒溫干燥箱中烘至恒重，冷卻后用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，密封保存，備用。稱取2.00 g茅巖莓茶粉末，按液料比5～40 mL/g加入體積分?jǐn)?shù)為20%～90%的乙醇溶液，攪拌均勻，在超聲功率為0～500 W的條件下處理0～9 min，取出，在水浴溫度為20～90 ℃保溫10～120 min后，離心取上清液，得到茅巖莓茶黃酮粗提液。

1.3.2黃酮得率的測(cè)定 測(cè)定黃酮得率采用NaNO2?Al(NO3)3?NaOH法[8?9]。以蘆丁質(zhì)量（）為橫坐標(biāo)，510 nm處的吸光度（）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)見(jiàn)表1?；貧w方程為=0.263 8+0.003，2=0.999 2，黃酮得率計(jì)算公式如下：

表1　標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

1.3.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 從單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析中，選擇各因素的水平范圍進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，從而得到茅巖莓茶黃酮的最適提取條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1超聲處理的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、液料比為15 mL/g、水浴溫度為50 ℃、水浴時(shí)間為20 min和超聲時(shí)間為5 min的條件下，分別考察超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)茅巖莓茶黃酮得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。當(dāng)考察超聲功率時(shí)，超聲時(shí)間為5 min；當(dāng)考察超聲時(shí)間時(shí)，超聲功率為50 W。

圖1　超聲功率對(duì)茅巖莓茶黃酮得率的影響

圖2　超聲時(shí)間對(duì)茅巖莓茶黃酮得率的影響

從圖1和圖2可以看出，超聲處理對(duì)茅巖莓茶黃酮得率的影響較小。這是因?yàn)槊r莓茶細(xì)胞壁組織軟，經(jīng)粉碎后被破壞，無(wú)需進(jìn)行超聲處理即可實(shí)現(xiàn)較好的黃酮提取效果。

2.1.2乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 在液料比為15 mL/g、水浴溫度為60 ℃和水浴時(shí)間為20 min的條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)茅巖莓茶黃酮得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)茅巖莓茶黃酮得率的影響

從圖3可以看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，提取效果最好。分析其可能的原因是：不同乙醇體積分?jǐn)?shù)具有不同的極性，對(duì)目標(biāo)物的溶解性有差異[10]。因此，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)乙醇體積分?jǐn)?shù)的三個(gè)水平分別選擇70%、80%和90%。

2.1.3液料比的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、水浴溫度為60 ℃和水浴時(shí)間為20 min的條件下，考察液料比對(duì)茅巖莓茶黃酮得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，隨著液料比的增加，黃酮得率先增加后趨于平穩(wěn)；液料比過(guò)高，不僅增加成本，而且導(dǎo)致黃酮濃度過(guò)低，需要延長(zhǎng)濃縮時(shí)間，給生產(chǎn)帶來(lái)負(fù)擔(dān)。因此，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)液料比的三個(gè)水平分別選擇15、20、25 mL/g。

圖4　液料比對(duì)茅巖莓茶黃酮得率的影響

2.1.4水浴溫度的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、液料比為15 g/mL和水浴時(shí)間為20 min的條件下，考察水浴溫度對(duì)茅巖莓茶黃酮得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5　水浴溫度對(duì)茅巖莓茶黃酮得率的影響

從圖5可以看出，當(dāng)水浴溫度為20～80 ℃時(shí)，隨著水浴溫度增加，黃酮得率增加，這是因?yàn)樗囟壬?，加快了黃酮的擴(kuò)散速度，提高了其溶解度[11]；當(dāng)水浴溫度為80 ℃時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值，繼續(xù)升高水浴溫度，黃酮得率下降。因此，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水浴溫度的三個(gè)水平分別選擇70、80、90 ℃。

2.1.5水浴時(shí)間的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、液料比為15 g/mL和水浴溫度為60 ℃的條件下，考察水浴時(shí)間對(duì)茅巖莓茶黃酮得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6　水浴時(shí)間對(duì)茅巖莓茶黃酮得率的影響

從圖6可以看出，當(dāng)水浴時(shí)間為10～30 min時(shí)，隨著水浴時(shí)間的增加，黃酮得率增加；當(dāng)水浴時(shí)間為30 min時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加水浴時(shí)間，黃酮得率下降。這主要是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的加熱處理導(dǎo)致乙醇溶液揮發(fā)，溶劑濃度減小，極性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致黃酮得率降低[12]。因此，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水浴時(shí)間的三個(gè)水平分別選擇10、30、50 min。

2.2 基于響應(yīng)面法的茅巖莓茶總黃酮提取條件優(yōu)化

2.2.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇水浴溫度、水浴時(shí)間、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，黃酮得率為因變量（響應(yīng)值），進(jìn)行4因素3水平的Box?Behnken實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，實(shí)驗(yàn)回歸模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表2　Box?Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平

表3　Box?Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4　Box?Behnken實(shí)驗(yàn)回歸模型方差分析結(jié)果

注：**代表極顯著；*代表顯著。

該模型2=0.798 2，變異系數(shù)較?。?5.28%），說(shuō)明模型誤差小，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定、可靠，擬合度良好。由表4可知，模型值0.000 1，表明該模型極顯著，其統(tǒng)計(jì)學(xué)上是有意義的。值能夠表示各因素在實(shí)驗(yàn)中對(duì)提取效果的作用程度，值越小，其作用就越大，由此可推斷4個(gè)因素的作用影響排序?yàn)椋?>>，即液料比>水浴時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>水浴溫度。其中，液料比的影響顯著，交互項(xiàng)的影響顯著。由Design?Expert 8.02軟件得出茅巖莓茶黃酮得率（）與各影響因素的回歸方程為：

=149.97-0.09+2.78+13.54+0.65+7.77+0.97+0.40+2.28-3.53+0.46-4.602-7.892-2.632-4.152（2）

2.2.2響應(yīng)面圖解析 3D響應(yīng)面是在其他兩個(gè)因素一定的條件下，另外兩個(gè)因素對(duì)茅巖莓茶黃酮得率的影響，響應(yīng)面坡面越陡峭，則響應(yīng)面受實(shí)驗(yàn)因素影響越大，相反則越小。圖7為乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、水浴溫度和水浴時(shí)間兩兩相互作用對(duì)黃酮得率影響的響應(yīng)面圖。從圖7可以看出，圖7（a）的響應(yīng)面陡峭程度最大，表明水浴溫度與水浴時(shí)間的交互作用對(duì)茅巖莓茶黃酮得率的影響最大。

（a）水浴時(shí)間和水浴溫度 （b）水浴溫度和液料比 （c）水浴溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù) （d）水浴時(shí)間和液料比 （e）水浴時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù) （f）乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比

2.2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 由響應(yīng)面軟件給出的最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)78.79%、液料比25.00 mL/g、水浴溫度86.58 ℃、水浴時(shí)間43.43 min；在此條件下，茅巖莓茶黃酮得率預(yù)測(cè)值為162.79 mg/g。為了方便生產(chǎn)操作，將上述條件取整為：乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、液料比25 mL/g、水浴溫度85 ℃、水浴時(shí)間40 min。為了驗(yàn)證該模型的可靠性，在優(yōu)化條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，茅巖莓茶黃酮得率實(shí)際值為162.72 mg/g，與預(yù)測(cè)值接近，表明此響應(yīng)面優(yōu)化法得到的優(yōu)化條件是準(zhǔn)確可行的。

3 結(jié) 論

（1）以茅巖莓茶為原料，采用溶劑浸提法提取茅巖莓茶黃酮，經(jīng)單因素結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)后得到其最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，液料比為25 mL/g，水浴溫度為85 ℃，水浴時(shí)間為40 min。此時(shí)，黃酮得率為162.72 mg/g，與模型所給預(yù)測(cè)值接近，表明優(yōu)化方法合理可行。

（2）該方法操作簡(jiǎn)便且黃酮得率較高，為提取茅巖莓茶黃酮提供了科學(xué)的理論基礎(chǔ)，也為茅巖莓茶的綜合開發(fā)利用提供了有效的參考依據(jù)。

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Extraction Conditions of Flavonoids from Maoyanberry Tea Using Response Surface Methodology

Wang Xinyu， Wang Fei， Jia Tianci， Xiang Bing， Yang Zhaoqi， Yang Lei

（School of Petrochemical Engineering， Liaoning Petrochemical University， Fushun Liaoning 113001， China）

In order to explore the best extraction technology of flavonoids from Maoyanberry tea, the extraction conditions of flavonoids from Maoyanberry tea were optimized by using the method of single factor and response surface. The results showed that the optimal extraction conditions were as follows: Ethanol volume fraction 80%, liquid?solid ratio 25 mL/g, water bath temperature 85 ℃, water bath time 40 min. Under these conditions, the yield of flavonoids was 162.72 mg/g, which was close to the predicted value of the model, indicating that the optimized method was reasonable and feasible.

Maoyanberry tea； Flavonoids； Extraction； Response surface methodology

TQ028.3

A

10.3969/j.issn.1672?6952.2022.03.005

1672?6952（2022）03?0025?05

http：//journal.lnpu.edu.cn

2021?02?27

2021?04?29

遼寧省教育廳一般科研項(xiàng)目（L2020015）；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2020101480005）。

王鑫俁（2000?），女，本科生，生物工程專業(yè)，從事生物化工研究；E?mail:3025198434@qq.com。

王菲（1982?），女，博士，講師，從事生物化工、食品生物技術(shù)研究；E?mail:107806708@qq.com。

（編輯 宋官龍）