循環(huán)外泌體miR-17-5p和miR-21-5p檢測在NSCLC早期診斷及進展評估中的價值

張嘉文 申婷 李海鵬 田秀明 許順江 劉欣燕

肺癌是一種惡性腫瘤，其原發(fā)病灶處于支氣管黏膜或腺體，嚴重威脅人類的健康，是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。肺癌患者中約85%左右為非小細胞肺癌(non-small cell cancer，NSCLC)[2]。NSCLC患者沒有明顯的早期癥狀，往往發(fā)現時已到晚期，5年生存率只有5%左右[3]。即使在放化療技術和自身免疫治療技術普遍應用的情況下，患者5年內的生存率仍不超過15%[4]。預防和治療肺癌的最好策略是早期診斷，因此尋找特異性高、侵入性小的腫瘤標志物為當務之急。外泌體miRNA作為癌癥早期診斷的有效生物標志物日益受到關注。外泌體miR-17-5p和miR-21-5p的水平與卵巢癌的病理過程相關[5]。然而，檢測外泌體miR-17-5p和miR-21-5p在NSCLC患者循環(huán)血中的水平及其診斷價值筆者尚未見報道。本研究通過檢測miR-17-5p和miR-21-5p在NSCLC及良性肺結節(jié)患者血漿外泌體中的表達水平，進一步分析外泌體miRNA水平與NSCLC進展的關系，為尋找NSCLC的早期診斷的生物標志物提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020年6月至2021年5月在河北省胸科醫(yī)院就診的經支氣管鏡、肺穿刺活檢或手術后病理確診的NSCLC患者20例，均為初次診斷，未接受過放化療及任何免疫治療，經CT、超聲等輔助檢查手段排除合并其他部位的惡性疾病。同期收集來醫(yī)院經抗感染治療或觀察2個月后胸部CT顯示明顯吸收的良性肺結節(jié)患者20例為對照組，患者入組前排除高血壓、糖尿病、冠心病和慢性阻塞性肺疾病等全身慢性疾病，且未發(fā)現其他部位的惡性病變。

1.2 主要儀器與試劑 (1)儀器：德國 Roche公司的實時熒光定量PCR儀、德國eppendorf公司高速(冷凍)離心機、美國Bio-Rad公司逆轉錄儀、美國Nanodrop公司紫外分光光度計等。(2)試劑：德國 Qiagen公司外泌體提取試劑盒、北京索萊寶公司彩虹180廣譜蛋白Marker和BCA蛋白測定試劑盒、美國GeneCopoeia公司的RT-qPCR試劑和內參及目的分子引物等。

1.3 實驗方法

1.3.1 血液標本采集：早晨采集患者靜脈血5 ml，置于EDTA抗凝管中，4℃靜置過夜。4℃條件下4 000 r/min離心8 min，用移液器收集淡黃色上清置于無RNA酶的離心管中，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 血漿外泌體提取和鑒定：利用德國Qiagen公司的外泌體提取試劑盒提取患者血漿外泌體。提取好的外泌體樣品置于-80℃冰箱保存。外泌體鑒定采用醋酸雙氧鈾溶液染色，透射電鏡下鑒定外泌體的形態(tài)和結構。采用納米顆粒跟蹤分析技術(nanosight tracking analysis,NTA)測定外泌體粒徑的大小。采用Western blot技術，根據蛋白Marker顯示的分子量來鑒定外泌體表面的標志蛋白—CD63和TSG101，使用的一抗為CD63(1∶1 000，ab134045；Abcam)和TSG101(1∶1 000，ab125011；Abcam)，二抗為羊抗兔二抗(1∶2 000；Abbkine)。

1.3.3 外泌體總RNA的提取及濃度測定：使用exoRNeasy Midi Kit試劑盒提取外泌體總RNA，根據紫外可見光光度計上檢測到的RNA OD260/OD280值評估所提取的外泌體中總RNA的濃度。

1.3.4 RT-qPCR檢測：采用All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit 2.0進行RNA逆轉錄，體系為20 μl。反應體系：血漿外泌體總RNA 10 μl，2.5 U/μl Poly A Polymerase 1 μl，Sure Script RTase Mix 1 μl，5xPAP和RT Buffer 4 μl，最后加雙蒸餾H2O至終體積20 μl。逆轉錄反應程序：首先37℃孵育60 min，接著85℃孵育5 min(終止逆轉錄反應)。逆轉錄后cDNA置于-20℃冰箱內存放直至使用。使用All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit 2.0對合成的cDNA進行擴增，反應體系為10 μl，反應試劑：2×All-in-One TMqPCR Mix 5 μl，Universal Adaptor PCR Primer 0.8 μl，ROX Reference Dye 0.1 μl，無RNA酶水1.3 μl，All-in-OneTM miRNA qPCR Primer 0.8 μl，First-strand cDNA 2 μl。PCR反應程序：首先95℃預變性10 min，然后95℃再變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，采集熒光信號，進行40個循環(huán)。PCR反應體系采用miR-U6作為內參，目的分子hsa-miR-17-5p引物序列5’-CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3’；hsa-miR-21-5p引物序列為5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’。上述樣本均重復3次檢測，應用2-△△Ct計算miR-17-5p和miR-21-5p的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，由于樣本例數較小使用S-W檢驗，得出所有數據為非正態(tài)分布，表達水平以中位數(四分位數)表示，2組間比較采用Mann-Whitey U檢驗，利用ROC及AUC算出各miRNA的診斷效能，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料情況 NSCLC患者20例，其中男10例，女10例；肺鱗狀細胞癌7例，肺腺癌13例；Ⅰ～Ⅱ期NSCLC 7例，Ⅲ～Ⅳ期NSCLC 13例。同期收集良性肺結節(jié)患者20例，其中男12例，女8例。

2.2 血漿外泌體鑒定 血漿外泌體用醋酸雙氧鈾水溶液染色后置于電鏡下，可觀察到視野內一圓形具有脂質雙層膜結構的囊狀顆粒，直徑大小約為130 nm。應用NTA技術檢測外泌體粒徑及顆粒濃度，顆粒直徑呈單峰正態(tài)分布曲線，峰值約為118.3 nm處，顆粒主要分布于30～150 nm，樣品中顆粒分散均一。Western blot實驗檢測外泌體表面標志蛋白CD63和TSG101均陽性。見圖1。

圖1 血漿外泌體鑒定；A 透射電鏡下觀察到的外泌體形態(tài)，白色箭頭所指為外泌體；B NTA檢測所獲取的粒子分布；C Western blot檢測外泌體標志蛋白CD63和TSG101陽性

2.3 2組血漿外泌體miR-17-5p和miR-21-5p水平比較 NSCLC組miR-17-5p(中位數為18.05，四分位數間距1.72～42.61)和miR-21-5p(中位數為9.61，四分位數間距2.05～26.09)的相對表達量均高于對照組miR-17-5p(中位數為1.50，四分位數間距0.34～4.99)和miR-21-5p(中位數為0.78，四分位數間距0.39～2.80)的相對表達量，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1，圖2。

圖2 miR-17-5p和miR-21-5p在NSCLC組和對照組血漿外泌體中的相對表達量

表1 2組血漿外泌體miR-17-5p和miR-21-5p表達水平比較 n=20

2.4 NSCLC患者血漿外泌體miR-17-5p和miR-21-5p表達量與臨床病理特征的相關性 NSCLC組患者血漿外泌體兩種miRNA的表達趨勢隨著腫瘤局部浸潤程度的深淺(P<0.001)、區(qū)域淋巴結轉移的多少(P=0.005)以及TNM分期的進展(P=0.009)逐步上調，提示兩種miRNA的相對表達量與腫瘤局部浸潤程度、區(qū)域淋巴結轉移及TNM分期存在相關性(P<0.05)，而與患者年齡、性別、是否吸煙、組織類型等其他危險因素均無相關性(P>0.05)。見表2。

表2 NSCLC患者血漿外泌體miR-17-5p、miR-21-5p表達量與各臨床病理特征之間的關系

2.5 血漿外泌體miR-17-5p和miR-21-5p的診斷效能評估 采用ROC曲線進行分析，miR-17-5p的cut off值為2.110，曲線下面積AUC為0.813(95%CI：0.6791～0.9456)，靈敏度為70%，特異度為85%；miR-21-5p的cut off值為0.6691，曲線下面積AUC為0.875(95% CI：0.7701～0.9799)，靈敏度為90%，特異度為70%；將miR-17-5p與miR-21-5p二者聯(lián)合，cutoff值為5.155，所得的曲線下面積AUC為0.925(95%CI：0.8427～1.0000)，靈敏度為85%，特異度為90%。見圖3。

圖3 血漿外泌體miR-17-5p和miR-21-5p單項及聯(lián)合檢測非小細胞肺癌的ROC曲線分析

3 討論

外泌體是直徑30～150 nm的脂質雙分子囊泡，通過胞吐過程被各種細胞釋放到細胞外空間，故在血液、尿液、唾液、乳汁等大多數體液中都存在外泌體[6]。外泌體攜帶蛋白質、脂質、mRNA、miRNAs和來自細胞內部的長鏈非編碼RNA(lncRNA)，其特有的脂質雙分子膜可以保護這些物質免受降解[7]，直接反映親代細胞的表型狀態(tài)。外泌體miRNA可以介導細胞信息交流、信號轉導等過程[8]，這種特殊的能力使得外泌體在人體生理過程及包括各類癌癥在內的多種病理過程中起到調節(jié)作用[9]。miRNA是內源性小分子(19～25 nt)非編碼 RNA，其以序列特異性調節(jié)人類基因80%的表達，如細胞發(fā)育、增殖、分化、信號轉導、細胞周期、細胞凋亡等[10]，研究證實外泌體miRNA在惡性腫瘤的發(fā)病和侵襲轉移中發(fā)揮關鍵的調節(jié)作用[11]。外泌體miRNA在腫瘤疾病診斷中具有兩大優(yōu)勢：(1)高度穩(wěn)定性；(2)準確反映細胞的生理狀態(tài)和微環(huán)境[12]。本研究主要通過RT-qPCR法檢測血漿外泌體中miR-17-5p和miR-21-5p的水平，評估m(xù)iR-17-5p和miR-21-5p在NSCLC診斷中的價值。

miR-17-5p是miR-17-92家族成員，在多種類型的惡性腫瘤中異常表達[13]，miR-17-5p的過表達與肝癌轉移有關[14]。有研究表明miR-21在乳腺癌、前列腺癌及結直腸癌等多種實體腫瘤中的表達水平升高[15]。特別是miR-21-5p在乳腺癌組織中表達水平明顯升高[9]，另外來自骨髓間充質干細胞的外泌體miR-21-5p通過靶向PIK3R1促進骨肉瘤細胞增殖和侵襲[16]。隨著國內外學者對外泌體研究的不斷深入，外泌體miRNA日益成為研究的焦點。

本研究結果提示NSCLC組中兩種miRNA的表達趨勢與結節(jié)組相比顯著上調。采用ROC曲線評估m(xù)iR-17-5p和miR-21-5p對于NSCLC的診斷效能，得出的AUC分別為0.813和0.875，兩種miRNA聯(lián)合檢測的AUC值為0.925，提示其診斷效能高于單獨檢測一種miRNA診斷的價值。此外，NSCLC組中miR-17-5p和miR-21-5p的表達水平與患者的性別、年齡、吸煙與否無關，但與腫瘤TNM分期、局部浸潤程度及區(qū)域淋巴結轉移存在相關性，提示miR-17-5p和miR-21-5p參與了NSCLC侵襲和轉移的進展過程。同時提示miR-17-5p和miR-21-5p可作為潛在的生物標志物在NSCLC的早期診斷中具有重要意義。

綜上所述，基于血漿外泌體的相對穩(wěn)定性，其內容物受到外泌體雙層脂質膜結構的保護，檢測外泌體miR-17-5p和miR-21-5p作為NSCLC早期診斷的潛在標志物具有一定的臨床應用價值。