抗間皮素CAR-T細胞治療胰腺癌的體外研究

田 靜， 白天凱， 張之勇， 閆 濱*

(1.山東中醫(yī)藥大學 藥學院， 山東 濟南 250355； 2.山東第一醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院， 山東 濟南 250013)

0 引言

胰腺癌(PC)是一種高度惡性的腫瘤，由于其患病機制不是很明確，與多種因素有關(guān)且易發(fā)生轉(zhuǎn)移和擴散，因此患病人數(shù)在世界各地都有增高的趨勢[1,2].對于早期治療，手術(shù)仍是首選治療方案，對不能手術(shù)者常做姑息性短路手術(shù)、化學療法和放射治療，但是許多患者對傳統(tǒng)的治療方法產(chǎn)生了抗藥性[3,4].除了傳統(tǒng)治療，后期還有免疫治療和靶向藥物等多種治療方法，但是據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，胰腺癌患者總生存率與過去20年無太大差別，胰腺癌仍然是最致命的癌癥類型之一,是常見癌癥中死亡率最高的腫瘤[5,6].因此,需要尋找更有效的胰腺癌治療手段.近年來發(fā)現(xiàn)嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)免疫療法在治療惡性腫瘤時能夠克服其他療法存在的諸多限制[7]，在血液腫瘤治療中顯示出明顯的優(yōu)勢，在實體腫瘤治療方面也顯示出巨大潛能，有望能夠大幅度提高患者生存質(zhì)量以及徹底根除胰腺癌[8,9].

對于CAR-T療法治療胰腺癌，目標抗原的選擇是成功的關(guān)鍵.目前已發(fā)現(xiàn)多個胰腺癌治療目標抗原，間皮素(mesothelin,MSLN)就是其中的潛在抗原靶點之一.它是一種40×103大小的糖基化膜蛋白，由間皮素編碼基因合成的71×103前 體蛋白加工處理而成[10-13].由于其在正常組織中的分布有限,而在腫瘤組織中高度表達，從而顯示了間皮素作為靶點的潛力.盡管 MSLN 在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚待深入研究，但是已有研究證實 MSLN 作為免疫治療靶點的安全性和有效性，包括靶向 MSLN 抗毒素、抗 MSLN抗體、MSLN 疫苗和抗 體偶聯(lián)藥物等，有望用于腫瘤的特異性治療[14-17].因此本研究選擇了間皮素(mesothelin，MSLN)作為治療靶點,通過構(gòu)建人源化抗MSLN scFv片段與41-BB、CD28、CD3ζ胞內(nèi)信號串聯(lián)的表達載體，成功制備了人源化抗MSLN CAR-T細胞,觀察了其在體外對PANC-1、ASPC-1兩種人胰腺癌細胞的殺傷功能,為CAR-T進一步改造以提高胰腺癌治療效果的探索及臨床試驗提供了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 主要實驗材料

白血病細胞系Jurkat購自ATCC,PANC-1細胞系由山東省醫(yī)學科學院贈送， ASPC-1細胞系購自武漢普諾賽生物公司，以上細胞支原體檢測均為陰性.

DMEM高糖無血清培養(yǎng)基(Gibico)、1640無血清培養(yǎng)基(Gibico)、Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibico)、胎牛血清(New Zealand) 、10 U/mL青霉素、 10 μg/mL鏈霉素(Gibico)、0.25%胰酶-含EDTA消化液(Gibico)、PBS(Gibico)、CCK8試劑 (SDGYF)、LDH細胞毒性檢測試劑盒(上海源葉)、MSLN5(SCFV)-3nd-CAR慢病毒載體(上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司)、豬苓多糖標準品(上海源葉)、黃芪多糖標準品(上海源葉)、香菇多糖標準品(上海源葉)、人參多糖標準品(上海源葉)、靈芝多糖標準品(上海源葉、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑 (Invitrogen)、抗人間皮素抗體(bioss，Bs-0300R)、單克隆抗體 (Abcam,EPR4509).

1.1.2 主要實驗儀器

生物安全柜 (上海力申科學儀器有限公司)、 酶標儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)、二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學儀器有限公司 )、Countess II 全自動細胞計數(shù)儀 (賽默飛世爾科技(中國)有限公司)、實時無標記細胞分析儀(美國安捷倫科技有限公司)、Roche Light Cycler 480實時定量PCR儀(Roche)、凝膠成像儀(天能公司)、PowerPac Basic基礎(chǔ)電泳儀(Bio-Rad)、蛋白檢測儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 MSLN-CAR 慢病毒載體構(gòu)建

人源化抗MSLN (ScFv) DNA片段購自吉凱基因公司，并委托該公司采用分子克隆技術(shù)將該抗MSLN的Sc Fv片段插入含CD3ζ鏈CD28共刺激分子組成的融合鏈克隆到帶綠色熒光蛋白 (GFP+) 標簽的慢病毒載體GV403中，名為SCFV(Meso5)-3nd-CAR.然后用 BamHI內(nèi)切酶切割重組慢病毒質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳測量.

1.2.2 MSLN-CAR慢病毒制備

轉(zhuǎn)染前1 d,將5×106生長狀態(tài)良好的HEK293T細胞傳入T-75培養(yǎng)瓶內(nèi).所有用于包裝慢病毒的質(zhì)粒都經(jīng)過去內(nèi)毒素大抽試劑盒標準流程提取，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒將5 μg MSLN-CAR轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、3.75 μg PSPX2包裝質(zhì)粒、1.25 μg VSVG包膜質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細胞,48 h后收取病毒原液,置于4 ℃保存.

1.2.3 MSLN CAR-T細胞構(gòu)建

取對數(shù)生長的jurkat細胞系用臺盼藍試劑染色計數(shù)，以每毫升2×105個細胞接種于6孔板中.用moi=100的慢病毒體積感染體外激活的jurkat細胞,培養(yǎng)箱內(nèi)感染10 h后換成新鮮培養(yǎng)基 (含人IL-2,200 IU/m L) .24 h后重復感染1次,72 h后獲取帶GFP+標簽的CAR-T細胞 .

1.2.4 qPCR 在基因水平檢測MSLN-CAR 的表達

PCR檢測CAR-T基因的相對表達量,引物序列見表1所示.

表1 引物序列及片段大小

細胞經(jīng)離心沉淀用1×PBS洗2次后，按照RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄標準程序進行,1 μL c DNA用于qRT-PCR,反應體系按照2×SYBR Green qPCR Mix(標準體系和步驟配制,Roche Light Cycler 480實時定量PCR儀(Roche)擴增,Bio-Rad Image Lab Software 5.2.1進行數(shù)據(jù)采集和分析,表達水平變化倍數(shù)按2-△△Ct值計算.

1.2.5 腫瘤細胞表達抗原檢測

哺乳動物蛋白抽提試劑盒分別收集ASPC-1和PANC-1全細胞樣本,按標準流程提取蛋白并測濃度,經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后孵兔抗人間皮素單克隆抗體過夜、洗膜3次、HRP標記羊抗兔二抗孵育,洗5次后滴加化學發(fā)光顯色劑進行檢測.

1.2.6 LDH法檢測細胞毒性實驗

以對數(shù)生長的ASPC-1和PANC-1胰腺癌細胞系作為靶細胞，jurkat細胞(Control T組)和MSLN-CAR-T細胞(CAR-T實驗組)作為效應T細胞.實驗前1 d將兩種靶細胞分別以1×104個/孔的密度接種于 96 孔板中，24 h后在各個靶細胞孔中按照效靶比1∶1、2∶1、4∶1、8∶1 分別加入相應數(shù)量的jurkat和MSLN CAR-T細胞，每孔終體積為 200 μL.另外設(shè)立空白對照組(只加培養(yǎng)基)、最高酶活性對照組、靶細胞對照組和效應T細胞對照組.所有孔混勻后 放置CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育約24 h后按照LDH細胞毒性檢測試劑盒標準流程進行，并用酶標儀測量各孔OD值 .殺傷效率.計算公式為：[實驗組OD值-靶細胞對照組OD值-效應T細胞對照組OD值]/[最高酶活性對照組OD值-靶細胞對照組OD值]×100%.

1.2.7 實時無標記細胞分析儀(RTCA)檢測細胞毒性實驗

取對數(shù)生長的ASPC-1、PANC-1癌細胞，加入適量0.25%胰酶消化后1 000 rpm，離心 3 min，然后取兩塊16孔RTCA電極培養(yǎng)板，在培養(yǎng)板中先加入50μL完全培養(yǎng)基，在儀器上調(diào)零.然后取出電極培養(yǎng)板，在對應電極培養(yǎng)基的板中每孔加入1×104個細胞，24 h后，暫停程序，取出電極培養(yǎng)板.按照效靶比8∶1、4∶1、2∶1在每塊板的對應孔中加入Control T和MSLN CAR-T細胞.分別在60 h和55 h后細胞殺傷結(jié)束，停止程序，保存數(shù)據(jù).所有試驗均進行3次及以上重復.

1.2.8 實時無標記細胞分析儀(RTCA)檢測多糖對MSLN CAR-T細胞的影響

先將香菇、靈芝、豬苓、黃芪、人參五種多糖的標準品用PBS稀釋至5 mg/mL的濃度，然后過0.22 um濾膜除菌備用.

取出培養(yǎng)狀態(tài)良好的Control T細胞和MSLN CAR-T細胞，實驗前1 d分別將細胞以1×104個/孔的密度接種于96孔板中 ，然后每孔分別加入100 ul含多糖(以2.5 mg/mL為原始濃度2倍比稀釋10個濃度)的細胞維持液，平行3個復孔，板內(nèi)設(shè)細胞對照組，24 h后cck8法檢測，選出對T細胞增殖無害的多糖濃度.然后通過RTCA檢測該多糖濃度對T細胞殺傷ASPC-1癌細胞的殺傷效率的影響.

1.2.9 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件(IBM SPSS Statistics 26,USA)進行單因素方差分析(ANOVA).所有實驗重復3次，結(jié)果以均數(shù)±標準差(SD)表示.當P<0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 MSLN CAR-T細胞的構(gòu)建

2.1.1 慢病毒表達載體的結(jié)構(gòu)與鑒定

采用分子克隆技術(shù)將該人源抗MSLN的Sc Fv片段(圖1(a))克隆到帶綠色熒光蛋白 (GFP+) 標簽的慢病毒載體GV403(圖1(b))中.用 BamHI內(nèi)切酶切割重組慢病毒質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖 2 所示，慢病毒載體質(zhì)粒大小為10 kb，產(chǎn)物大小與預期相符合，通過基因測序也證明與設(shè)計完全吻合，故慢病毒表達載體構(gòu)建成功.然后采用HEK293T作為工具細胞進行慢病毒包裝,轉(zhuǎn)染后，HEK293T熒光顯微鏡下可觀察到明顯的熒光(圖3(a)、(b))，表明目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常、目的質(zhì)粒熒光標記基因表達正常.

圖1 慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建圖譜

圖2 GV403質(zhì)粒載體酶切瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 熒光顯微鏡下慢病毒質(zhì)粒MSLN-CAR 轉(zhuǎn)染HEK392細胞(×200)

2.1.2 MSLN CAR-T細胞的感染效率

由于慢病毒質(zhì)粒中三代CAR序列含有CD3ζ序列，與其他MSLN CAR scfv元件一起形成外源性融合蛋白，故用qPCR檢測Control T細胞和MSLN CAR-T細胞的CD3ζ基因的相對表達，qPCR結(jié)果提示活化T細胞和MSLN CAR-T細胞均攜帶CD3ζ基因，但MSLN CAR-T的CD3ζ基因表達水平顯著高于活化T細胞(p<0.01)(圖4).另外熒光指示基因EGFP和CD3ζ序列共用一個啟動密碼子，因此綠色熒光也是CAR序列表達的另一依據(jù).慢病毒感染72 h后，已感染慢病毒的50%以上的T細胞上可見綠色熒光(圖5(a)、(b)、(c)、(d)).

圖4 qPCR檢測CD3ζ基因轉(zhuǎn)錄水平 (與Control T組比較，**表示P﹤0.01)

圖5 熒光顯微鏡下慢病毒質(zhì)粒MSLN-CAR 轉(zhuǎn)染 jurkat細胞(×200)照片

2.2 腫瘤細胞表面抗原檢測

通過Western Blot檢測ASPC-1和PANC-1兩種細胞表面mesothelin蛋白表達情況，結(jié)果顯示，兩種細胞在38KD處都有一條GAPDH蛋白條帶，在48KD出也都顯示出mesothelin蛋白條帶.但是ASPC-1細胞在48KD處條帶較寬，相比之下，PANC-1細胞在48KD處的條帶較窄(圖6(a))，說明在表達點樣量和濃度一致的情況下，ASPC-1的mesothelin蛋白表達量較高，然后通過數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)ASPC-1細胞mesothelin蛋白表達量大約是PANC-1的3倍(p<0.01)(圖6(b)).

圖6 western blot檢測mesothelin蛋白的表達 (與PANC-1細胞組比較，**表示P<0.01)

2.3 LDH 釋放法檢測細胞毒性

通過比較 MSLN CAR-T 細胞和活化 T 細胞對mesothelin 陽性表達的胰腺癌細胞 PANC-1、ASPC-1的細胞毒性，來評估 MSLN CAR-T 細胞在體外可能具有抗腫瘤作用.此外比較MSLN CAR-T細胞對兩種胰腺癌細胞的作用以評估m(xù)esothelin抗原蛋白表達量可能會影響MSLNCAR-T細胞對兩種胰腺癌細胞體外殺傷效應.根據(jù)酶標儀 OD 值計算結(jié)果顯示，CAR-T 細胞和活化 T 細胞對各靶細胞的抑制作用都隨效靶比的提高而增加，在效靶比為 1∶1、2∶1、4∶1 、8∶1時，MSLN CAR-T 細胞對MSLN陽性表達的ASPC-1、PANC-1細胞殺傷率顯著高于Control T 細胞對 ASPC-1細胞、PANC-1細胞的殺傷率(圖7(a)、(b))，表明MSLN CAR-T 細胞在體外可有效殺傷兩種胰腺癌細胞，另外MSLN CAR-T 細胞對mesothelin高表達的ASPC-1細胞殺傷率顯著高于mesothelin低表達的 PANC-1細胞(p<0.01)，而Control T 細胞對兩種胰腺癌細胞的殺傷率沒有顯著差別(圖7(c)、(d)),表明mesothelin具有成為ASPC-1或PANC-1細胞增殖引起的胰腺癌有效靶點的潛力.

圖7 LDH法檢測MSLN CAR-T細胞、活化 T 細胞對腫瘤細胞殺傷效率(與對照組比較， *表示P<0.05；**表示P<0.01)

2.4 實時無標記細胞分析儀(RTCA)

應用RTCA分別監(jiān)測ASPC-1腫瘤細胞生長曲線的變化60 h和PANC-1腫瘤細胞生長曲線的變化55 h.結(jié)果(圖8(a)、(b))顯示：與對照組相比，CAR-T 細胞組和ControlT細胞組生長曲線都有下降趨勢，尤其是CAR-T細胞組下降趨勢較明顯，因此在效靶比為 2∶1、4∶1 、8∶1時，MSLN CAR-T 細胞和ControlT細胞對兩種癌細胞都有殺傷效應，且MSLN CAR-T 細胞對兩種癌細胞殺傷率顯著高于Control T 細胞；另外，與PANC-1細胞相比，ASPC-1細胞生長曲線下降趨勢較明顯，表明 MSLN CAR-T 細胞對PANC-1細胞的殺傷率明顯低于mesothelin高表達的ASPC-1細胞.

圖8 RTCA實驗檢測MSLN CAR-T細胞、 活化T細胞對腫瘤細胞殺傷效率

2.5 五種多糖對MSLN CAR-T細胞殺傷ASPC-1的影響

通過cck8試劑檢測結(jié)果如圖9(a)、(b)所示，濃度為0.156 mg/mL的靈芝多糖和0.625 mg/mL香菇多糖在450 nm處的OD值明顯高于對照組，表明這兩個濃度的多糖在體外對兩種T細胞增殖有一定的作用.故在效靶比為4∶1的電極板孔中分別加入兩種濃度的多糖，用RTCA監(jiān)測50 h后發(fā)現(xiàn)：與單獨加CAR-T細胞組相比，加入0.156 mg/mL的靈芝多糖和0.625 mg/mL香菇多糖后ASPC-1細胞的生長曲線下降趨勢無太大差別(圖10).

圖9 CCK8法檢測五種多糖對MSLN CAR-T 細胞、活化T細胞增殖的刺激作用(與對照組比較， **表示P<0.01)

圖10 RTCA檢測多糖對MSLN CAR-T 殺傷ASPC-1癌細胞的影響

3 結(jié)論

實驗中用未感染慢病毒的活化T細胞與靶細胞共培養(yǎng)作為對照組，證實了MSLN CAR-T細胞對mesothelin陽性兩種靶細胞有明顯殺傷效應，而活化T細胞這兩種癌細胞殺傷作用效果無顯著差異，表明CAR-T細胞構(gòu)建成功以及mesothelin作為這兩種細胞靶點的可行性.同時與PANC-1細胞組相比，MSLN CAR-T細胞對mesothelin高表達的ASPC-1細胞的殺傷率明顯高于抗原低表達的PANC-1細胞，這表明腫瘤細胞表面抗原蛋白表達量可能與CAR-T細胞治療效果有關(guān).

另外，雖然上述結(jié)果表示在體外多糖對CAR-T細胞殺傷癌細胞的影響力較小，但是大量文獻都表明中醫(yī)藥對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有獨到的見解和認識，在腫瘤的防治中尤其在綜合治療和改善機體內(nèi)環(huán)境方面有獨特的優(yōu)勢[18-20].香菇多糖、人參多糖和豬苓多糖等對癌細胞有一定的抑制作用，且能調(diào)節(jié)免疫力，增加IL-2等細胞因子的分泌[21-23]，因此在體內(nèi)多糖對CAR-T治療胰腺癌的影響有待驗證.