楊海峰，王佳琪，甘曉雪，王樹森，韋東山，于鳳強(qiáng)

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，呼和浩特 010010；2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 沙漠治理學(xué)院，呼和浩特 010010；3 鄂爾多斯林業(yè)和草原事業(yè)發(fā)展中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000)

裸果木(Gymnocarposprzewalskii)為多年生半灌木，具有多分枝、葉線型、花兩性、花粉小等特征，是古地中海旱生植物區(qū)系的孑遺植物[1-3]，主要分布在中國(guó)的甘肅、青海、內(nèi)蒙古、新疆等地[4-5]。裸果木起源第三紀(jì)，經(jīng)歷冰期，積累了豐富的遺傳變異，有較高的遺傳多樣性，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)[6-7]。但隨著氣候變化，裸果木自然分布有向水源充足地區(qū)移動(dòng)的趨勢(shì)，適生區(qū)逐步縮小[8-9]。加之裸果木是荒漠地區(qū)動(dòng)物的食物來(lái)源之一，其數(shù)量日益減少，于1997年被認(rèn)定為國(guó)家一級(jí)保護(hù)植物[10-11]。裸果木數(shù)量減少的另一個(gè)原因是其繁殖具有一定的困難和局限性。在寧夏中衛(wèi)觀察發(fā)現(xiàn)，裸果木花期為降雨量集中月份，結(jié)實(shí)率不到1%[10]；在新疆阿合奇縣裸果木有性繁殖的結(jié)實(shí)率僅為6.37%，其有性繁殖困難[12]。有報(bào)道認(rèn)為在其無(wú)性繁殖中采用生根粉可促進(jìn)裸果木硬枝生根，在沙土中成活率達(dá)80%[13]，但傳統(tǒng)無(wú)性繁殖需要大量繁殖體，不利于野生資源的保護(hù)，且效率不高。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是解決珍稀林木種質(zhì)資源保護(hù)及可持續(xù)利用問(wèn)題的有效途徑之一，其具有外植體豐富、生長(zhǎng)迅速、繁殖系數(shù)大及占地面積小等特點(diǎn)[14]，可有效保存珍稀瀕危的林木種質(zhì)資源的多樣性，對(duì)于裸果木的種質(zhì)資源保護(hù)及可持續(xù)利用具有重要的應(yīng)用價(jià)值。有關(guān)裸果木的組織培養(yǎng)研究較少，僅見汪之波等[15]利用裸果木下胚軸為外植體，采用6-BA和NAA組合，成功獲得再生植株，但該途徑存在芽分化效率較低，愈傷較多，再生植株生根不理想等問(wèn)題，需要進(jìn)一步優(yōu)化該組培體系，但未見后續(xù)報(bào)道。因此，需要深入開展裸果木的植物組織培養(yǎng)研究工作，為裸果木的種質(zhì)資源保護(hù)及可持續(xù)利用提供一條有效途徑。

本研究利用裸果木健壯植株的莖段為外植體，進(jìn)行6-BA與IBA不同濃度組合的組織培養(yǎng)，篩選最佳愈傷增殖及不定芽分化配方，確定影響不定芽生根的關(guān)鍵因素，實(shí)現(xiàn)離體再生，同時(shí)對(duì)裸果木不定芽分化過(guò)程進(jìn)行解剖結(jié)構(gòu)分析，確定其起源。本研究對(duì)裸果木的快速繁殖，規(guī)模化應(yīng)用提供了相關(guān)研究基礎(chǔ)，同時(shí)為保護(hù)和繁衍這一珍稀植物種質(zhì)資源提供了一條新途徑。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)材料采自內(nèi)蒙古自治區(qū)烏拉特后旗呼和溫都爾鎮(zhèn)的郊區(qū)林場(chǎng)(E106.83，N40.95)，為自然生長(zhǎng)的裸果木健壯植株。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒將裸果木枝條截成長(zhǎng)2～3 cm帶葉片的莖段，流水沖洗4 h。之后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用75%酒精清洗2次，每次30 s，無(wú)菌水清洗2次，3%次氯酸鈉消毒2次，每次10 min。最后，無(wú)菌水清洗6～8次，無(wú)菌濾紙吸干，作為外植體備用。

1.2.2 初代愈傷誘導(dǎo)外植體接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1/2 MS+0.1 mg·L-1IBA+0.05 mg·L-1NAA+30 g·L-1糖+7 g·L-1瓊脂，pH 5.8)，光照培養(yǎng)16 h，黑暗8 h，培養(yǎng)溫度(25 ± 2) ℃。接種50瓶，每瓶2個(gè)莖段，4周后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)情況。

1.2.3 愈傷組織增殖及不定芽分化將誘導(dǎo)的愈傷組織接種到MS培養(yǎng)基內(nèi)，添加不同濃度水平6-BA(0、0.2、0.5、0.7、1.0、1.2、1.5、1.7、2.0 mg·L-1)和IBA(0、0.2、0.5、0.7、1.0、1.2、1.5、1.7、2.0 mg·L-1)的組合配比試驗(yàn)。每個(gè)激素組合接種25塊愈傷，重復(fù)3次。接種后，每周統(tǒng)計(jì)愈傷組織直徑、不定芽分化數(shù)量。

1.2.4 不定芽生根培養(yǎng)(1)確定適合不定芽生根的基本培養(yǎng)基。選擇生長(zhǎng)至約2 cm的裸果木不定芽，分別接種到蔗糖濃度30 g·L-1的MS、1/2 MS、WPM、DCR和SH的基本培養(yǎng)基內(nèi)(不含激素)，每個(gè)組合接種30個(gè)不定芽，重復(fù)3次。接種后，每周觀察不定芽生根狀況，第4周拍照并統(tǒng)計(jì)生根情況。

(2)確定適合不定芽生根的蔗糖濃度。選擇生長(zhǎng)至約2 cm的裸果木不定芽，接種到不含激素的SH培養(yǎng)基內(nèi)，設(shè)置蔗糖濃度梯度為0、10、20、30 g·L-1進(jìn)行培養(yǎng)。每個(gè)組合接種30個(gè)不定芽，重復(fù)3次。接種后，每周觀察不定芽生根狀況，第4周拍照并統(tǒng)計(jì)生根情況。

1.2.5 愈傷組織分化不定芽過(guò)程的解剖學(xué)觀察將裸果木由愈傷分化形成不定芽的過(guò)程，每隔3 d取樣，F(xiàn)AA固定，進(jìn)行石蠟切片[16]，切片厚度5 μm。芽點(diǎn)出現(xiàn)后的材料每隔3～6 d取樣，瓊脂糖固定，進(jìn)行振動(dòng)切片，厚度為30 μm。均采用蘇木精-伊紅染色(HE染色)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)指標(biāo)初代愈傷誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生愈傷的莖段數(shù)/接種莖段數(shù)) × 100%

生芽率= (產(chǎn)生不定芽的愈傷塊數(shù)/接種愈傷塊數(shù)) × 100%

平均不定芽數(shù)量=不定芽總數(shù)量/接種愈傷塊數(shù)

生根率= (產(chǎn)生不定根的不定芽總數(shù)/接種不定芽總數(shù)) × 100%

平均不定根數(shù)量=不定根總數(shù)/接種不定芽總數(shù)

1.2.7 數(shù)據(jù)處理、圖像分析方法本研究利用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 22.0顯著性分析，對(duì)石蠟、振動(dòng)切片采用尼康全自動(dòng)顯微鏡Ni-E拍照，imageJ、Photoshop(CC 2018)完成圖片拼合，Origin 2018繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 初代愈傷組織的誘導(dǎo) 裸果木莖段接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)至7 d，裸果木莖段基部開始膨脹，表面出現(xiàn)一層淡黃色愈傷(圖1，A)；培養(yǎng)至21 d，愈傷組織繼續(xù)增大，直徑約1 cm，為淡黃色、緊致、塊狀愈傷組織(圖1，B)；繼代28 d后，愈傷呈半透明淡黃色、質(zhì)地柔軟、長(zhǎng)勢(shì)良好(圖1，C)，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)90%。

2.2 6-BA和IBA對(duì)裸果木愈傷增殖的影響

2.2.1 愈傷增殖過(guò)程初代愈傷接種到6-BA與IBA不同濃度組合的愈傷增殖培養(yǎng)基(圖2，A)。增殖第10天，愈傷直徑增加約2 mm，顏色變?yōu)辄S綠色(圖2，B)。第20天，愈傷呈現(xiàn)3種分化方向，第1種愈傷體積明顯增大，直徑達(dá)2.5 cm，顏色變?yōu)樯铧S綠色(圖2，C)；第2種愈傷繼續(xù)增殖，直徑達(dá)1.5 cm，為半透明黃白色，分化出不定根(圖2，D)；第3種愈傷為黃綠色，增殖較慢，表面有少量不定芽分化形成(圖2，E)。培養(yǎng)至30 d，愈傷增長(zhǎng)較快，呈顆粒狀、翠綠色，繼續(xù)膨大，可占據(jù)培養(yǎng)基全部表面，內(nèi)部中空。

2.2.2 6-BA和IBA對(duì)愈傷增殖的影響根據(jù)裸果木愈傷直徑的相關(guān)數(shù)據(jù)，分析IBA、6-BA對(duì)裸果木愈傷增殖效果的影響(表1)。當(dāng)6-BA濃度保持固定，隨IBA濃度增加，愈傷直徑呈先增大后減小的顯著變化趨勢(shì)；當(dāng)IBA濃度保持固定，隨6-BA濃度增加，愈傷直徑未出現(xiàn)顯著性差異變化。同時(shí)對(duì)主體間效果檢定(表2)，IBA的F值大于6-BA，達(dá)18.259，且IBA對(duì)愈傷增殖的影響達(dá)到極顯著水平，因此，本研究認(rèn)為IBA對(duì)裸果木愈傷增殖的影響高于6-BA，IBA為關(guān)鍵影響因子。在6-BA與IBA不同濃度組合中，1 mg·L-16-BA+1 mg·L-1IBA(圖2，G)、1 mg·L-16-BA+1.2 mg·L-1IBA(圖2，F(xiàn))、1.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA(圖2，H)愈傷組織直徑均值超過(guò)2.7 cm(圖3)。但組合1 mg·L-16-BA+1 mg·L-1IBA形狀更加規(guī)則、聚攏、褐化樣本少，繼代時(shí)，內(nèi)部中空現(xiàn)象少，故較好的愈傷增殖組合為1 mg·L-16-BA+1 mg·L-1IBA。

2.3 6-BA和IBA對(duì)裸果木不定芽分化的影響

2.3.1 不定芽的分化過(guò)程初代愈傷接種到6-BA與IBA不同濃度組合的不定芽分化培養(yǎng)基內(nèi)(圖2，A)。培養(yǎng)至第10天，愈傷組織直徑增加約2 mm，顏色由淡黃色向黃綠色轉(zhuǎn)變(圖2，B)；培養(yǎng)至12 d，黃綠色愈傷表面有綠色芽點(diǎn)凸起(圖4，A)；培養(yǎng)至21 d，芽點(diǎn)分化為不定芽，高約0.5 cm(圖4，B)；培養(yǎng)至28 d，部分不定芽繼續(xù)高生長(zhǎng)，形成節(jié)間(圖4，C)，上述愈傷組織繼代，愈傷表面不斷分化不定芽，可形成叢生芽(圖4，D)。

2.3.2 6-BA和IBA對(duì)不定芽分化的影響對(duì)第3周裸果木愈傷分化不定芽結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表3)，結(jié)果表明，不同濃度的6-BA與0或0.2 mg·L-1IBA組合，均可誘導(dǎo)愈傷分化不定芽。當(dāng)IBA為0或0.2 mg·L-1時(shí)，隨6-BA濃度增加，不定芽分化率呈先上升后下降趨勢(shì)，其中IBA為0 mg·L-1、6-BA為0.5 mg·L-1時(shí)，愈傷生成量少，不定芽分化率最高，達(dá)92.3%(圖5)，且平均分化不定芽數(shù)量4.9個(gè)/塊。而主體間效果檢定發(fā)現(xiàn)(表4)，IBA的顯著性達(dá)0.049，小于0.05，對(duì)不定芽誘導(dǎo)存在顯著影響，但0 mg·L-1IBA的生芽率明顯高于0.2 mg·L-1，說(shuō)明IBA抑制不定芽誘導(dǎo)，降低生芽率。結(jié)合上述內(nèi)容分析，低濃度6-BA可快速誘導(dǎo)裸果木愈傷分化不定芽，而高濃度6-BA不利于不定芽分化，IBA為不定芽誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素，起負(fù)調(diào)控作用。因此，基于前期裸果木愈傷誘導(dǎo)基礎(chǔ)，裸果木愈傷分化不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂。

2.4 裸果木不定芽生根的關(guān)鍵因素影響

2.4.1 基本培養(yǎng)基對(duì)生根的影響為分析基本培養(yǎng)基對(duì)裸果木生根的影響，本研究選擇MS、1/2 MS、WPM、DCR、SH為生根的基本培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。

表1 IBA和 6-BA組合對(duì)愈傷增殖的影響

表2 主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)

結(jié)果表明，培養(yǎng)至30 d，MS(圖6，A)、1/2 MS(圖6，B)、WPM(圖6，C)基本培養(yǎng)基上，不定芽莖生長(zhǎng)緩慢，基部愈傷較多，多數(shù)根沿培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，呈褐色，長(zhǎng)勢(shì)弱；DCR(圖6，D)、SH(圖6，H)基本培養(yǎng)基上，不定芽莖生長(zhǎng)較快，苗高達(dá)2.5 cm，生根率達(dá)82%以上(表5)，但DCR基本培養(yǎng)基中，不定芽基部愈傷多于SH基本培養(yǎng)基。在SH基本培養(yǎng)基中，基部?jī)H有少量愈傷，不定根呈乳白色，在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)良好，長(zhǎng)度可達(dá)3 cm， SH為適合裸果木生根的基本培養(yǎng)基。

表3 裸果木愈傷分化不定芽數(shù)量統(tǒng)計(jì)表

表4 主體間效果檢定

2.4.2 蔗糖濃度對(duì)生根的影響為分析蔗糖對(duì)裸果木生根的影響，本研究選擇添加不同蔗糖濃度的SH培養(yǎng)基為生根培養(yǎng)基進(jìn)行蔗糖濃度篩選。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)至40 d，蔗糖濃度為0 g·L-1的培養(yǎng)基上，不定芽生長(zhǎng)較快(圖7，A)，不定芽基部無(wú)愈傷生成，平均不定根數(shù)量達(dá)3.1個(gè)(圖7，E)；蔗糖濃度為10 g·L-1時(shí)，不定芽生長(zhǎng)快(圖7，B)，基部愈傷極少，平均不定根數(shù)量達(dá)5.7個(gè)(圖7，F(xiàn))；蔗糖濃度為20 g·L-1時(shí)，不定芽生長(zhǎng)較快(圖7，C)，基部愈傷較少、平均不定根數(shù)量達(dá)5.3個(gè)(圖7，G；表6)；蔗糖濃度為30 g·L-1時(shí)，不定芽莖生長(zhǎng)緩慢(圖7，D)，基部愈傷較多、不定根少(圖7，H)。據(jù)此分析，蔗糖濃度為10 g·L-1時(shí)，其生根率、不定根數(shù)量、生長(zhǎng)高度均為最佳，但其愈傷形成與0 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基相比，仍有少量愈傷形成，但該愈傷不影響植株生長(zhǎng)與移栽。因此，裸果木不定芽生根的最適培養(yǎng)基為SH+0～10 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂。本研究認(rèn)為不添加蔗糖或低濃度蔗糖是裸果木誘導(dǎo)生根的關(guān)鍵因素之一。

表5 裸果木不定芽生根統(tǒng)計(jì)表(基本培養(yǎng)基)

表6 裸果木不定芽生根統(tǒng)計(jì)表(蔗糖)

2.5 不定芽分化過(guò)程的解剖結(jié)構(gòu)分析 為確認(rèn)裸果木不定芽的起源，對(duì)裸果木愈傷分化過(guò)程進(jìn)行解剖結(jié)構(gòu)分析。培養(yǎng)0 d，細(xì)胞較大，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核小，染色淺(圖8，A)；培養(yǎng)3 d，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核增大，向分生細(xì)胞發(fā)育(圖8，B)；培養(yǎng)6 d，細(xì)胞核進(jìn)一步增大，染色深，具備團(tuán)狀分生組織結(jié)節(jié)(圖8，C)及具有導(dǎo)管結(jié)構(gòu)的維管組織結(jié)節(jié)(圖8，E)；培養(yǎng)9 d，維管組織結(jié)節(jié)形態(tài)持續(xù)增大，結(jié)節(jié)內(nèi)部多中心(圖8，D)；培養(yǎng)12 d，愈傷表面有綠色凸起，切片可見愈傷表層細(xì)胞的細(xì)胞核分布集中，形成生長(zhǎng)中心(圖8，F(xiàn))；培養(yǎng)15 d，生長(zhǎng)中心持續(xù)極性生長(zhǎng)，細(xì)胞核占比增大，葉原基由生長(zhǎng)中心伸出(圖8，G)；培養(yǎng)18 d，生長(zhǎng)中心頂部分化出生長(zhǎng)錐，長(zhǎng)出愈傷(圖8，H)；培養(yǎng)28 d，不定芽具備生長(zhǎng)錐、節(jié)間、葉片等結(jié)構(gòu)(圖8，I)，愈傷內(nèi)部維管組織結(jié)節(jié)解體，腋芽原基由不定芽基部分化(圖8，I箭頭)。上述裸果木愈傷分化不定芽進(jìn)程分析表明，不定芽由愈傷表層分生細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，為外起源。

3 討 論

3.1 激素對(duì)裸果木不定芽分化的影響

激素是影響不定芽分化的關(guān)鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度6-BA與0、0.2 mg·L-1IBA組合可誘導(dǎo)愈傷分化不定芽，不定芽分化率隨6-BA濃度增加，呈先上升后下降的趨勢(shì)，6-BA為0.5 mg·L-1，IBA為0 mg·L-1時(shí)，不定芽分化率顯著高于其他激素組合，因此認(rèn)為，適中濃度6-BA利于不定芽分化。汪之波等[15]以裸果木下胚軸為外植體，進(jìn)行裸果木的組織培養(yǎng)再生體系建立，認(rèn)為不定芽分化誘導(dǎo)的最適激素組合為1 mg·L-16-BA和0 mg·L-1NAA，高濃度6-BA不利于不定芽分化，與本研究結(jié)果基本一致。但該研究添加6-BA的濃度高于本研究的最適濃度，原因可能為兩個(gè)方面，其一可能是初始愈傷誘導(dǎo)的激素種類和濃度的差異，造成愈傷內(nèi)激素累積水平差異，導(dǎo)致后續(xù)芽分化中激素需求水平不同，其二可能是采用外植體的差異，汪之波采用下胚軸誘導(dǎo)愈傷，而本研究采用莖段誘導(dǎo)愈傷，可能是外植體自身生理狀態(tài)差異而導(dǎo)致。綜合分析，在裸果木芽分化誘導(dǎo)過(guò)程中，細(xì)胞分裂素6-BA具有重要作用，適中濃度6-BA有利于芽分化，而高濃度6-BA不利于芽的分化。

3.2 基本培養(yǎng)基和蔗糖濃度對(duì)裸果木生根的影響

基本培養(yǎng)基對(duì)裸果木生根具有重要影響。本研究發(fā)現(xiàn)，采用MS、1/2MS、DCR培養(yǎng)基時(shí)，愈傷形成較多，不定根由愈傷表面生成，移栽易脫落。采用WPM、SH培養(yǎng)基時(shí)，愈傷形成較少，多數(shù)根由莖基部直接分化形成，但WPM培養(yǎng)基中，不定根呈褐色，長(zhǎng)勢(shì)弱，SH培養(yǎng)基中，不定根呈乳白色，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。因此，SH培養(yǎng)基適合裸果木生根培養(yǎng)。究其原因，可能與基本培養(yǎng)基內(nèi)硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的應(yīng)用比例有關(guān)，MS、WPM、DCR 的硝銨比接近1∶1，而SH培養(yǎng)基硝態(tài)氮含量高、銨態(tài)氮含量低，硝銨比值差距大，達(dá)到25∶3，這可能是SH培養(yǎng)基更適合裸果木的生根的原因之一。根據(jù)裸果木的進(jìn)化生境分析，其主要分布西北荒漠地區(qū)，生境干旱、土壤貧瘠。根據(jù)苗艷芳等研究發(fā)現(xiàn)，干旱地土壤中硝銨比值差距大，為9∶1[17]，這與SH培養(yǎng)基中硝銨比值相似。因此認(rèn)為，硝銨比值大的SH培養(yǎng)基利于裸果木生根，這與其歷史進(jìn)化的生境可能存在相關(guān)性。

蔗糖是影響裸果木生的關(guān)鍵因素之一。本研究中，設(shè)置不同蔗糖濃度對(duì)比，發(fā)現(xiàn)低濃度或不添加蔗糖有利于裸果木生根及生長(zhǎng)發(fā)育，是影響裸果木生根的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度蔗糖培養(yǎng)基中，裸果木的莖基部形成較多愈傷，由愈傷表面分化出不定根，生長(zhǎng)緩慢，移栽時(shí)易脫落，影響成活率，但在低濃度或不添加蔗糖時(shí)，莖基部?jī)H有少量或不出現(xiàn)愈傷，由基部直接分化出根，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。因此，蔗糖濃度與愈傷形成存在直接關(guān)系，進(jìn)而影響著不定根的分化與發(fā)育。有關(guān)蔗糖與愈傷形成的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，低蔗糖濃度可抑制草莓(strawberry)花藥壁及花絲斷口處愈傷組織產(chǎn)生[18]。火焰衛(wèi)矛(Euonymusalatuscv. ‘Compacta’)組培苗生根時(shí)，低濃度蔗糖有利于組培苗形成不定根，促進(jìn)不定根生長(zhǎng)[19]。樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)組織培養(yǎng)不定根時(shí)也有相同發(fā)現(xiàn)，低濃度蔗糖利于不定芽生根[20]。綜上所述，低蔗糖濃度可抑制愈傷生成，利于不定根分化生長(zhǎng)。分析原因，裸果木主要分布西北荒漠地區(qū)，該地區(qū)土壤貧瘠，營(yíng)養(yǎng)元素少，導(dǎo)致該植物對(duì)養(yǎng)分獲取積極，蔗糖濃度較低有利于模擬其正常生長(zhǎng)生境，有利于根的分化和植物的整體生長(zhǎng)。因此，低濃度蔗糖利于裸果木不定芽生根。

3.3 不定芽起源分析

目前，植物組織培養(yǎng)不定芽有兩種起源方式，外起源與內(nèi)起源。多數(shù)植物僅存在外起源，而少數(shù)植物以外起源為主，內(nèi)起源為輔。本研究發(fā)現(xiàn)，裸果木不定芽起源于愈傷表層分生細(xì)胞，為外起源。許多植物的不定芽分化均為外起源，啤酒花(HumuluslupulusL.)愈傷分化形成的維管組織結(jié)節(jié)內(nèi)部的薄壁細(xì)胞及外部表層細(xì)胞均具有強(qiáng)大的分生能力，分化出不定芽，屬外起源[21]。辣椒(CapsicumannuumL.)不定芽起源于愈傷組織表層的分生細(xì)胞，同樣為外起源[22]。但也在其他少數(shù)植物的愈傷培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)外起源均存在，雜交構(gòu)樹(BroussonetiapapyriferaL. Vent)的不定芽組織培養(yǎng)誘導(dǎo)研究發(fā)現(xiàn)[23]，不定芽起源于愈傷組織表層細(xì)胞或內(nèi)部分生組織，兩者可發(fā)育成芽原基。裸果木愈傷再生不定芽起源與啤酒花和辣椒發(fā)現(xiàn)的外起源類似，但研究中未發(fā)現(xiàn)組織內(nèi)部出現(xiàn)芽原基，無(wú)內(nèi)起源證據(jù)。因此，本研究認(rèn)為裸果木愈傷再生不定芽為外起源方式。

本研究通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)，成功建立了裸果木器官發(fā)生途徑的高效再生體系，確定了再生不定芽為外起源及基本培養(yǎng)基和蔗糖濃度是影響裸果木生根的關(guān)鍵因素。本研究為裸果木這一珍稀瀕危的林木種質(zhì)資源保護(hù)及可持續(xù)利用奠定了研究基礎(chǔ)，提供了有效應(yīng)用途徑。