對(duì)葉百部總生物堿保護(hù)H2O2誘導(dǎo)V79細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制研究

韋衛(wèi)寧， 許立拔， 王孝勛*， 楊雅鈞， 何石燕， 周彩燕

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 廣西 南寧 530200; 2.廣西壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣西 南寧 530200)

0 引言

細(xì)胞在遺傳機(jī)制下有序的凋亡,可以清除突變或老化受損的細(xì)胞,保證組織器官功能的正常運(yùn)行,但急性、大量的細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致組織器官損傷和功能異常[1].氧化應(yīng)激損傷及其所致細(xì)胞凋亡是多種疾病發(fā)生發(fā)展的發(fā)病機(jī)制之一,包括肺,被認(rèn)為是特發(fā)性肺纖維化的主要危險(xiǎn)因素[2].在臨床上,吸煙、輻射、石棉、粉塵等危險(xiǎn)因素,均可啟動(dòng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng).減輕機(jī)體過度的氧化應(yīng)激水平,抑制肺細(xì)胞過度凋亡,是防治多種肺部疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[1,3,4].而中藥及其有效成分天然的抗氧化能力及其對(duì)細(xì)胞凋亡的雙向調(diào)節(jié)作用,成為肺病治療、研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn).

對(duì)葉百部總生物堿是從對(duì)葉百部中獲取的多種生物堿的集合體,包括對(duì)葉百部堿、百部新堿、新對(duì)葉百部堿和金剛大堿等[5].有研究表明,對(duì)葉百部總生物堿具有抗肺纖維化作用、鎮(zhèn)咳等作用[6-8],但其抗氧化應(yīng)激作用尚未見報(bào)道.因此,本研究旨在觀察對(duì)葉百部總生物堿對(duì)H2O2所致中國倉鼠肺細(xì)胞V79增殖、凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,為對(duì)葉百部總生物堿在抗氧化應(yīng)激和抑制病理狀態(tài)肺細(xì)胞凋亡機(jī)制下,用于臨床肺部疾病的防治及深入研究,提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 主要材料及試劑

中國倉鼠肺細(xì)胞(V79)(KCB200811YJ),購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫.對(duì)葉百部,產(chǎn)地為廣西百色田林高龍鄉(xiāng),經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室韋松基教授鑒定,所采集的塊根歸屬百部科百部屬對(duì)葉百部StemonatuberosaLour..對(duì)葉百部總生物堿,廣西壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,批號(hào):20210315.3%H2O2溶液,美國SIGMA-ALDRICH公司,批號(hào)BCCC4031; 維生素E,養(yǎng)生堂藥業(yè)有限公司,批號(hào):20210320; 胎牛血清(FBS),浙江天航生物科技股份有限公司,批號(hào)21070701;ECL發(fā)光試劑盒和β-actin抗體,美國AFFINITY公司,批號(hào)7525和12W2944; 山羊抗兔的二抗和山羊抗鼠的二抗,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號(hào)為141987和214800903; Bax抗體,英國Abcam公司,批號(hào)GR3180247-24; Bcl-2抗體,美國Genetex公司,批號(hào)42970; Cleaved caspase-3抗體,美國Novus公司,批號(hào)g-2; DMEM培養(yǎng)液、Annexin-V/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒,江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,批號(hào)20210910和20210803; 噻唑藍(lán)(MTT)和RIPA裂解液,北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)1223G0531和20210902; 苯并咪唑熒光染料(Hoechst 33258)染液,上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào)110520210423.

1.1.2 主要儀器

Centrifuge5417R型低溫高速離心機(jī),德國Eppendorf公司; CKX53型倒置顯微鏡,日本Olympus公司; C170型CO2培養(yǎng)箱,德國Binder公司; DS-11型超微量紫外可見分光光度計(jì),美國Denovix公司; DYCZ-24DN型電泳儀,北京六一生物科技有限公司; WSE-4040型半干轉(zhuǎn)膜儀,日本ATTO公司; FilterMax F3多功能酶標(biāo)儀,美國Molecular Devices公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)葉百部總生物堿的制備

取對(duì)葉百部干燥塊根粉1 000 g,過3號(hào)篩,加10倍量甲醇超聲浸提40 min,過濾,揮干溶媒,加4%鹽酸2 500 mL充分混勻,抽濾,濾液用氨水調(diào)pH至9～10,用氯仿萃取至無色,萃取液揮干溶媒,置于冷凍干燥機(jī)冷凍72 h,得浸膏即為對(duì)葉百部總生物堿(得膏率0.52%,浸膏g∶原藥材g= 1∶192.31,使用酸性染料比色法檢測(cè)對(duì)葉百部總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為86.22%).

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

中國倉鼠肺細(xì)胞(V79)細(xì)胞,使用10% FBS,1%青鏈霉素中性DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng),置于CO2培養(yǎng)箱保持37 ℃、5%CO2和飽和濕度.

1.2.3 藥液的配制

對(duì)葉百部總生物堿先使用DMSO制備成濃度為250 mg/mL的儲(chǔ)存液,冷凍避光保存,臨用現(xiàn)溶,加適量DMEM培養(yǎng)液稀釋得到所需藥液濃度(DMSO終體積分?jǐn)?shù)不超過0.1%).

1.2.4 對(duì)葉百部總生物堿對(duì)V79細(xì)胞增殖的影響

計(jì)數(shù)處于對(duì)數(shù)生長期的V79細(xì)胞,稀釋至細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL,取100μL按設(shè)計(jì)接種至96 孔板中,2.0×104個(gè)/孔,另選6孔為調(diào)零孔僅加不含細(xì)胞的新鮮完全培養(yǎng)液200μL,剩余孔添加PBS液200μL.培養(yǎng)24 h,含細(xì)胞孔更換新鮮含藥完全培養(yǎng)液,每孔添加200μL,對(duì)葉百部總生物堿終濃度分別為 10μg/mL,22μg/mL,50μg/mL,112μg/mL和250μg/mL,另設(shè)空白孔,空白孔僅加新鮮完全培養(yǎng)液200μL,重復(fù)6個(gè)復(fù)孔.繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔添加5 mg/mL的MTT染液20μL,置培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)4 h后,吸干孔中液體,每孔添加DMSO 100μL并置于酶標(biāo)儀中37 ℃振蕩10 min,在570 nm波長處檢測(cè)吸光度(OD)值,并計(jì)算細(xì)胞存活率(%)[9].細(xì)胞存活率(%)=100%×(測(cè)定組OD值-調(diào)零孔OD均值)/(空白組OD均值-調(diào)零孔OD均值).

1.2.5 H2O2致V79細(xì)胞損傷模型的建立

計(jì)數(shù)處于對(duì)數(shù)生長期的V79細(xì)胞,稀釋至細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL,取100μL按設(shè)計(jì)接種至96 孔板中,2.0×104個(gè)/孔,剩余孔添加PBS液200μL.培養(yǎng)24 h,含細(xì)胞孔更換新鮮含H2O2完全培養(yǎng)液,每孔添加200μL,H2O2濃度分別為0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0和8.0 mmol/L,另設(shè)空白孔,空白孔僅加新鮮完全培養(yǎng)液200μL,重復(fù)6個(gè)復(fù)孔.繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔添加5 mg/mL的MTT染液20μL,置培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)4 h后,吸干孔中液體,每孔添加DMSO 100μL并置于酶標(biāo)儀中37 ℃振蕩10 min,在570 nm波長處檢測(cè)吸光度(OD)值,并計(jì)算細(xì)胞存活率(%).

1.2.6 對(duì)葉百部總生物堿對(duì)H2O2所致V79細(xì)胞損傷的影響

計(jì)數(shù)處于對(duì)數(shù)生長期的V79細(xì)胞,稀釋至細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL,取100μL按設(shè)計(jì)接種至96 孔板中,2.0×104個(gè)/孔,另選6孔為調(diào)零孔僅加不含細(xì)胞的新鮮完全培養(yǎng)液200μL,剩余孔添加PBS液200μL.培養(yǎng)24 h,含細(xì)胞孔更換新鮮H2O2濃度為5.0 mmol/L含藥完全培養(yǎng)液(對(duì)葉百部總生物堿終濃度分別為 10,22,50,112和250μg/mL,維生素E終濃度為100μg/mL)[10],每孔添加200μL,模型組(僅加含H2O2新鮮完全培養(yǎng)液200μL)和空白孔(僅加新鮮完全培養(yǎng)液200μL),重復(fù)6個(gè)復(fù)孔.繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔添加5 mg/mL的MTT染液20μL,置培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)4 h后,吸干孔中液體,每孔添加DMSO 100μL并置于酶標(biāo)儀中37 ℃振蕩10 min,在570 nm波長處檢測(cè)吸光度(OD)值,并計(jì)算細(xì)胞存活率(%).

1.2.7 對(duì)葉百部總生物堿對(duì)H2O2所致V79細(xì)胞損傷細(xì)胞凋亡率的影響

取對(duì)數(shù)生長期V79細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個(gè)/mL,將無菌蓋玻片放入6孔板內(nèi),每孔添加細(xì)胞混懸液1 mL,2×105個(gè)/孔.培養(yǎng)24 h,含細(xì)胞孔更換新鮮H2O2濃度為5.0 mmol/L含藥完全培養(yǎng)液(對(duì)葉百部總生物堿終濃度分別為50μg/mL,112μg/mL和250μg/mL,維生素E終濃度為100μg/mL),每孔添加1 mL,模型組(僅加含H2O2新鮮完全培養(yǎng)液1 mL)和空白孔(僅加新鮮完全培養(yǎng)液1 mL),重復(fù)6個(gè)復(fù)孔.繼續(xù)培養(yǎng)24 h,吸干孔中液體,每孔使用PBS液清洗2 mL清洗,重復(fù)3次,吸干孔中液體,每孔添加10%中性福爾馬林液0.5 mL,15 min后,吸干孔中液體,每孔使用PBS液清洗2 mL清洗,重復(fù)3次,吸干孔中液體,每孔添加Hoechst 33258染色液0.5 mL,用錫箔紙包裹6孔板,15 min后,吸干孔中液體,每孔使用PBS液清洗2 mL清洗,重復(fù)3次,吸干孔中液體,取出蓋玻片,晾干,使用PBS∶甘油=9∶1的抗熒光淬滅封片液封片,使用正置熒光顯微鏡每片連續(xù)計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞,記錄1 000個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)目,計(jì)算凋亡率[11,12].凋亡率(%)= 100%×(凋亡細(xì)胞數(shù)目/1 000).

1.2.8 Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)對(duì)葉百部總生物堿對(duì)H2O2所致V79細(xì)胞損傷細(xì)胞凋亡率的影響

取對(duì)數(shù)生長期V79細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個(gè)/mL,接種于6孔板內(nèi),每孔添加細(xì)胞混懸液1 mL,2×105個(gè)/孔.培養(yǎng)24 h,含細(xì)胞孔更換新鮮H2O2濃度為5.0 mmol/L含藥完全培養(yǎng)液(對(duì)葉百部總生物堿終濃度分別為50μg/mL,112μg/mL和250μg/mL,維生素E終濃度為100μg/mL),每孔添加1 mL,模型組(僅加含H2O2新鮮完全培養(yǎng)液1 mL)和空白孔(僅加新鮮完全培養(yǎng)液1 mL),重復(fù)3個(gè)復(fù)孔.繼續(xù)培養(yǎng)24 h,吸干孔中液體,每孔使用PBS液清洗2 mL清洗,吸干孔中液體,每孔添加0.25%胰酶(不含EDTA)0.5 mL,觀察細(xì)胞變鈍變圓后,加入1 mL新鮮完全培養(yǎng)液終止消化,吹打收集細(xì)胞,2 000 r/min,離心5 min,用1 mLPBS液清洗細(xì)胞2次,收集細(xì)胞,添加500μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞,再添加5μL Annexin V-FITC混勻,繼續(xù)添加5μL Propidium Iodide輕輕混勻,室溫、避光靜置10 min,在1 h內(nèi)完成流式細(xì)胞儀檢測(cè).

1.2.9 Western bolt法檢測(cè)對(duì)葉百部總生物堿對(duì)H2O2所致V79細(xì)胞損傷細(xì)胞Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期V79細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/mL,接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞生長匯合度達(dá)80%時(shí),吸干瓶中液體,用2 mLPBS液清洗細(xì)胞1次,更換新鮮H2O2濃度為5.0 mmol/L含藥完全培養(yǎng)液(對(duì)葉百部總生物堿終濃度分別為50μg/mL,112μg/mL和250μg/mL,維生素E終濃度為100μg/mL),每瓶添加5 mL,模型組(僅加含H2O2新鮮完全培養(yǎng)液5 mL)和空白孔(僅加新鮮完全培養(yǎng)液5 mL),重復(fù)3瓶.培養(yǎng)24 h,吸棄瓶中液體,PBS清洗3次,每瓶添加0.25%胰酶1 mL,觀察細(xì)胞變鈍變圓后,加入2 mL新鮮完全培養(yǎng)液終止消化,吹打收集細(xì)胞,2 000 r/min,離心5 min,用2 mLPBS液清洗細(xì)胞2次,收集細(xì)胞.加入500μL的RIPA裂解液,充分混勻,置于冰箱冷藏過夜后,置于低溫高速離心機(jī)4 ℃,12 000 r/min離心10 min,取上清備用.測(cè)定蛋白水平后,加入4×蛋白上樣緩沖液,混勻,95 ℃變性10 min,在50 v電壓下使樣品通過濃縮膠與分離膠分離,轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,將膜置于抗體Bax(1∶5 000),Bcl-2(1∶1 000),Cleaved caspase-3(1∶2 000)中,4 ℃反應(yīng)過夜,TBST室溫下避光洗膜3次,二抗(山羊抗鼠1∶3 000)孵育90 min,TBST清洗3次,將膠片掃描后,用image j軟件測(cè)定條帶灰度值,分析蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3表達(dá)水平[13].

1.2.10 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)葉百部總生物堿對(duì)V79細(xì)胞存活率的影響

表1顯示,與空白組比較,對(duì)葉百部總生物堿250μg·mL-1及以下細(xì)胞暴露終濃度對(duì)V79細(xì)胞作用24 h后細(xì)胞存活率均無顯著差異(P>0.05),說明對(duì)葉百部總生物堿250μg·mL-1及以下細(xì)胞暴露終濃度對(duì)V79細(xì)胞無明顯毒性作用.

表1 對(duì)葉百部總生物堿對(duì)V79細(xì)胞存活率的 影響

2.2 H2O2對(duì)V79細(xì)胞存活率的影響

表2顯示,與空白組比較,H2O20.5 ～ 8.0 mmol·L-1細(xì)胞暴露終濃度對(duì)V79細(xì)胞作用24 h后細(xì)胞存活率均顯著降低(P<0.01),IC50為4.42±0.45 mmol·L-1,故后續(xù)試驗(yàn)采用H2O2細(xì)胞暴露終濃度為略大于IC50的5.0 mmol·L-1作為造模濃度.

表2 H2O2對(duì)V79細(xì)胞存活率的影響

2.3 對(duì)葉百部總生物堿對(duì)H2O2所致V79細(xì)胞損傷細(xì)胞存活率的影響

表3顯示,經(jīng)H2O2細(xì)胞暴露終濃度為5.0 mmol·L-1處理24 h后,與空白組比較,模型組V79細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01),說明V79細(xì)胞氧化損傷模型造模成功.與模型組比較,對(duì)葉百部總生物堿各細(xì)胞暴露終濃度均可增加H2O2所致V79細(xì)胞損傷的細(xì)胞存活率,其中22～250μg·mL-1細(xì)胞暴露終濃度存活率顯著增加(P<0.05,P<0.01),故后續(xù)試驗(yàn)采用細(xì)胞暴露終濃度50μg·mL-1、112μg·mL-1和250μg·mL-1.

表3 對(duì)葉百部總生物堿對(duì)H2O2所致V79細(xì)胞 損傷細(xì)胞存活率的影響

2.4 對(duì)葉百部總生物堿對(duì)H2O2所致V79細(xì)胞損傷細(xì)胞凋亡率的影響

圖1、表4顯示,空白組V79細(xì)胞核可見微弱淡藍(lán)色熒光,偶見亮藍(lán)色熒光細(xì)胞核; 與空白組比較,經(jīng)H2O2細(xì)胞暴露終濃度為5.0 mmol·L-1處理24 h后,細(xì)胞核因染色質(zhì)濃縮而呈亮藍(lán)色染色的數(shù)目顯著增多(P<0.01),凋亡率顯著增加(P<0.01),染色質(zhì)碎片狀細(xì)胞核數(shù)目明顯增多; 與模型組比較,對(duì)葉百部總生物堿(50、112、250μg·mL-1)干預(yù)V79細(xì)胞24 h后,H2O2誘導(dǎo)V79細(xì)胞凋亡作用顯著減弱,細(xì)胞核呈亮藍(lán)色染色的數(shù)目顯著較少(P<0.01),凋亡率顯著減少(P<0.01),細(xì)胞凋亡數(shù)目減少與細(xì)胞暴露終濃度呈正相關(guān),濃度越大,細(xì)胞凋亡數(shù)目越少.

圖1 對(duì)葉百部總生物堿對(duì)H2O2所致V79細(xì)胞損 傷凋亡形態(tài)的影響(Hoechst 33258染色法,×200)

表4 對(duì)葉百部總生物堿對(duì)H2O2所致V79細(xì)胞 損傷細(xì)胞凋亡率的影響

2.5 對(duì)葉百部總生物堿對(duì)H2O2所致V79細(xì)胞損傷細(xì)胞凋亡率的影響

圖2、表5顯示,經(jīng)H2O2細(xì)胞暴露終濃度為5.0 mmol·L-1處理24 h后,與空白組比較,模型組V79細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.01);與模型組比較,對(duì)葉百部總生物堿細(xì)胞暴露終濃度50μg·mL-1、112μg·mL-1和250μg·mL-1均顯著降低H2O2所致V79細(xì)胞損傷的細(xì)胞凋亡率(P<0.01),細(xì)胞凋亡率減少與細(xì)胞暴露終濃度呈正相關(guān).

表5 對(duì)葉百部總生物堿對(duì)H2O2所致V79細(xì)胞 損傷細(xì)胞凋亡率的影響

圖2 對(duì)葉百部總生物堿對(duì)H2O2所致V79細(xì)胞 損傷凋亡的影響(流式細(xì)胞術(shù))

2.6 對(duì)葉百部總生物堿對(duì)H2O2所致V79細(xì)胞損傷相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響

圖3和表6顯示,經(jīng)H2O2細(xì)胞暴露終濃度為5.0 mmol·L-1處理24 h后,與空白組比較,模型組V79細(xì)胞促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01),抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)(P<0.05); 與模型組比較,對(duì)葉百部總生物堿各劑量組V79細(xì)胞促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達(dá)均下調(diào),其中112μg·mL-1和250μg·mL-1劑量組差異具有顯著性(P<0.05),抑凋亡蛋白Bcl2表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01).

圖3 對(duì)葉百部總生物堿對(duì)H2O2所致V79細(xì)胞 損傷相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響

表6 對(duì)葉百部總生物堿對(duì)H2O2所致V79細(xì)胞 損傷細(xì)胞凋亡率的影響

3 結(jié)論

在肺部炎癥疾病發(fā)生發(fā)展過程中,氧化應(yīng)激損傷是重要的發(fā)病機(jī)制.細(xì)胞凋亡在健康機(jī)體內(nèi)屬于基因控制細(xì)胞具有自主性的死亡方式,但當(dāng)機(jī)體氧化和抗氧化失衡,特別是氧化自由基的大量堆積,就會(huì)導(dǎo)致肺細(xì)胞線粒體損傷,激活caspase家族,如Cleaved Caspase-3、caspase-9和caspase-3等,促進(jìn)肺細(xì)胞凋亡[14，15].Bax是促凋亡蛋白,其在凋亡早期可易位至線粒體外膜,增加外膜通透性,激活caspase家族,促進(jìn)細(xì)胞凋亡; 而Bcl-2是抑凋亡蛋白,其能夠調(diào)節(jié)線粒體外膜完整性和功能,抑制凋亡死亡程序,調(diào)整凋亡的穩(wěn)態(tài)平衡[14].Bax和Bcl-2在機(jī)體內(nèi)的比例,決定細(xì)胞的存活和凋亡,是評(píng)價(jià)藥物抑制細(xì)胞凋亡或促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)[16，17].有研究表明,對(duì)葉百部及其生物堿類成分有鎮(zhèn)咳、抗肺纖維化作用等作用[6-8,18],而氧化應(yīng)激損傷是特發(fā)性肺纖維化的主要危險(xiǎn)因素[2],故認(rèn)為增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力可能是對(duì)葉百部總生物堿拮抗肺纖維化的重要機(jī)制.

氧化應(yīng)激損傷誘發(fā)細(xì)胞線粒體功能失調(diào),釋放活性氧化自由基(ROS),如超氧陰離子·O2-、過氧化氫(H2O2)和羥自由基(·OH)等,上調(diào)Bcl-2家族促凋亡蛋白表達(dá),可使線粒體功能發(fā)生障礙促凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)上調(diào),Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡和肺纖維化發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子[3,14,15].Bax和Bcl-2均是凋亡關(guān)鍵蛋白，是評(píng)價(jià)組織損傷程度的關(guān)鍵指標(biāo)[19].H2O2是機(jī)體ROS之一,也是體外試驗(yàn)多種細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的常用誘導(dǎo)劑,可直接導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)變性,還可透過細(xì)胞膜與還原型鐵離子通過Fenton反應(yīng)結(jié)合成活性更強(qiáng)的羥自由基,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死[20-22].Hoechst 33258 染色法是一種染色細(xì)胞核DNA，用于檢測(cè)細(xì)胞死亡是否與凋亡有關(guān)的方法.活細(xì)胞細(xì)胞核被染成淡藍(lán)色呈微弱熒光，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核被染成亮藍(lán)色呈強(qiáng)熒光染色，死亡不被染色[23].

本研究表明,H2O2作用于V79細(xì)胞24 h后,可使其細(xì)胞存活率顯著降低,凋亡形態(tài)觀察和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮呈亮藍(lán)色染色的數(shù)目顯著增多,凋亡率顯著增加,促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達(dá)顯著上調(diào),抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào),表明H2O2建立的V79細(xì)胞氧化應(yīng)激凋亡模型成功.

對(duì)葉百部總生物堿對(duì)V79細(xì)胞作用24 h后無明顯毒性,其可顯著增加H2O2所致V79細(xì)胞損傷細(xì)胞存活率,顯著減少凋亡率,下調(diào)促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達(dá),上調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá),說明對(duì)葉百部總生物堿有很好的拮抗H2O2所致V79細(xì)胞損傷細(xì)胞,抑制其過度凋亡,其機(jī)制可能與促進(jìn)抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)和抑制促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3表達(dá)有關(guān),有良好的抗擊肺炎的前景,可能是多種生物堿綜合作用的結(jié)果,具體某種生物堿發(fā)揮更強(qiáng)作用及強(qiáng)度尚不明確,有待于進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn).