Toll 樣受體4信號(hào)通路在纖維化中的研究進(jìn)展

陳俊利 裴明 周豪坤 張皞昊 唐令

纖維化是疾病發(fā)展的最后階段,肌成纖維細(xì)胞在慢性炎癥作用下過度沉積細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，可引起組織瘢痕及硬化，導(dǎo)致組織器官實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少、纖維結(jié)締組織增生，最終可發(fā)展為器官衰竭甚至死亡[1,2]，而目前臨床上還沒有防治纖維化的特異性治療方法。纖維化發(fā)生機(jī)制涉及到包括炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡以及多種細(xì)胞因子作用等方面，其中炎性反應(yīng)對(duì)纖維化的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程有重要影響，持續(xù)存在的炎性反應(yīng)介導(dǎo)成纖維細(xì)胞激活、增殖、分化為肌成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)纖維化的病理發(fā)展[3]。Toll樣受體4(TLR4)作為膜識(shí)別受體，可識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)，與中間接頭蛋白結(jié)合，活化轉(zhuǎn)錄因子，參與組織急慢性炎性反應(yīng)，介導(dǎo)纖維化的發(fā)生發(fā)展[4]。本文描述TLR4的結(jié)構(gòu)及與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相互作用，探討TLR4在纖維化疾病中的作用，闡明以TLR4信號(hào)通路為治療靶點(diǎn)的相關(guān)應(yīng)用研究，總結(jié)如下。

1 TLR4信號(hào)通路概述

1.1 TLR4的結(jié)構(gòu) TLRs家族有11個(gè)成員，其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6 和TLR11在細(xì)胞表面表達(dá)，主要識(shí)別微生物膜成分；TLR3、TLR7、TLR8和TLR9 表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)囊泡，主要識(shí)別微生物的核酸[5]。其中TLR4是最早被人類發(fā)現(xiàn)的TLRs相關(guān)蛋白，TLR4通過識(shí)別真菌和病毒的細(xì)胞壁成分，而發(fā)揮模式識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)的作用[6]。TLR4屬于一種跨膜受體蛋白，其結(jié)構(gòu)主要有富含亮氨酸重復(fù)序列的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分。胞外區(qū)通過特異識(shí)別PAMPs和DAMPs來建立免疫反應(yīng)；胞內(nèi)區(qū)含Toll/白細(xì)胞介素1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域，TIR結(jié)構(gòu)域是TLR4信號(hào)通路的關(guān)鍵區(qū)域，可激活下游適配器蛋白；跨膜區(qū)則富含半胱氨酸[7]。

1.2 TLR4信號(hào)通路的激活 TLR4信號(hào)通路的激活包括兩條途徑，(1)髓樣分化因子88(MyD88)依賴信號(hào)途徑，此為TLR4信號(hào)傳導(dǎo)的經(jīng)典途徑，可通過介導(dǎo)核因子κB(NF-κB)而誘導(dǎo)炎性因子的釋放[6]；(2)MyD88非依賴信號(hào)途徑。見圖1。

圖1 TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

MyD88依賴信號(hào)通路是通過TLR4受體與與相應(yīng)的配體相結(jié)合，TLR4的經(jīng)典配體是脂多糖(LPS)，將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)部[8]；細(xì)胞漿TIR結(jié)構(gòu)域與TIR結(jié)構(gòu)域包含的接頭蛋白MyD88發(fā)生相互作用，使MyD88與IL-1受體相關(guān)激酶4(IRAK-4)作用，使IL-1受體相關(guān)激酶1(IRAK-1)磷酸化，接著活化腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)，然后刺激TGF-β活化激酶1(TAK-1)，從而激活I(lǐng)κB激酶(IKK)，導(dǎo)致絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB的啟動(dòng)，進(jìn)而活化轉(zhuǎn)錄因子，通過核內(nèi)啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)各種炎性細(xì)胞因子表達(dá)激活。MyD88非依賴通路主要通過激活TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)分子3(TRAF3)，導(dǎo)致IKKε/TBK1的募集，經(jīng)過干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF-3)的磷酸化及激活NF-κB的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，從而促進(jìn)各種炎性反應(yīng)的發(fā)生[9-11]。

2 TLR4信號(hào)通路與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相互作用

2.1 PI3K/Akt信號(hào)通路 PI3K/Akt信號(hào)通路失調(diào)在臨床可見于多種疾病，包括癌癥、糖尿病、心血管疾病和纖維化疾病等，研究結(jié)果顯示，該信號(hào)通路在調(diào)控各種不同細(xì)胞功能(包括代謝、生長、增殖、存活、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)合成)方面發(fā)揮重要作用，是人類疾病治療的重要靶標(biāo)[12]。Zhang等[13]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能顯著降低肝星狀細(xì)胞TLR4和MyD88蛋白的表達(dá)及PI3K和Akt的表達(dá)，顯著抑制LPS誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞中NF-κB的轉(zhuǎn)運(yùn)，認(rèn)為藥物機(jī)制是通過阻斷NF-κB激活和PI3K/Akt磷酸化來抑制肝星狀細(xì)胞活化，從而阻斷肝纖維化。Wang等[14]通過建立體內(nèi)小鼠單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型，體外用TGF-β1和LPS刺激人腎近端小管上皮細(xì)胞(HK-2)，形成上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和炎性反應(yīng)，觀察姜黃素對(duì)腎間質(zhì)纖維化(RIF)的作用機(jī)制，得出結(jié)論姜黃素通過抑制TLR4/NF-κB和PI3K/AKT通路抑制了EMT和炎性反應(yīng)，對(duì)RIF的治療具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

2.2 TGF-β1/Smad信號(hào)通路 TGF-β家族由一類結(jié)構(gòu)、功能相關(guān)的多肽生長因子亞家族組成，廣泛存在于從果蠅到人多種生物的各種組織中，影響細(xì)胞的增殖、分化，在胚胎發(fā)育、胞外基質(zhì)形成、骨的形成和重建等方面起著重要作用。Lin等[15]通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯(Andro)治療不僅能降低小鼠促纖維化和促炎因子的表達(dá)，還能阻斷TGF-β1/Smad2和TLR4/NF-κB p50信號(hào)通路，表明Andro可預(yù)防肝臟炎癥和纖維化，與抑制TGF-β1/Smad2和TLR4/NF-κB p50通路的表達(dá)有關(guān)。Cáceres等[16]研究發(fā)現(xiàn)重組人松弛素-2(serelaxin)通過靶向TLR-4和NLRP3炎癥小體抑制心肌成纖維細(xì)胞TGF-β1/IL-1β軸，發(fā)揮著抗纖維化作用。

2.3 MAPK信號(hào)通路 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一組進(jìn)化保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，可被細(xì)胞外的信號(hào)激活，并介導(dǎo)信號(hào)從細(xì)胞膜向細(xì)胞核傳導(dǎo)，在許多細(xì)胞活動(dòng)中起重要作用，如生長增殖、細(xì)胞分化或細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。MAPK信號(hào)通路通過細(xì)胞機(jī)制調(diào)控人體多種生理活動(dòng)，如炎癥、凋亡、腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等[17]。Li等[18]通過體內(nèi)和體外模型探討了紅景天(Sal)對(duì)RIF的機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)，Sal改善了小鼠腎功能，減輕ECM成分的沉積，降低小鼠腎臟和HK-2細(xì)胞中EMT標(biāo)記物的蛋白水平，顯著降低炎性細(xì)胞因子的釋放，并抑制TLR4/NF-κB和MAPK信號(hào)通路。Kang等[10]評(píng)估了小鼠飲食誘導(dǎo)肥胖(DIO)模型中與慢性間歇性缺氧(CIH)相關(guān)的肝臟炎癥的機(jī)制，檢測血清和肝臟中相關(guān)炎癥和氧化應(yīng)激標(biāo)志物，得出結(jié)論，CIH在DIO小鼠中通過TLR4/MyD88/MAPK/NF-kB信號(hào)通路導(dǎo)致了肝纖維化。

3 TLR4在纖維化疾病中的應(yīng)用研究

3.1 TLR4與腎纖維化 腎纖維化是慢性腎臟病進(jìn)展至終末期腎病重要的病理改變，是腎臟功能不斷損傷的結(jié)果[19]。腎纖維化以ECM的異常沉積為特征，主要表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤和炎性介質(zhì)的釋放、成纖維細(xì)胞的活化和增殖，持續(xù)存在的炎性反應(yīng)介導(dǎo)了腎纖維化的發(fā)生發(fā)展[20,21]。TLR4及其信號(hào)通路在腎臟受損時(shí)被激活，引起炎性因子、趨化因子的分泌、巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及氧化應(yīng)激，致使ECM分泌增加。TLR4及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腎臟炎癥應(yīng)答及促進(jìn)腎纖維化中發(fā)揮重大作用[7]。

有數(shù)據(jù)表明，TLR4在慢性間歇性低氧誘導(dǎo)的腎損傷、炎癥和纖維化中發(fā)揮了重要作用[22]。周細(xì)胞中MyD88及其下游效應(yīng)因子IRAK-4的信號(hào)是腎臟炎癥和纖維化形成的重要驅(qū)動(dòng)因素[23]。而阻斷MyD88依賴通路可能是抑制纖維形成和促進(jìn)再生的潛在治療方法[24]。研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可通過下調(diào)TLR4/MyD88依賴信號(hào)通路，減少下游炎性因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的釋放，來改善小鼠缺血再灌注或單側(cè)輸尿管梗阻所致的腎纖維化[25,26]。Liu等[27]發(fā)現(xiàn)尿酸通過激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變，靶向干預(yù)TLR4/NF-κB信號(hào)通路可有效抑制尿酸介導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化。

3.2 TLR4與肝纖維化 肝纖維化是肝臟結(jié)締組織異常增生的病理生理過程，若機(jī)體持續(xù)出現(xiàn)肝損傷，肝纖維化可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化甚至肝癌[28,29]。肝星狀細(xì)胞(HSC)是引起肝纖維化瘢痕組織的主要細(xì)胞，HSC活化后轉(zhuǎn)為肌成纖維細(xì)胞，釋放大量ECM[30,31]。HSC作為肝纖維化發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此，對(duì)HSC的干預(yù)成為治療肝纖維化的重要措施。肝纖維化與炎性反應(yīng)之間關(guān)系緊密[32]。TLR4作為炎性反應(yīng)觸發(fā)器，對(duì)HSC的激活發(fā)揮重要作用，是各種損傷因素所致肝纖維化的主要調(diào)節(jié)子[33]。

有研究表明，慢性間歇性缺氧通過TLR4/MyD88/MAPK/NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)了肥胖小鼠肝纖維化[10]。Lai等[8]研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可抑制大鼠LPS/TLR4/NF-κB信號(hào)途徑，下調(diào)α-SMA和TGF-β1的蛋白水平，減輕炎癥誘導(dǎo)的肝纖維化。王海蘭等[34]發(fā)現(xiàn)川芎含藥血清可抑制LPS誘導(dǎo)的HSC中TLR4及MyD88的表達(dá)而發(fā)揮其抗纖維化的作用。Hu等[35]發(fā)現(xiàn)連翹脂素可通過TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，抑制LX2細(xì)胞活化和肝纖維化細(xì)胞因子的表達(dá)。

3.3 TLR4與肺纖維化 肺纖維化是正常肺泡組織持續(xù)性被損傷，成纖維細(xì)胞增殖、ECM過度積聚引起肺組織結(jié)構(gòu)不可逆性破壞而形成瘢痕[36]。肺纖維化是一種漸進(jìn)性、不可逆性的間質(zhì)性肺疾病，是機(jī)體對(duì)肺臟損傷的過度修復(fù)，在疾病終末期可導(dǎo)致呼吸衰竭[37]。其中，肺纖維化的重要病理基礎(chǔ)是持續(xù)的損傷介導(dǎo)了炎性反應(yīng)的產(chǎn)生。TLR4與相關(guān)配體結(jié)合，參與了細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)自噬和調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)等，進(jìn)而調(diào)控肺纖維化的發(fā)生發(fā)展[9]。

TLR4參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展及調(diào)控大鼠肺成纖維細(xì)胞的炎性反應(yīng)[38]。Jia等[39]發(fā)現(xiàn)芒果苷通過抑制TLR4的激活，阻斷p65和Smad2/3的磷酸化同時(shí)降低MMP-9的表達(dá)，明顯抑制了炎性細(xì)胞因子的分泌和EMT形成過程，從而減弱博來霉素(BLM)誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。Tao等[40]研究表明羅漢果苷IIE通過調(diào)節(jié)TLR4/MyD88-MAPK信號(hào)通路，以抑制肺部炎癥和ECM沉積，從而顯著抑制肺纖維化。Li等[41]研究發(fā)現(xiàn)人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞可以減少羥脯氨酸(HYP)沉積量、MyD88和TGF-β信號(hào)的激活以及促纖維化細(xì)胞因子的產(chǎn)生，可顯著減輕BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。

3.4 TLR4與心肌纖維化 心肌纖維化指心臟成纖維細(xì)胞增殖，ECM過度沉積伴膠原蛋白比例失調(diào)及排列紊亂，影響心肌彈性及心輸出量，引起供血障礙而導(dǎo)致心功能不全的病理改變[42]。心肌纖維化是誘發(fā)或加重多種心血管疾病的重要病因，也是心血管疾病發(fā)展至終末期的病理表現(xiàn)，可引起心舒縮功能障礙，導(dǎo)致心律失常、心力衰竭，甚至心源性猝死等[43,44]。心肌纖維化的參與因素主要有腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、氧化應(yīng)激與炎性反應(yīng)、多種生物活性因子等，其中，炎性反應(yīng)在心肌纖維化中發(fā)揮了重要作用[43]。TLR4是介導(dǎo)心肌炎癥的重要信號(hào)分子，其活化后可通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起一系列因子表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展[45]。

萬琦等[46]研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-125b可通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)途徑減少炎性因子的分泌，從而抑制心臟成纖維細(xì)胞的增殖，減緩心肌纖維化、心肌重構(gòu)及心力衰竭的進(jìn)程。Ma等[47,48]研究提示異甘草酸鎂及藏紅花素通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路對(duì)異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)的心肌纖維化有保護(hù)作用。趙浩茜等[49]研究結(jié)果提示有氧運(yùn)動(dòng)通過抑制高血壓大鼠心肌中的HMGB1/TLR4信號(hào)通路，從而抑制心肌中炎性因子IL-6、TNF-α的激活，以改善心肌纖維化重構(gòu)。石亞男等[45]研究表明羅漢果苷ⅢE通過調(diào)控TLR4信號(hào)通路，抑制了炎性介質(zhì)及促纖維化因子的激活，從而阻抑心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。

3.5 TLR4與腹膜纖維化 腹膜纖維化是長期腹膜透析(PD)使腹膜形態(tài)及功能的改變，引起腹膜超濾及轉(zhuǎn)運(yùn)功能衰竭，PD患者被迫結(jié)束透析治療[50]。腹膜纖維化的基本特征是ECM的過度積累、腹膜間皮細(xì)胞凋亡及新生血管生成等[51]。尿毒癥、生物不相容的腹膜透析液[高糖、低pH值、葡萄糖降解產(chǎn)物(GDP)和晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)]及腹膜炎是引起腹膜纖維化的重要因素。而腹膜炎癥是腹膜纖維化發(fā)展過程中的關(guān)鍵事件[52]。調(diào)控TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可抑制促炎細(xì)胞因子和纖維化介質(zhì)的釋放，在腹膜炎癥中起重要作用[53]。

TLR4是腹膜透析相關(guān)性纖維化的潛在治療靶點(diǎn)[54]。Choi等[53]研究發(fā)現(xiàn)抑制TLR4可降低高糖誘導(dǎo)的MyD88、NF-κB p65、TGF-β等蛋白的表達(dá)，得出結(jié)論，高糖誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞炎癥和纖維化標(biāo)志物的部分途徑是通過TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路，證明了TLR4可能是改善腹膜透析后腹膜炎癥和纖維化的治療靶點(diǎn)。Shao等[55]探討了薯蕷皂苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的腹膜纖維化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷抑制了EMT形態(tài)學(xué)改變，降低了纖維化標(biāo)志物和炎性因子的表達(dá)，通過降低TLR4、MyD88、NF-κB的表達(dá)，從而抑制EMT和纖維化。

4 以TLR4信號(hào)通路為治療靶點(diǎn)的研究

4.1 TLR4抑制劑 TAK242是TLR4信號(hào)的小分子抑制劑，TAK242在TLR4的胞內(nèi)區(qū)域與Cys747結(jié)合，并破壞TLR4與適配器分子的相互作用，從而達(dá)到選擇性地抑制TLR4信號(hào)的目的。Bhattacharyya等[56]檢測了TAK242在臨床前纖維化模型和系統(tǒng)性硬化癥(SSc)成纖維細(xì)胞中的作用，發(fā)現(xiàn)經(jīng)由TAK242治療，可減輕患者博萊霉素誘導(dǎo)的皮膚病變和體內(nèi)肺纖維化的程度，并可降低幾種促纖維化介質(zhì)的表達(dá)。此外，還發(fā)現(xiàn)TAK242改善了TSK/+小鼠的腹膜纖維化和降低腹膜厚度，阻斷了膠原合成和肌成纖維細(xì)胞分化。研究確定了TAK242在器官纖維化的臨床前模型中是一種抗纖維化藥物，是一種治療SSc和其他纖維化疾病的新策略。

4.2 MyD88抑制劑 筆者發(fā)現(xiàn)目前MyD88抑制劑相關(guān)研究較少。Liu等[57]通過合成一種靶向MyD88的新型抑制劑(TJ-M2010-2)，該抑制劑可以結(jié)合MyD88的TIR域并干擾MyD88的二聚反應(yīng)，文中探討了TJ-M2010-2在缺血再灌注損傷(IRI)誘導(dǎo)的RIF中的作用機(jī)制，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TJ-M2010-2可阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的EMT，明顯抑制TRAF6、p65和Snail的表達(dá)，上調(diào)IκBα的表達(dá)，表明MyD88抑制劑可能是一種改善RIF潛在的治療藥物。

4.3 抗人TLR4單克隆抗體 單克隆抗體是由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的抗體，具有靶向性強(qiáng)，毒副作用低、特異性高等特點(diǎn)。近年來，治療性單克隆抗體在抗腫瘤、阻斷信號(hào)傳導(dǎo)、靶向治療等領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用，是藥物治療新的發(fā)展方向。Cai等[58]通過研究發(fā)現(xiàn)人源化抗TLR4單克隆抗體在mRNA和蛋白水平上阻斷了炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，F(xiàn)ab片段顯著抑制NF-κB信號(hào)通路，從而導(dǎo)致p38、ERK1/2、JNK1/2的抑制。研究結(jié)果表明，抗人TLR4單克隆抗體可以通過阻斷小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中TLR4信號(hào)通路，有效地保護(hù)小鼠免受LPS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。

綜上所述，在多種器官及組織纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與纖維化疾病有著密切聯(lián)系。通過干預(yù)TLR4信號(hào)通路，可以抑制炎性細(xì)胞因子和促纖維化因子的分泌，進(jìn)而抑制纖維化病變。但由于TLR4的相關(guān)信號(hào)通路比較多，對(duì)纖維化的具體影響機(jī)制比較復(fù)雜，仍然需要對(duì)其進(jìn)行深入探尋。隨著今后相關(guān)研究的不斷增加，相信TLR4相關(guān)信號(hào)通路在纖維化疾病中的作用機(jī)制將會(huì)更加的明確，對(duì)TLR4信號(hào)通路表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，以期為臨床防治纖維化提供新的思路。