微小RNA-145表達(dá)對(duì)胃癌不同分子分型患者的新輔助化療效果評(píng)價(jià)及臨床意義

趙雪峰 譚明 趙一杰 檀碧波

胃癌早期無癥狀或僅有輕微非特異性癥狀，因而很難早期發(fā)現(xiàn)，臨床大多數(shù)胃癌患者與就診時(shí)已處于進(jìn)展期[1,2]。對(duì)進(jìn)展期胃癌的治療措施是以手術(shù)為主的綜合治療，但相當(dāng)一部分患者由于腫瘤分期較晚，直接手術(shù)難以切除腫瘤或不能達(dá)到根治水平。為提高這些患者的腫瘤手術(shù)切除率并改善預(yù)后，近年來新輔助化療在進(jìn)展期胃癌治療中已得到較為廣泛的應(yīng)用。通過新輔助化療，患者腫瘤切除率明顯升高，近期預(yù)后也有所改善[3,4]。通過標(biāo)志物檢測(cè)能對(duì)新輔助化療的效果及不良反應(yīng)進(jìn)行預(yù)測(cè)則可能改善進(jìn)展期胃癌的綜合治療效果，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。傳統(tǒng)的胃癌病理分型在預(yù)測(cè)治療效果、評(píng)價(jià)病情及預(yù)后方面存在明顯不足，因此，近年來出現(xiàn)了多種新的分子分型，其中ACRG分子分型在預(yù)測(cè)藥物治療效果方面有較好的價(jià)值[5]。ACRG分子分型中微衛(wèi)星穩(wěn)定性(MSS)/上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)亞型患者具有發(fā)病年齡較早、分化程度較差、放化療效果不佳的特點(diǎn)[6]。MSS/EMT亞型檢測(cè)在臨床工作中可以通過檢測(cè)CDH1基因編碼的蛋白質(zhì)E-鈣粘蛋白(E-cadherin)代表[6]。微小RNA(microRNA)是一類長(zhǎng)度為20 nt的非編碼單鏈RNA，對(duì)靶基因有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能[7-9]。研究顯示，microRNA在多種惡性腫瘤中存在過表達(dá)或者表達(dá)降低的現(xiàn)象，其主要通過調(diào)控靶基因的mRNA表達(dá)而參與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移[10,11]。miR-145作為一種具有抑癌基因功能的microRNA，在胃癌患者的組織中存在表達(dá)降低的現(xiàn)象，能夠參與胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等過程[10,11]。但檢測(cè)miR-145表達(dá)能否預(yù)測(cè)胃癌新輔助化療的效果目前還沒有定論。還有研究發(fā)現(xiàn)miR-145 對(duì)E-cadherin有調(diào)節(jié)作用[12]。本研究以接受新輔助化療(SOX方案)的胃癌患者為研究對(duì)象，于新輔助化療前檢測(cè)胃癌及癌旁組織中miR-145及E-cadherin的表達(dá)水平，分析其與胃癌新輔助化療效果的關(guān)系，對(duì)其檢測(cè)價(jià)值進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2019年1月至2020年10月于我院住院治療并接受新輔助化療的進(jìn)展期胃癌患者80例為研究組，其中男65例，女15例；年齡32～63歲，平均年齡(57.92±7.11)歲。所有入組者由患者本人簽署知情同意文件，研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均有胃鏡活檢病理證實(shí)為胃腺癌，按第8版 AJCC/UICC胃癌分期系統(tǒng)進(jìn)行影像學(xué)分期，患者臨床分期為ⅡB～Ⅲ期；②患者于就診前未接受過其他針對(duì)胃癌的治療，腫瘤均有潛在切除可能；③患者及家屬同意接受新輔助化療。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①診斷為復(fù)發(fā)或存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者；②既往患有其他惡性腫瘤或現(xiàn)合并其他惡性腫瘤者；③患者有嚴(yán)重的感染性疾病、免疫系統(tǒng)疾病或肝腎疾病者；④無法配合或不同意新輔助化療的患者。

1.3 新輔助化療方案及效果評(píng)價(jià) 患者均接受SOX方案進(jìn)行新輔助化療，化療藥物為奧沙利鉑及替吉奧(25 mg/粒，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)。新輔助化療為3周方案：每周期第1天給予奧沙利鉑(Oxaliplatin)靜脈給藥，劑量為130 mg/m2；第2天起口服替吉奧2周，劑量為40～60 mg/m2；口服替吉奧結(jié)束后停藥1周后進(jìn)行下一周期化療。

1.4 標(biāo)本采集 腫瘤及癌旁胃黏膜組織均來自胃鏡活檢標(biāo)本，標(biāo)本均一式兩份，一份用于熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)，另一份用于蛋白印跡(Western blot)檢測(cè)。標(biāo)本離體后盡快(30 min內(nèi))置于凍存管并存儲(chǔ)于液氮中，然后轉(zhuǎn)存到-80℃超低溫冰箱。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)miR-145的表達(dá) 用TRIzol從胃癌及癌旁組織中提取總RNA，按照美國(guó)GeneCopia公司試劑盒的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)，以U6 snRNA為內(nèi)參。PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min；然后95℃ 變性30 sec，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，檢測(cè)miR-145的熒光信號(hào)，2ΔΔCt方法計(jì)算miR-145的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.6 Western blot檢測(cè)組織中E-cadherin蛋白的表達(dá) 提取胃癌及癌旁組織的總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，取樣品40 μg上樣，按操作說明次序加入一抗和二抗，以β-actin為內(nèi)參，E-cadherin蛋白條帶曝光顯影后掃描，分別記錄E-cadherin及β-actin蛋白條帶的積分光密度值(integrated optical density value,IOD)，以二者的比值代表相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.7 觀察指標(biāo) (1)患者接受1～4個(gè)周期化療，結(jié)束后1周行胸腹部增強(qiáng)CT，化療效果分為完全緩解(CR，目標(biāo)病灶完全消失)、部分緩解(PR，目標(biāo)病灶縮小>25%)、穩(wěn)定(SD，目標(biāo)病灶變化≤25%)、治療后進(jìn)展(PD，目標(biāo)病灶增大>25%)。(2)除PD患者外，其他患者均于新輔助化療停止后3～6周內(nèi)接受手術(shù)，記錄手術(shù)效果。(3)化療過程中加強(qiáng)隨訪，內(nèi)容為骨髓抑制、嚴(yán)重胃腸道反應(yīng)、末梢神經(jīng)損害等。判斷標(biāo)準(zhǔn)：骨髓抑制是指白細(xì)胞減少(<4×109/L)、或中性粒細(xì)胞減少(<2×109/L)、或血小板減少(<80×109/L)、或貧血(男性HGB<80 g/L，女性HGB<90 g/L)；嚴(yán)重胃腸道反應(yīng)指患者出現(xiàn)嚴(yán)重的惡心、嘔吐癥狀，需要靜脈補(bǔ)液者；末梢神經(jīng)損害指肢體末端出現(xiàn)明顯感覺障礙和(或)感覺異常。

2 結(jié)果

2.1 新輔助化療的療效 80例進(jìn)展期胃癌患者共完成237個(gè)周期新輔助化療(均為SOX方案)，平均(2.96±1.08)周期/人。每個(gè)化療周期結(jié)束后1周進(jìn)行評(píng)價(jià)，最多進(jìn)行4個(gè)周期化療。緩解(CR、PR)及穩(wěn)定(SD)患者化療結(jié)束后3～6周行手術(shù)治療，進(jìn)展(PD)患者則更換化療方案，繼續(xù)化療。80例患者中CR患者4例(5.00%)，PR患者34例(42.50%)，SD患者31例(38.75%)，PD患者11例(13.75%)。CR+PR+SD為化療有效，有效率為86.25%(69/80)。

2.2 新輔助化療的不良反應(yīng) 患者發(fā)生骨髓抑制者31例(38.75%)，嚴(yán)重胃腸道反應(yīng)者17例(21.25%)，末梢神經(jīng)損害者36例(45.00%)。

2.3 治療前胃癌組織與癌旁組織miR-145、E-cadherin的表達(dá)水平 胃癌組織中miR-145、E-cadherin表達(dá)水平低于癌旁組織(P<0.001)。見表1。

表1 胃癌組織與癌旁組織miR-145、E-cadherin表達(dá)水平比較

2.4 化療前胃癌患者組織中miR-145、E-cadherin表達(dá)水平與化療效果的關(guān)系 研究組患者按化療效果分為CR、PR、SD、PD組，治療前miR-145、E-cadherin表達(dá)強(qiáng)度在CR、PR、SD、PD患者組織中表達(dá)依次降低(P<0.05)。見表2。

表2 不同化療效果的胃癌患者腫瘤組織miR-145、E-cadherin表達(dá)

2.5 化療前胃癌患者組織中miR-145、E-cadherin表達(dá)水平與化療不良反應(yīng)的關(guān)系 發(fā)生骨髓抑制的患者miR-145、E-cadherin表達(dá)比無骨髓抑制者更低(P<0.05)，miR-145、E-cadherin表達(dá)與骨髓抑制、嚴(yán)重胃腸道反應(yīng)無關(guān)(P>0.05)。未發(fā)現(xiàn)miR-145、E-cadherin表達(dá)與末梢神經(jīng)損害有關(guān)(P>0.05)。見表3。

表3 化療不良反應(yīng)與胃癌患者新輔助化療前組織中miR-145、E-cadherin表達(dá)的關(guān)系

2.6 腫瘤組織miR-145、E-cadherin關(guān)系 Spearman相關(guān)分析顯示，腫瘤組織miR-145、E-cadherin呈正相關(guān)(r=0.8264,P<0.001)。見圖1。

圖1 胃癌腫瘤組織miR-145、E-cadherin表達(dá)的關(guān)系

3 討論

中國(guó)胃癌的發(fā)病率、病死率在消化道惡性腫瘤中居高不下，嚴(yán)重危害人民的健康[13]。目前胃癌的治療是以手術(shù)、化療、放療、靶向治療及生物免疫治療的綜合治療，其中根治性手術(shù)占位主要地位。由于胃癌早期癥狀無明顯特異性，導(dǎo)致多數(shù)患者就診時(shí)已處于進(jìn)展期，往往失去了根治性手術(shù)的機(jī)會(huì)。為提高這些患者的手術(shù)R0切除率，新輔助化療的在進(jìn)展期胃癌的治療中得到了廣泛應(yīng)用，患者術(shù)前接受新輔助化療，爭(zhēng)取實(shí)現(xiàn)R0切除，術(shù)后繼續(xù)給與輔助化療，取得了較好的臨床效果[14,15]。胃癌患者新輔助化療的主要藥物以鉑類及氟尿嘧啶類藥物為基礎(chǔ)，SOX方案是胃癌一線化療方案之一，奧沙利鉑與替吉奧是方案中的化療藥物，除此之外還配合使用止吐、升白等減輕化療不良反應(yīng)的藥物，化療周期為3周[16]。本研究中，80例新輔助化療的胃癌患者接受了1～4個(gè)療程的化療，未發(fā)生嚴(yán)重的致命性不良反應(yīng)；按化療效果評(píng)價(jià)，治療有效的患者達(dá)到86.25%，這一結(jié)果說明應(yīng)用SOX方案進(jìn)行新輔助化療有良好的治療效果，且具有較好的耐受性。該結(jié)果表明SOX方案可以有效抑制腫瘤的進(jìn)展，在胃癌的新輔助化療中值得推廣應(yīng)用，與其他報(bào)道結(jié)果[17]相符。在80例患者中，仍有11例患者在新輔助化療后出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展，患者未能獲得接受手術(shù)的機(jī)會(huì)。選擇新的標(biāo)志物提前對(duì)新輔助化療的效果進(jìn)行預(yù)測(cè)有重要的臨床價(jià)值。由于miR-145及分子分型在近年來研究中發(fā)現(xiàn)與胃癌關(guān)系密切，故本研究進(jìn)行了相關(guān)檢測(cè)。

由于傳統(tǒng)的胃癌病理分型不能準(zhǔn)確反映治療效果及預(yù)后，故近年來出現(xiàn)了TCGA、ACRG等多種新的分子分型[18]，對(duì)胃癌治療效果及預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)。ACRG分型主要基于亞洲人群，標(biāo)本數(shù)據(jù)主要來自日本和韓國(guó)。ACRG分型將胃癌分為4種分子亞型：(1)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)型，(2)MSS/EMT型，(3)MSS/TP53+型，(4)MSS/TP53-型[18]。MSS/EMT型患者一般發(fā)病年齡較輕，治療效果較差[6]。為方便檢測(cè)，ACRG建議使用免疫組織化學(xué)(IHC)進(jìn)行腫瘤分類，MSS/EMT型可以被E-cadherin識(shí)別。故本研究探討了E-cadherin在判斷胃癌新輔助化療效果中的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E-cadherin在胃癌組織中表達(dá)低于癌旁組織，提示E-cadherin表達(dá)缺失可能是參與胃癌進(jìn)展及遷移的重要蛋白質(zhì)。

非編碼RNA是近年來受到關(guān)注的一大類分子，由于不具有翻譯蛋白質(zhì)功能，原來一直未受到關(guān)注。但近年來發(fā)現(xiàn)這些非編碼RNA可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控編碼基因的mRNA表達(dá)，從而發(fā)揮其調(diào)控功能。微小RNA(microRNA)是一類長(zhǎng)度為20 nt的非編碼單鏈RNA。microRNA主要發(fā)揮的是基因抑制作用，可以通過抑制其靶基因的表達(dá)而參與細(xì)胞生物學(xué)調(diào)控[19,20]。研究發(fā)現(xiàn)miR-145與胃癌有關(guān)，在胃癌中表達(dá)減弱[10,11]，但miR-145表達(dá)情況與胃癌新輔助化療效果的關(guān)系研究還沒有定論。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-145在胃癌組織中表達(dá)低于癌旁組織，提示miR-145具有抑癌基因功能，可能成為胃癌新輔助化療效果預(yù)測(cè)的新標(biāo)志物。但其具體作用機(jī)制還需要深入研究。

為了解miR-145、E-cadherin作為胃癌新輔助化療效果評(píng)價(jià)指標(biāo)的可行性，本研究比較分析了新輔助化療效果與miR-145、E-cadherin表達(dá)水平的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-145、E-cadherin的表達(dá)具有明顯的一致性，在CR、PR、SD、PD患者組織中表達(dá)依次降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。我們據(jù)此結(jié)果進(jìn)行推測(cè)，化療前患者腫瘤組織miR-145、E-cadherin明顯降低，提示SOX新輔助化療可能效果不太理想，應(yīng)選擇其他治療方案。

為深入分析miR-145、E-cadherin預(yù)測(cè)胃癌新輔助化療效果的綜合價(jià)值，本研究還分析了miR-145、E-cadherin表達(dá)水平與化療不良反應(yīng)的關(guān)系。結(jié)果顯示，發(fā)生骨髓抑制的患者miR-145、E-cadherin表達(dá)比無骨髓抑制者明顯降低，提示SOX新輔助化療前檢測(cè)miR-145、E-cadherin表達(dá)可能對(duì)預(yù)測(cè)骨髓抑制的發(fā)生有一定幫助。但研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)miR-145、E-cadherin與消化道不良反應(yīng)及末梢神經(jīng)損害有關(guān)，因此我們考慮miR-145、E-cadherin在預(yù)測(cè)新輔助化療不良反應(yīng)方面仍有明顯的局限性。

綜上所述，接受新輔助化療的進(jìn)展期胃癌患者的組織中miR-145、E-cadherin存在表達(dá)明顯降低的現(xiàn)象，檢測(cè)miR-145、E-cadherin表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)胃癌新輔助化療效果和不良反應(yīng)有重要意義。