‘金冠’蘋果及其優(yōu)系(SGP-1)果實(shí)發(fā)育期間有機(jī)酸代謝特征比較

楊文淵，謝紅江，陶 煉，宦云敏，陳善波，林立金，廖明安*

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，成都 611130；2 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，成都610066；3 農(nóng)業(yè)部西南區(qū)域園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066；4 四川省林業(yè)科學(xué)研究院，成都 610081)

果實(shí)中有機(jī)酸的代謝是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，包括酸的合成、降解、利用及區(qū)域化的平衡，且有機(jī)酸含量及組分比例是決定果實(shí)酸度及風(fēng)味的重要組成因子[1]。因此，揭示果實(shí)中有機(jī)酸的調(diào)控機(jī)制對果實(shí)品質(zhì)調(diào)控及良種培育具有重要的意義。蘋果成熟果實(shí)中有機(jī)酸以蘋果酸為主，占60%以上，高的可占97%[2-4]，奎寧酸、檸檬酸、酒石酸、莽草酸、琥珀酸等含量低[5-6]。通常有機(jī)酸在果實(shí)生長過程中積累，在成熟過程中作為糖酵解、三羧酸循環(huán)(TAC環(huán))等呼吸基質(zhì)，以及糖原異生作用基質(zhì)而被消耗，其合成和降解過程是在酶促反應(yīng)下進(jìn)行的。蘋果果實(shí)中蘋果酸的積累受代謝關(guān)鍵酶調(diào)控，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和蘋果酸脫氫酶(MDH)負(fù)責(zé)蘋果酸合成，蘋果酸酶(ME) 和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PEPCK)負(fù)責(zé)蘋果酸的降解，液泡膜上的2個(gè)質(zhì)子泵H+-ATPase(VHA)和H+-焦磷酸酶(VHP)為蘋果酸的跨膜運(yùn)輸提供能量，目前已在蘋果[1,7-9]、歐李[10]、杏[11]、桃[12-13]等多種果實(shí)中證實(shí)以上6種代謝相關(guān)酶活性是影響蘋果酸積累速率的決定因素，但它們具體的作用機(jī)制還不太清楚。

經(jīng)過多年生產(chǎn)實(shí)踐，發(fā)現(xiàn)‘金冠’蘋果自然變異材料1份(暫定名‘SGP-1’)，具有低酸、少銹、耐貯藏等優(yōu)良性狀，彌補(bǔ)了‘金冠’蘋果易感銹、果酸味濃、易發(fā)綿等不足。本研究擬通過測定‘金冠’蘋果及其優(yōu)系‘SGP-1’果實(shí)發(fā)育期間有機(jī)酸組分和含量以及蘋果酸代謝相關(guān)酶活性，分析有機(jī)酸含量變化規(guī)律及其與蘋果酸代謝相關(guān)酶的關(guān)系，明確有機(jī)酸積累的關(guān)鍵時(shí)期和關(guān)鍵酶，探討‘金冠’和‘SGP-1’果實(shí)全發(fā)育期有機(jī)酸積累的生理差異，為調(diào)控蘋果果實(shí)酸度提供理論依據(jù)，也為深入研究‘SGP-1’果實(shí)有機(jī)酸代謝的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 參試材料及樣品采集

供試材料為四川省阿壩州蘋果園‘金冠’蘋果及其優(yōu)系‘SGP-1’的果實(shí)。在2019年4～9月，選取生長勢基本一致的3株蘋果樹進(jìn)行樣品采集，在花后7 d開始采集樣品，以后每20 d取1次樣，直至果實(shí)達(dá)到生理成熟(花后160 d左右)，1共取9次樣。幼果期至成熟期果實(shí)大小差異較大，因此每次取果量應(yīng)根據(jù)果實(shí)大小而定。樣品采集后，果實(shí)帶皮去心切碎，迅速用液氮冷凍(-196 ℃)后混勻，分兩份置于超低溫冰箱(-80 ℃)備用，一份用于檢測有機(jī)酸組分及含量，另一份用于分析蘋果酸代謝酶活性。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 果實(shí)中酸組分及含量果實(shí)中酸組分提取和測定參照劉雅蘭[14]、張麗麗等[15]的方法并略加改進(jìn)。稱取液氮研磨成粉的果肉2 g左右(計(jì)重)，加入4 mL 0.2%偏磷酸，搖勻，常溫超聲提取20 min，8 500 r/min離心10 min，殘?jiān)性偌尤? mL偏磷酸再次提取，合并上清液并定容到10 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，獲得樣品提取液待測。色譜條件：Agilent高效液相色譜儀(Agilent1260Ⅱ)，色譜柱為C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為純甲醇：0.02 mol/L K2HPO4(pH 2.6)= 3∶97，流速0.8 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。色譜純級的標(biāo)準(zhǔn)樣品蘋果酸、奎寧酸、檸檬酸和酒石酸由Sigma公司提供，用超純水分別制備成系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。將系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾到2 mL進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣后以峰面積(X)對濃度(Y)求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。將處理后的樣品提取液進(jìn)行液相色譜分析，進(jìn)樣量為10 μL，采用外標(biāo)法定量。有機(jī)酸含量為各酸組分相加之和。

1.2.2 果實(shí)中蘋果酸代謝相關(guān)酶活性樣品酶提取液制備參照 Hirai 等[16]和 Sadka 等[17]的方法。將0.5 g 果肉用 3 mL 的提取緩沖液[0.2 mol·L-1Tris-HCl 緩沖液(pH=8.2)、0.6 mol·L-1蔗糖、10 mmol·L-1異抗壞血酸]在冰上勻漿，8 000 g、4 ℃離心 10 min，取上清液置冰上，用于酶活性的測定。按照酶試劑盒說明書分別測定MDH、PEPC、ME、PEPCK、VHA和VHP活性，采用酶標(biāo)儀分光光度法測定吸光度(OD)值變化，每30 s記錄1次OD值，重復(fù)3次(1 min為1次重復(fù))，共記錄3 min，以每分鐘OD值變化0.01為1個(gè)酶活單位(U)，酶的活性以單位每克鮮果肉每分鐘表示(U·g-1·min-1)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用 Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖，測定結(jié)果以平均值±相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，應(yīng)用 SPSS20 進(jìn)行差異顯著性分析(Duncan’s新復(fù)極差法，0.05水平上測試)和相關(guān)性分析(Pearson法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘金冠’及‘SGP-1’果實(shí)發(fā)育過程中主要有機(jī)酸含量比較

2.1.1 有機(jī)酸含量在整個(gè)果實(shí)發(fā)育期，‘SGP-1’果實(shí)有機(jī)酸含量始終顯著低于‘金冠’果實(shí)；二者果實(shí)有機(jī)酸含量隨發(fā)育期的變化趨勢基本一致，均先升后降，并在花后27 d達(dá)到最高值，分別達(dá)到21.17 mg·g-1和23.74 mg·g-1(圖1)。其中，‘SGP-1’有機(jī)酸含量在花后47～67 d快速下降，降幅在50%左右，在花后87～127 d有機(jī)酸含量趨于穩(wěn)定；在成熟期(花后127～167 d)，‘SGP-1’和‘金冠’果實(shí)有機(jī)酸含量分別急劇下降至0.70 mg·g-1和1.40 mg·g-1，分別僅為峰值的3.31%和5.90%?？傊?，兩材料果實(shí)有機(jī)酸含量隨發(fā)育期的變化趨勢相似，但‘SGP-1’下降較早且快，自花后67 d開始，‘SGP-1’有機(jī)酸含量僅為‘金冠’的一半，并持續(xù)到果實(shí)成熟。

2.1.2 蘋果酸、奎寧酸、酒石酸和檸檬酸含量‘SGP-1’和‘金冠’果實(shí)有機(jī)酸主要由蘋果酸、奎寧酸、酒石酸和檸檬酸組成，幼果期均以奎寧酸為主，分別占比87.40%和64.00%，成熟期均以蘋果酸為主，分別占比50.10%和74.20%。

首先，在整個(gè)蘋果果實(shí)發(fā)育期，‘SGP-1’果實(shí)蘋果酸含量始終顯著低于‘金冠’，僅為‘金冠’的8.4%～67.4%(圖2，A)。在幼果期(花后7～47 d)和膨大期(花后67～107 d)，二者果實(shí)蘋果酸含量變化趨勢不同，‘SGP-1’在花后7 d達(dá)到峰值(4.15 mg·g-1)，而后急劇下降至0.83～1.01 mg·g-1之間；而‘金冠’蘋果酸含量幼果期快速上升，于花后47 d達(dá)到最高值(9.88 mg·g-1)，隨后緩慢遞減，在花后107～127 d趨于穩(wěn)定。在成熟期(花后127～167 d)，兩材料蘋果酸含量均急劇下降，僅為峰值的10%左右，此時(shí)‘SGP-1’蘋果酸含量是‘金冠’的1/3?？梢?， ‘SGP-1’蘋果酸積累的關(guān)鍵時(shí)期為果實(shí)發(fā)育初期，而‘金冠’蘋果酸積累關(guān)鍵期是幼果期和膨大期。

同時(shí)，‘SGP-1’和‘金冠’果實(shí)中奎寧酸和酒石酸含量變化趨勢一致，總體呈現(xiàn)先升后降的特征(圖2，B、C)。在幼果期，‘SGP-1’果實(shí)兩種酸含量大多顯著高于‘金冠’，且峰值均出現(xiàn)在花后27 d；‘SGP-1’和‘金冠’果實(shí)奎寧酸含量峰值分別為18.49 mg·g-1和15.19 mg·g-1；‘SGP-1’奎寧酸含量在幼果期比‘金冠’高出21.81%～37.41%(圖2，B)，彌補(bǔ)了其蘋果酸含量的不足(圖2，A)，使得兩材料有機(jī)酸整體含量變化趨于一致(圖1)。在以后發(fā)育期，兩材料果實(shí)奎寧酸和酒石酸含量均快速減少，至成熟期兩材料間差異不顯著。

另外，在整個(gè)果實(shí)發(fā)育期，‘SGP-1’和‘金冠’果實(shí)中檸檬酸含量變化趨勢一致(圖2,D)。在果實(shí)發(fā)育初期，‘SGP-1’檸檬酸含量顯著高于‘金冠’，并在花后7 d就達(dá)到峰值(0.67 mg·g-1)，而后大幅下降；在花后67～87 d，‘SGP-1’檸檬酸含量顯著低于‘金冠’；在成熟期，二者檸檬酸含量趨于一致，差異不顯著。

2.2 ‘金冠’及‘SGP-1’果實(shí)發(fā)育過程中酸代謝相關(guān)酶活性比較

2.2.1 MDH和PEPC活性‘SGP-1’和‘金冠’果實(shí)中MDH活性在果實(shí)發(fā)育過程中整體呈‘U’型變化，幼果期和成熟期MDH活性較高，膨大期活性較低(圖3,A)。其中，兩材料MDH 活性峰值出現(xiàn)時(shí)間不同，分別在花后47 d(52.42 U·g-1·min-1)和167 d(36.68 U·g-1·min-1)；除花后87 d和167 d外，其余時(shí)段兩材料MDH活性差異達(dá)到顯著水平。在幼果期，兩材料MDH活性變化趨勢相反，且‘SGP-1’中的MDH活性是‘金冠’的2倍左右，說明在幼果期‘SGP-1’蘋果酸的合成途徑更活躍。

同時(shí)，‘SGP-1’和‘金冠’果實(shí)中PEPC活性變化趨勢一致，均整體上先降后升，峰值均出現(xiàn)在花后7 d，分別為21.13 和17.10 U·g-1·min-1(圖3,B)。在幼果期，‘SGP-1’中PEPC活性顯著高于‘金冠’，最大差距為4倍，且降幅遠(yuǎn)小于‘金冠’；‘金冠’PEPC活性僅在花后107 d快速回升并顯著高于‘SGP-1’，而后又快速下降，至成熟期，兩材料PEPC活性均快速增加，并趨于一致，差異不顯著。

2.2.2 ME和PEPCK活性由圖4,A可知，‘SGP-1’和‘金冠’果實(shí)中ME活性隨著生育期的變化趨勢基本一致，在幼果期最高，后隨著果實(shí)發(fā)育快速下降，而在膨大期和成熟期又有所回升；整個(gè)發(fā)育期出現(xiàn)3個(gè)小高峰，最大值在花后27 d，‘SGP-1’和‘金冠’分別為42.36 和27.04 U·g-1·min-1。‘SGP-1’的ME活性在花后7～87 d顯著高于‘金冠’，差距在2～3倍；在花后107 d，‘金冠’的ME活性快速上升，顯著超過‘SGP-1’；在果實(shí)成熟時(shí)，兩材料的ME活性差異達(dá)到顯著水平。

同時(shí)，兩材料果實(shí)中PEPCK活性隨發(fā)育期的變化趨勢也基本一致，在幼果期最高，并在花后27 d達(dá)到峰值，‘SGP-1’和‘金冠’分別為56.65 和38.50 U·g-1·min-1，而后快速下降，成熟期略有所回升(圖4,B)。‘SGP-1’的PEPCK活性在幼果期顯著高于‘金冠’，而在成熟期顯著低于‘金冠’。

2.2.3 VHA和VHP活性‘SGP-1’和‘金冠’果實(shí)中質(zhì)子泵VHA活性隨生育期的變化趨勢基本一致，整體呈“W”型，在發(fā)育初期、膨大期和成熟期出現(xiàn)3個(gè)小高峰(圖5，A)。其中，‘SGP-1’果實(shí)的VHA活性在花后7～87 d顯著高于‘金冠’；之后，隨著果實(shí)發(fā)育，‘SGP-1’的VHA活性先下降后上升，在花后87 d達(dá)到最大值而后持續(xù)下降；到成熟時(shí)顯著低于‘金冠’，僅為‘金冠’的三分之一。

同時(shí)，由圖5，B可知，兩種材料果實(shí)的質(zhì)子泵VHP活性變化趨勢也一致，隨著果實(shí)發(fā)育先上升后下降再上升，并在幼果期和成熟期表現(xiàn)出較高活性。

表1 ‘金冠’和‘SGP-1’果實(shí)蘋果酸與其代謝相關(guān)酶活性的相關(guān)系數(shù)

‘SGP-1’果實(shí)VHP活性在幼果期顯著高于‘金冠’，從花后67 d開始則顯著低于‘金冠’；特別在花后107 d至成熟期，‘金冠’果實(shí)中VHP活性快速增加，一直保持較高水平，顯著高于‘SGP-1’，約是‘SGP-1’的2～3倍。

2.3 ‘金冠’及‘SGP-1’果實(shí)蘋果酸含量與其代謝酶活性的相關(guān)性

相關(guān)性分析表明(表1)，在幼果期(花后7～47 d)，‘SGP-1’蘋果酸含量與PEPC和VHA活性呈極顯著正相關(guān)，與MDH活性呈顯著負(fù)相關(guān)，而‘金冠’蘋果酸含量與MDH、PEPC和VHA活性均呈極顯著負(fù)相關(guān)；在果實(shí)膨大期(花后67～107 d)，‘SGP-1’蘋果酸含量與MDH、PEPC活性呈極顯著負(fù)相關(guān)，與PEPCK、VHA活性呈顯著正相關(guān)，而‘金冠’蘋果酸含量則與PEPC、ME、VHP活性呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)；在成熟期(花后127～167 d)，‘SGP-1’蘋果酸含量與MDH、PEPC、ME、VHA和VHP活性均呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)，而‘金冠’蘋果酸含量則與MDH、PEPC、ME和VHP均呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)。由此可知，對‘SGP-1’和‘金冠’蘋果酸積累起主要調(diào)控作用的關(guān)鍵酶在幼果期和膨大期存在較大差異，幼果期負(fù)責(zé)蘋果酸合成的關(guān)鍵酶不同，而膨大期負(fù)責(zé)蘋果酸降解和運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵酶不同，成熟期基本一致。

3 討 論

本研究對‘SGP-1’和‘金冠’蘋果果實(shí)發(fā)育過程中有機(jī)酸及各組分含量變化進(jìn)行了分析，二者差異達(dá)到顯著水平。特別是‘SGP-1’蘋果酸含量變化規(guī)律與‘金冠’相反，至成熟時(shí)只有‘金冠’的三分之一；加之，‘SGP-1’來源于‘金冠’變異優(yōu)系，二者遺傳背景相似，從果實(shí)發(fā)育期間各酸組分含量、蘋果酸代謝關(guān)鍵酶活性及相關(guān)關(guān)系，探討果實(shí)發(fā)育過程中降酸途徑及 ‘SGP-1’果實(shí)低酸成因，對高糖低酸新品種培育具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)‘SGP-1’果實(shí)中主要影響蘋果酸合成(MDH、PEPC)、降解(ME、 PEPCK)和轉(zhuǎn)運(yùn)(VHA和VHP)的關(guān)鍵酶活性，在幼果期均顯著高于‘金冠’，并沒有帶來‘SGP-1’果實(shí)蘋果酸的高積累，反而顯著低于‘金冠’；而且蘋果酸含量與兩個(gè)主要合成酶活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明合成只是蘋果酸積累的前提但不是唯一的因素，高的合成不能直接導(dǎo)致高的積累。這與姚玉新[7]在蘋果中的研究結(jié)論一致。Beruter[18]研究也發(fā)現(xiàn)在高酸和低酸的“Usterapfel”蘋果成熟過程中兩種合成酶活性沒有差異?？梢?，蘋果酸合成不是果實(shí)酸度差異形成的關(guān)鍵因素，而參與降解的ME、PEPCK和為運(yùn)輸提供能量的VHA和VHP的協(xié)同調(diào)控對蘋果酸含量變化及果實(shí)酸度差異形成起關(guān)鍵作用。

本研究結(jié)果表明負(fù)責(zé)蘋果酸降解的ME和PEPCK活性，在‘SGP-1’幼果期快速升高，且顯著高于‘金冠’，導(dǎo)致幼果期‘SGP-1’蘋果酸快速下降，積累偏少；而成熟期兩種材料蘋果酸含量急劇下降也伴隨有上述酶活性的回升，說明ME和PEPCK對兩種材料蘋果酸含量的下降起到重要作用，與前人在蘋果[7,19-20]、李[21]、櫻桃[22]上的研究結(jié)果一致。但它們是否受控制蘋果果實(shí)低酸性狀基因的調(diào)控，以及這些關(guān)鍵酶的作用都需進(jìn)一步研究。

質(zhì)子泵VHA和VHP為有機(jī)酸跨膜運(yùn)輸提供能量[23]，對果實(shí)液泡有機(jī)酸的貯藏起到了關(guān)鍵作用，為代謝產(chǎn)物和離子的次級運(yùn)輸提供能量[24]。本研究結(jié)果表明VHA和VHP的活性在果實(shí)發(fā)育過程中出現(xiàn)了3個(gè)小高峰，相關(guān)性分析也說明質(zhì)子泵活性直接影響著蘋果酸的積累，幼果期和膨大期VHA發(fā)揮主要作用，而成熟期VHP作用更顯著。相似的研究在蘋果[7]、柑橘[25]、葡萄[26]和梨[27]上也被發(fā)現(xiàn)。特別是在‘金冠’蘋果果實(shí)成熟過程中兩質(zhì)子泵活性顯著升高，增量大于‘SGP-1’，說明在酸度高的‘金冠’蘋果成熟過程中，需要提供更多能量來實(shí)現(xiàn)對蘋果酸的調(diào)節(jié)。但關(guān)于兩個(gè)質(zhì)子泵是如何調(diào)節(jié)果實(shí)酸度、果實(shí)有機(jī)酸的跨膜運(yùn)輸及調(diào)控機(jī)理等，還有待深入研究。

果實(shí)有機(jī)酸代謝是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，不同果實(shí)中控制果實(shí)有機(jī)酸含量的分子機(jī)制至今還不完全清楚。前人從分子水平研究了控制李[28]、蘋果[29]果實(shí)酸度候選基因，為調(diào)控果實(shí)酸度奠定了基礎(chǔ)，針對‘SGP-1’與‘金冠’果實(shí)酸度的顯著差異和不同發(fā)育期起主要調(diào)控作用的關(guān)鍵酶不同，下一步可深入挖掘了‘SGP-1’果實(shí)酸度調(diào)控的關(guān)鍵基因，并分析它們的功能，對改善果實(shí)品質(zhì)具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究證實(shí)了‘SGP-1’是以蘋果酸為主的低酸型‘金冠’蘋果變異優(yōu)系，該發(fā)現(xiàn)為深入研究果實(shí)低酸形成機(jī)理和培育高糖低酸新品種奠定了基礎(chǔ)。本研究還發(fā)現(xiàn)‘SGP-1’蘋果酸積累的關(guān)鍵時(shí)期為果實(shí)發(fā)育初期，并在幼果期就快速下降；而‘金冠’蘋果酸積累關(guān)鍵期是幼果期和膨大期，至成熟期才快速下降。‘SGP-1’蘋果酸代謝相關(guān)酶活性在幼果期均顯著高于‘金冠’，成熟期持平或顯著低于‘金冠’；二者幼果期負(fù)責(zé)蘋果酸合成的關(guān)鍵酶不同，膨大期負(fù)責(zé)蘋果酸降解和運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵酶不同，成熟期基本一致。