松葉豬毛菜NADP-蘋(píng)果酸酶基因家族及啟動(dòng)子克隆分析

張玉慧，王玉蘭，夏春蘭，聞志彬*

(1 中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所，荒漠與綠洲生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830011; 2 中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所標(biāo)本館，烏魯木齊 830011; 3 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

NADP-蘋(píng)果酸酶(NADP-ME)是C4植物的關(guān)鍵光合酶，參與生物體內(nèi)L-蘋(píng)果酸代謝。在Mg2+或Mn2+存在的情況下，催化蘋(píng)果酸發(fā)生氧化脫羧反應(yīng)生成丙酮酸、CO2和NADPH[1]。NADP-ME由一個(gè)小的基因家族編碼，一般包括3～5個(gè)基因[2-9]。大多數(shù)植物NADP-ME序列都比較保守，其氨基酸序列含有5個(gè)保守區(qū)域，即保守區(qū)域Ⅰ(VYTPTVGEACQK-YG)、Ⅱ(IQVIVVTDGERILGLGDLGCQGMGIPV-GKL)、Ⅲ(QFEDFANHNAF)、Ⅳ(FNDDIQGTASVVL)和Ⅴ(LFLGAGEAGTGIAEL)[10]。在植物中根據(jù)NADP-ME行使的功能不同，可將其分為光合型NADP-ME和非光合型NADP-ME。光合型NADP-ME定位在C4植物維管束鞘細(xì)胞的葉綠體和景天酸代謝(CAM)植物的細(xì)胞質(zhì)中，為光合反應(yīng)中CO2的固定提供CO2[10]；非光合型的NADP-ME位于C3、C4和CAM植物葉綠體或細(xì)胞質(zhì)中[1]，與植物的許多生理功能有著密切的關(guān)系，如防御應(yīng)答、脂肪酸生物合成以及pH調(diào)節(jié)等[11-14]。

NADP-ME家族在不同植物中的組織表達(dá)模式存在差異。擬南芥含有4個(gè)NADP-MEs，其中NADP-ME1(AT1)在根中表達(dá)量較高，NADP-ME2(AT2)和NADP-ME4(AT4)在根、莖、葉和花中都有表達(dá)，NADP-ME3(AT3)在花中表達(dá)量較高[2]。玉米包含5個(gè)NADP-MEs，其中Zmcyt3-NADP-ME、ZmC4-NADP-ME和ZmnonC4-NADP-ME在不同器官表達(dá)模式具有差異。Zmcyt3-NADP-ME主要在莖中表達(dá)，ZmC4-NADP-ME在葉鞘和葉片中表達(dá)量較高，ZmnonC4-NADP-ME在穗中表達(dá)量較高；Zmcyt1-NADP-ME和Zmcyt2-NADP-ME在葉、莖、根、葉鞘、未成熟和成熟的穗以及授粉14 d籽粒中都有表達(dá)[3]。小麥含有2個(gè)NADP-MEs(TaNADP-ME1和TaNADP-ME2)，它們?cè)诟?、莖和葉中均表達(dá)，且TaNADP-ME1在葉中表達(dá)量較高[4]。水稻包含4個(gè)NADP-MEs，其中OschlME、OscytME1和OscytME3在水稻根、葉和穗上都有表達(dá)，而OscytME2在根中表達(dá)量較高[8]。

不同植物NADP-ME家族成員在應(yīng)對(duì)非生物脅迫中存在差異。對(duì)谷子7個(gè)NADP-MEs進(jìn)行ABA、低溫和鹽脅迫后，SiNADP-ME1和SiNADP-ME6的相對(duì)表達(dá)量變化最大，SiNADP-ME1在上述脅迫下的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照的460.53、411.50和15.24倍；SiNADP-ME6的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照的211.13、15.21和643.99倍，而其他基因的表達(dá)量上調(diào)范圍均在對(duì)照的5倍以?xún)?nèi)[15]。對(duì)玉米5個(gè)NADP-MEs進(jìn)行ABA脅迫，發(fā)現(xiàn)ABA誘導(dǎo)Zmcyt3-NADP-ME表達(dá)，ABA處理下其在根中表達(dá)量約是對(duì)照的90倍，其他基因除Zmcyt3-NADP-ME下調(diào)表達(dá)外，上調(diào)表達(dá)均在對(duì)照的4倍以?xún)?nèi)[3]。

啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的重要元件，而轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)是基因表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)[16]。啟動(dòng)子中包含多種重要的順式作用元件，在轉(zhuǎn)錄水平上參與調(diào)控相應(yīng)基因表達(dá)以及提高植物的抗逆性。因此研究啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)于基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究具有重要意義[17-19]。目前有關(guān)NADP-ME啟動(dòng)子的研究較少，僅見(jiàn)在C3和C4植物，且研究集中在啟動(dòng)子克隆、元件預(yù)測(cè)分析及表達(dá)特性等方面[15, 20-24]。Walter等[20]分離得到編碼菜豆NADP-ME(PvME1)啟動(dòng)子區(qū)域ATG上游2 664 bp，并預(yù)測(cè)了該區(qū)域2個(gè)與紫外光和真菌響應(yīng)有關(guān)的順式作用元件。李秀峰[22]克隆得到了水稻胞質(zhì)型OscytME2的啟動(dòng)子1 652 bp，連接GUS載體轉(zhuǎn)化擬南芥后發(fā)現(xiàn)GUS基因在植物生長(zhǎng)不同時(shí)期表達(dá)部位不同，主要表達(dá)于主葉脈中。陳莉敏[23]克隆得到水稻OscytME3啟動(dòng)子1 777 bp，具有較低的活性，其表達(dá)可能受多種逆境環(huán)境因子誘導(dǎo)。趙晉鋒等[15]利用PlantCARE在線(xiàn)軟件對(duì)谷子7個(gè)NADP-ME(SiNADP-ME)成員啟動(dòng)子順式元件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SiNADP-ME成員啟動(dòng)子區(qū)域主要包括激素類(lèi)應(yīng)答元件、逆境應(yīng)答元件、光應(yīng)答元件以及其他類(lèi)生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)順式元件，其中細(xì)胞周期調(diào)控元件MSA-like只存在于SiNADP-ME1啟動(dòng)子中，晝夜節(jié)律元件circadian只存在于SiNADP-ME3啟動(dòng)子中，根特異性motif I只存在于SiNADP-ME6啟動(dòng)子中。

松葉豬毛菜(SalsolalaricifoliaTurcz. ex Litv.)隸屬于藜科豬毛菜族[25]，主要分布于蒙古、哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦和中國(guó)(新疆北部、內(nèi)蒙古、寧夏和甘肅)[26-27]。松葉豬毛菜是典型的C3-C4中間型植物[28-30]，具有區(qū)別于C3和C4植物的光合結(jié)構(gòu)和生理特征[31]。為了解中間型植物NADP-ME家族成員及其啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能，本研究以松葉豬毛菜為研究對(duì)象，在鑒定克隆獲得NADP-ME家族基因序列的基礎(chǔ)上，基于熒光定量PCR(RT-qPCR)分析非生物脅迫下該家族成員的表達(dá)特征，并克隆NADP-MEs的啟動(dòng)子序列，對(duì)其順式元件進(jìn)行生物信息學(xué)分析和預(yù)測(cè)。通過(guò)本研究初步認(rèn)識(shí)松葉豬毛菜NADP-ME家族成員及其啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能，為進(jìn)一步研究該中間型植物NADP-ME的功能和進(jìn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

松葉豬毛菜(SalsolalaricifoliaTurcz. ex Litv.)種子采自新疆博樂(lè)，取適量種子經(jīng)消毒后置于1/2MS固體培養(yǎng)基，在人工氣候箱中進(jìn)行萌發(fā)(萌發(fā)條件：白天25 ℃、14 h；夜晚18 ℃、10 h；光照強(qiáng)度2 200 Lx)，待萌發(fā)后轉(zhuǎn)移至霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)(培養(yǎng)條件白天25 ℃、14 h；夜晚18 ℃、10 h；光照強(qiáng)度6 000 Lx)。培養(yǎng)1周后，將光照強(qiáng)度升高至24 000 Lx，其他條件不變，取30 d苗齡的葉片保存在-80 ℃冰箱中以備后續(xù)提取DNA。

1.2 方 法

1.2.1 松葉豬毛菜基因組DNA的提取采用天根的植物基因組DNA提取試劑盒提取30 d松葉豬毛菜葉片的DNA，并利用1%的瓊脂糖凝膠電泳及核酸蛋白定量?jī)xNanodrop 2000檢測(cè)顯示DNA的濃度和質(zhì)量。

1.2.2 松葉豬毛菜NADP-ME基因家族的克隆根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)組測(cè)得的松葉豬毛菜根、莖和葉混合的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，收集注釋為NADP malic enzyme的所有unigene，共發(fā)現(xiàn)了6條unigene，其中2條為污染序列，將其剔除；2條unigene序列完全一致，實(shí)為一條轉(zhuǎn)錄本。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)確定3條序列，均包含完整的ORF。根據(jù)序列利用DNAMAN 7設(shè)計(jì)引物(表1)，并以松葉豬毛菜基因組為模板，克隆得到松葉豬毛菜NADP-ME基因家族成員序列。

1.2.3NADP-ME家族基因生物信息學(xué)分析在Tair數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arabidopsis.org)下載擬南芥NADP-ME基因家族AT1(AT2G19900.1)、AT2(AT5G11670.1)、AT3(AT5G25880.1)和AT4(AT1G79750.1)序列，并利用DNAMAN 7軟件對(duì)松葉豬毛菜和擬南芥NADP-ME基因家族進(jìn)行多重序列比對(duì)。

1.2.4 組織表達(dá)及脅迫表達(dá)分析松葉豬毛菜正常條件下培養(yǎng)30 d，一部分材料收集根、莖和葉用于基因表達(dá)組織部位分析；另一部分幼苗進(jìn)行ABA、NaCl、NAHCO3和PEG6000脅迫，將幼苗用不同濃度的ABA(0、50、100、150和200 mmol/L)、NaCl((0、50、100、150和200 mmol/L)、NaHCO3(0、15、30、45和60 mmol/L)和PEG6000(0%、10%、20%、30%、40%、50%和60%)進(jìn)行脅迫處理，4 h后收集葉和根部，將未處理樣品設(shè)為對(duì)照組；液氮速凍，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

提取松葉豬毛菜總RNA，根據(jù)已克隆的NADP-ME序列設(shè)計(jì)引物，反轉(zhuǎn)錄后利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)松葉豬毛菜3個(gè)NADP-MEs在植物組織中及在非生物脅迫下的表達(dá)特性進(jìn)行分析。根據(jù)Zhang等[32]研究，選擇β-actin作為組織表達(dá)特性及正常情況下的內(nèi)參，GAPDH和TUB分別作為ABA和NaHCO3脅迫下的內(nèi)參基因，EF1a作為NaCl和PEG6000脅迫下的內(nèi)參基因(表1)。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?94 ℃預(yù)變性5 min；34個(gè)循環(huán)，包括95 ℃變性30 s，58 ℃復(fù)性30 s， 72 ℃延伸20 s； 72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.5 松葉豬毛菜NADP-ME家族基因啟動(dòng)子克隆及生物信息學(xué)分析利用mhiTAIL-PCR[33]和Genome Walking Kit方法克隆松葉豬毛菜NADP-ME家族成員的啟動(dòng)子序列。根據(jù)已知編碼區(qū)序列，分別設(shè)計(jì)3條巢式PCR特異性引物(表2)，以松葉豬毛菜基因組DNA為模板進(jìn)行DNA步移。將獲得的特異性產(chǎn)物與pMD18-T連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌液PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子后送測(cè)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)上下游引物(表2)，并從基因組DNA中擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)到清晰條帶，將目標(biāo)片段切膠回收進(jìn)行TA克隆，測(cè)序獲得最終啟動(dòng)子序列。

表2 引物名稱(chēng)及序列

利用BDGP(https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)中Neural Network Promoter Prediction在線(xiàn)工具對(duì)SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用在線(xiàn)軟件PLACE(https://www. dna.affrc.go.jp/PLACE)和Plant Care(http:// bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html)對(duì)啟動(dòng)子序列上順式作用元件的種類(lèi)、數(shù)量和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析運(yùn)用Excel 2019分析處理數(shù)據(jù)，所有處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，2次技術(shù)重復(fù)。用2-ΔΔCt方法處理數(shù)據(jù)，利用GraphPad Prism 8作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 松葉豬毛菜NADP-ME家族基因的克隆

根據(jù)unigene基因序列設(shè)計(jì)引物，以松葉豬毛菜的cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR克隆，得到3個(gè)NADP-MEs的基因序列。利用DNAMAN 7軟件對(duì)松葉豬毛菜和擬南芥NADP-ME基因家族成員進(jìn)行多重序列比對(duì)，根據(jù)其與擬南芥NADP-ME序列的相似性高低，將這3個(gè)基因序列命名為SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4，它們CDS序列長(zhǎng)度分別為1 755、1 758和1 941 bp(圖1)。

2.2 NADP-ME家族基因生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 7軟件對(duì)松葉豬毛菜和擬南芥NADP-ME基因家族進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)松葉豬毛菜NADP-ME基因家族非常保守，都含有5個(gè)保守區(qū)域，除了在保守區(qū)Ⅰ-Ⅲ有個(gè)別堿基不同外，保守區(qū)Ⅳ-Ⅴ序列一致。

2.3 松葉豬毛菜NADP-ME家族成員的表達(dá)分析

2.3.1 組織表達(dá)特異性分析對(duì)松葉豬毛菜3個(gè)NADP-MEs在組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，將它們?cè)谇o中的表達(dá)量設(shè)為1.0。結(jié)果表明SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4在根、莖和葉中都有表達(dá)，其中SaNADP-ME2和SaNADP-ME4 表達(dá)量表現(xiàn)為葉>莖>根，而SaNADP-ME1表達(dá)量表現(xiàn)為根>莖>葉(圖3)。

2.3.2 非生物脅迫下NADP-ME家族成員松葉豬毛菜幼苗中的表達(dá)分析由于SaNADP-ME1主要在根中表達(dá)，SaNADP-ME2和SaNADP-ME4主要在葉中表達(dá)，因此對(duì)非生物脅迫下SaNADP-ME1在根中以及SaNADP-ME2和SaNADP-ME4在葉中的表達(dá)進(jìn)行深入研究。在ABA脅迫處理下，SaNADP-ME1在根中的表達(dá)量明顯下降，并在ABA質(zhì)量濃度為200 mmol/L時(shí)達(dá)到最低 (將對(duì)照組基因的表達(dá)量作為參照，設(shè)為1.00，下同)；SaNADP-ME2和SaNADP-ME4在葉中的表達(dá)量隨著ABA質(zhì)量濃度的增加而上升，且在ABA質(zhì)量濃度為200 mmol/L時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高(圖4，A和圖5，A)。在鹽脅迫下，SaNADP-ME1和SaNADP-ME2表達(dá)量變化均不明顯，SaNADP-ME4表達(dá)量隨著鹽質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢(shì)，在100 mmol/L處理下達(dá)到最高(圖4，A和圖5，B)。在NaHCO3脅迫下，隨著質(zhì)量濃度的增加，SaNADP-ME1呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，SaNADP-ME2和SaNADP-ME4表達(dá)量沒(méi)有明顯變化(圖4，B和圖5，C)。在PEG6000脅迫下，SaNADP-ME1在50%PEG600表達(dá)量明顯較低，SaNADP-ME2和SaNADP-ME4 在40%PEG6000時(shí)表達(dá)量最高，在其余體積濃度百分比表達(dá)量變化均不明顯(圖4，C和圖5，D)。結(jié)果表明，在ABA、NaCl、NAHCO3和PEG6000脅迫下松葉豬毛菜3個(gè)NADP-MEs均可被誘導(dǎo)表達(dá)，且SaNADP-ME2和SaNADP-ME4的表達(dá)模式相似。

2.4 松葉豬毛菜NADP-ME家族基因啟動(dòng)子的克隆

為了克隆SaNADP-ME1啟動(dòng)子區(qū)域，利用Genome Walking Kit進(jìn)行了3次DNA步移，獲得3段特異性產(chǎn)物，長(zhǎng)度分別為757、967和1 263 bp；利用mhiTAIL-PCR方法和Genome Walking Kit各進(jìn)行了1次DNA步移，共克隆得到SaNADP-ME2啟動(dòng)子的2段特異性產(chǎn)物，長(zhǎng)度分別為846 和589 bp；利用mhiTAIL-PCR和Genome Walking Kit方法克隆SaNADP-ME4啟動(dòng)子區(qū)域，共進(jìn)行2次DNA步移，獲得2段特異性產(chǎn)物，長(zhǎng)度分別為1 450和2 203 bp。利用DNAMAN軟件將多次步移獲得的啟動(dòng)子片段拼接成完整序列，根據(jù)序列兩端分別設(shè)計(jì)上下游引物(表3)，并從基因組DNA中擴(kuò)增。經(jīng)電泳檢測(cè)后測(cè)序，結(jié)果表明克隆得到SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4的啟動(dòng)子區(qū)域序列長(zhǎng)度分別為2 351、1 655和2 887 bp(圖6)。

2.5 NADP-ME基因家族啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析

利用BDGP對(duì)松葉豬毛菜NADP-ME基因家族啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果分析表明它們轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)大約位于150～250 bp之間。SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別位于翻譯起始位點(diǎn)(ATG)上游164 bp處(為堿基A)、162 bp處(為堿基C)和207 bp處(為堿基A)。

利用PLACE和Plant Care對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行順式作用元件分析(表3)，結(jié)果表明這3個(gè)NADP-MEs啟動(dòng)子區(qū)域都普遍存在組織和器官特異性表達(dá)元件、光響應(yīng)元件及激素響應(yīng)元件，其中與組織或器官特異性表達(dá)相關(guān)的元件有葉肉特異性元件CAC-TFTPPCA1和根特異性元件ROOTMOTIF-TAPOX1等；參與調(diào)控光合基因表達(dá)的順式作用元件有G-box、Box4、ACE、ATC-motif、GT1CONSENSUS和EBOXBNNAPA等，其中ATC-motif僅在SaNADP-ME1啟動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)，ACE和GT1-motif元件僅在SaNADP-ME4啟動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)；參與激素響應(yīng)的元件有水楊酸誘導(dǎo)元件、脫落酸誘導(dǎo)元件、生長(zhǎng)素誘導(dǎo)元件和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)元件等，其中生長(zhǎng)素誘導(dǎo)元件TGA-element僅在SaNADP-ME4中存在。此外，在3個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)域還發(fā)現(xiàn)干旱誘導(dǎo)相關(guān)元件和厭氧誘導(dǎo)元件等，其中參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS僅在SaNADP-ME4中存在。

表3 松葉豬毛菜NADP-ME家族基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析

3 討 論

NADP-蘋(píng)果酸酶(NADP-ME)是C4植物光合作用中的關(guān)鍵酶，在生物和非生物脅迫中發(fā)揮了重要的作用。本研究以C3-C4中間型植物松葉豬毛菜為研究材料，克隆得到其3個(gè)NADP-MEs(SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4)及啟動(dòng)子序列。NADP-ME家族在不同植物中組織表達(dá)模式存在差異，如小麥、水稻、玉米和擬南芥等[2-5]，本研究發(fā)現(xiàn)松葉豬毛菜這3個(gè)NADP-MEs組織表達(dá)模式也存在差異。雖然他們?cè)诟?、莖和葉都有表達(dá)，但SaNADP-ME2和SaNADP-ME4在葉中表達(dá)量最高，SaNADP-ME1在根中表達(dá)量最高。

Fu等[4]發(fā)現(xiàn)外源激素ABA可以調(diào)節(jié)小麥中TaNADP-ME1和TaNADP-ME2的表達(dá)。Liu等[34]發(fā)現(xiàn)在NaHCO3、NaCl和PEG6000的存在下，水稻幼苗葉和根中的NADP-ME活性增加50%以上。這些表明ABA、NaHCO3、NaCl和PEG6000均可以誘導(dǎo)NADP-ME的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)在4種非生物脅迫(ABA、NaCl、NaHCO3和PEG6000)下，松葉豬毛菜幼苗中這3個(gè)NADP-MEs均可被誘導(dǎo)表達(dá)，其中SaNADP-ME2和SaNADP-ME4在葉中響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)模式相似，對(duì)干旱響應(yīng)最為明顯，在干旱脅迫下最大表達(dá)量約為對(duì)照組的3倍，SaNADP-ME1在根中對(duì)ABA和NaHCO3的響應(yīng)更加明顯，在ABA脅迫和NaHCO3下最小表達(dá)量為對(duì)照組的0.5倍，推測(cè)松葉豬毛菜NADP-ME基因家族可能在響應(yīng)ABA、鹽脅迫、滲透壓和干旱脅迫中發(fā)揮了重要作用。

松葉豬毛菜NADP-ME家族基因啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，其啟動(dòng)子區(qū)域含有各種激素響應(yīng)元件、生物和非生物響應(yīng)元件，以及一些組織或器官特異性元件。與松葉豬毛菜其他2個(gè)NADP-MEs相比，SaNADP-ME4中還存在光反應(yīng)順式作用元件ACE、GT1-motif元件、生長(zhǎng)素誘導(dǎo)元件TGA-element以及參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS。qPCR結(jié)果表明在PEG6000脅迫下，SaNADP-ME4在葉中的表達(dá)量有明顯變化，干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS可能在SaNADP-ME4響應(yīng)干旱中發(fā)揮了重要作用。SaNADP-ME1在根中表達(dá)量最高，且ABA脅迫處理下，SaNADP-ME1在根中的表達(dá)量下降，并在ABA質(zhì)量濃度為200 mmol/L時(shí)達(dá)到最低。Arias等[35]推測(cè)AT1在ABA信號(hào)響應(yīng)中發(fā)揮著特殊的作用。通過(guò)生物信息學(xué)分析顯示SaNADP-ME1與AT1啟動(dòng)子都含有脫落酸誘導(dǎo)元件ABRE，該元件可能在SaNADP-ME1響應(yīng)ABA中發(fā)揮著重要作用。

本研究通過(guò)對(duì)松葉豬毛菜3種NADP-ME啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行生物信息學(xué)分析和預(yù)測(cè)，初步認(rèn)識(shí)NADP-ME啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能，為后續(xù)研究NADP-ME家族基因奠定了基礎(chǔ)，也為深入研究C4植物光合基因的功能和進(jìn)化提供了理論依據(jù)。