CCR6、p38在鼻咽癌組織中的表達(dá)及臨床意義

王素珍 張潔民

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是頭頸部常見的惡性腫瘤，其早期癥狀不明顯，病灶隱匿，患者就診時(shí)多處于中晚期，治療效果不理想[1,2]。因此，積極探究NPC發(fā)病機(jī)制，尋找可早期診斷、評(píng)估NPC預(yù)后的指標(biāo)甚是關(guān)鍵。目前，研究認(rèn)為，NPC發(fā)病與信號(hào)通路改變、炎性反應(yīng)、環(huán)境因素、抑癌基因失活、EB病毒感染、癌基因激活等相關(guān)[3,4]。CC趨化因子受體6(CC-chemokine receptor 6,CCR6)是一種G蛋白偶聯(lián)受體，其在肝細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，其可能通過影響癌細(xì)胞增殖、侵襲及血管生成，進(jìn)而影響肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展[5]；p38是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的一員，其在NPC中表達(dá)水平升高，與腫瘤TNM分期顯著相關(guān)，可作為評(píng)估NPC臨床分期的潛在指標(biāo)[6]；且CCR6可通過激活P38途徑促進(jìn)喉癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及增殖[7]。而CCR6在NPC中的表達(dá)水平與p38的關(guān)系及二者與NPC預(yù)后的關(guān)系鮮有報(bào)道。本研究通過測(cè)定NPC患者癌組織CCR6、p38表達(dá)水平，旨在分析二者關(guān)系及其與NPC預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年3月至2017年9月我院收治的NPC患者91例進(jìn)行研究，均符合按《鼻咽癌診斷和治療》有關(guān)NPC判定標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行診斷。男54例，女37例；年齡37～70歲，平均年齡(54.75±11.28)歲；<55歲者43例，≥55歲者48例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者49例，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移者42例；TNM分期中Ⅰ～Ⅱ期者62例，Ⅲ～Ⅳ期者29例；低分化者35例，中、高分化者56例；有吸煙史33例，無吸煙史58例。受試對(duì)象及家屬簽署知情同意書，本研究符合《赫爾辛基宣言》，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者符合NPC診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)術(shù)后組織病理檢查/鼻內(nèi)鏡下活檢明確診斷；②患者入院前未接受放化療或其他抗腫瘤治療；③患者具備完整檢查資料。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重感染性疾病、肝、腎、心等器官功能障礙者；②合并其他惡性腫瘤、失訪者。

1.3 方法

1.3.1 組織標(biāo)本收集:NPC患者進(jìn)行根治性切除術(shù)時(shí)，留取部分NPC組織以及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織，0.9%氯化鈉溶液清洗后，置于甲醛溶液中固定，制備石蠟標(biāo)本切片，備用。

1.3.2 免疫組化法檢測(cè)NPC組織、癌旁正常組織標(biāo)本CCR6、p38蛋白表達(dá)情況：取石蠟組織切片(約3 μm 厚)，應(yīng)用免疫組化SP法染色，操作步驟依據(jù)試劑盒說明書，一抗為兔抗人CCR6抗體(貨號(hào)：ab78429，Abcam公司)、p38抗體(貨號(hào)：gtx48614，Genetex公司)，二氨基聯(lián)苯胺顯色30 s，蘇木素復(fù)染2～3 s，自來水洗10～15 min，蒸餾水洗，不同濃度乙醇脫水，封片，顯微鏡(型號(hào)：Ti2，日本尼康)下拍照。依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例(A)與染色程度(B)評(píng)分乘積判斷CCR6、p38蛋白表達(dá)情況，A：將陽(yáng)性細(xì)胞比例<25%、25%～49%、50%～75%、>75%分別定義為0、1、2、3分；B：將染色程度無色、淡黃色、棕黃色、黃褐色分別定義為0、1、2、3分。CCR6、p38蛋白表達(dá)評(píng)估結(jié)果(A×B)：<3分為陰性，以≥3分為陽(yáng)性。

1.4 隨訪 患者出院后進(jìn)行3年隨訪，以門診、微信、電話為主要隨訪方式，隨訪截至2020年9或NPC患者死亡，統(tǒng)計(jì)NPC患者生存情況。

2 結(jié)果

2.1 NPC患者組織中CCR6、p38蛋白表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果顯示，CCR6主要定位于細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞膜，p38主要定位于細(xì)胞核。與癌旁正常組織比較，NPC組織CCR6、p38蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高(P<0.05)。見圖1、2，表1。

陰性表達(dá) 陽(yáng)性表達(dá)

陰性表達(dá) 陽(yáng)性表達(dá)

表1 NPC患者組織中CCR6、p38蛋白表達(dá)情況 n=91,例(%)

2.2 NPC組織CCR6、p38表達(dá)水平與臨床病理特征關(guān)系 NPC組織CCR6、p38表達(dá)水平均與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度明顯相關(guān)(P<0.05)，與性別、吸煙史、年齡無相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表2 NPC組織CCR6、p38表達(dá)水平與臨床病理特征關(guān)系 例

2.3 NPC組織中CCR6表達(dá)水平與p38的相關(guān)性 Spearman等級(jí)相關(guān)性分析顯示，NPC組織中CCR6表達(dá)水平與p38呈正相關(guān)(r=0.583，P<0.001)。見表3。

表3 NPC組織中CCR6表達(dá)水平與p38的相關(guān)性 例

2.4 NPC組織CCR6、p38表達(dá)水平與NPC患者預(yù)后的關(guān)系 對(duì)91例NPC患者進(jìn)行36個(gè)月跟蹤隨訪，死亡31例，總生存率為65.93%。CCR6陽(yáng)性組NPC患者術(shù)后36個(gè)月總生存率為54.39%，明顯低于CCR6陰性組生存率85.29%(χ2=9.058，P=0.003)；p38陽(yáng)性組NPC患者術(shù)后36個(gè)月總生存率為54.55%，明顯低于p38陰性組總生存率83.33%(χ2=8.028，P=0.005)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，CCR6陽(yáng)性組NPC患者術(shù)后36個(gè)月累積生存率明顯低于CCR6陰性組(χ2=8.002，P=0.005)；p38陽(yáng)性組NPC患者術(shù)后36個(gè)月累積生存率明顯低于p38陰性組(χ2=7.613，P=0.006)。見圖3、4。

圖3 癌組織CCR6表達(dá)水平與NPC患者預(yù)后的關(guān)系

2.5 NPC患者預(yù)后的影響因素 COX單因素分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、p38、TNM分期、CCR6是影響NPC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，分化程度是影響NPC患者預(yù)后的保護(hù)因素(P<0.05)；多因素分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、p38、TNM分期、CCR6是影響NPC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表4。

圖4 癌組織p38表達(dá)水平與NPC患者預(yù)后的關(guān)系

表4 影響NPC患者預(yù)后因素的COX回歸分析

3 討論

NPC是一種源于鼻咽部黏膜的腫瘤，其發(fā)病率較高，隨著放化療的完善，NPC患者治療效果雖有所提高，但不甚理想，對(duì)患者生存質(zhì)量構(gòu)成威脅[9,10]。因此，積極尋找與NPC發(fā)生發(fā)展，且可評(píng)估NPC預(yù)后的標(biāo)志物，對(duì)及早診斷NPC、制定個(gè)體化治療方案，改善患者預(yù)后有積極意義。

CCR6是CC趨化因子配體20(CC chemokine ligand 20,CCL20)的受體，二者相互作用可促進(jìn)腫瘤免疫逃逸、血管生成及細(xì)胞遷移、增殖、炎性反應(yīng)[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)，CCR6在結(jié)直腸癌中表達(dá)水平較高，其可能通過促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)而在結(jié)直腸癌發(fā)展及肝轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進(jìn)作用[14]；另外，CCR6在肝細(xì)胞癌中呈高表達(dá)，與不良預(yù)后有關(guān)，其是影響肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，具有判斷肝細(xì)胞癌患者預(yù)后情況的潛在價(jià)值[15]。以上研究表明，CCR6可能在多種腫瘤發(fā)病進(jìn)展中起促癌作用。本研究中NPC組織CCR6蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常組織，提示CCR6可能與NPC發(fā)生發(fā)展有關(guān)，分析原因，一方面，高表達(dá)CCR6可能通過與其配體CCL20結(jié)合，激活炎性信號(hào)通路，促進(jìn)血管生成，促進(jìn)腫瘤發(fā)生，另一方面高表達(dá)CCR6可能與CCL20結(jié)合后，增加對(duì)NPC細(xì)胞遷移、增殖、上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子或逃逸[16]，從而促進(jìn)NPC發(fā)展，但具體機(jī)制有賴深入探究。進(jìn)一步探究顯示，NPC組織CCR6蛋白表達(dá)水平與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度相關(guān)，提示CCR6與NPC病情進(jìn)展相關(guān)，可能在NPC發(fā)生發(fā)展中具有促癌作用。

p38是一種蛋白質(zhì)，分子量為38 KDa，刺激因子可促進(jìn)P38酪氨酸和蘇氨酸雙磷酸化，P38被激活，促使P38進(jìn)入細(xì)胞核，影響轉(zhuǎn)錄因子活性及細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，調(diào)節(jié)信號(hào)通路有關(guān)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)，在腫瘤血管生成、細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、分化、炎性反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用[17,18]。研究發(fā)現(xiàn)，p38在胰腺癌中呈異常表達(dá)，其可能通過影響血管生成、胰腺癌遷移、侵襲，從而影響胰腺癌發(fā)病進(jìn)程[19]；另外，甘草查爾酮A可通過影響P38信號(hào)通路進(jìn)而影響NPC細(xì)胞凋亡，P38可能在NPC病理發(fā)展中發(fā)揮重要作用[20]；且Farhat等[6]研究發(fā)現(xiàn)NPC患者P38呈過表達(dá)，具有判斷NPC臨床分期的潛在價(jià)值。以上研究表明，P38可能與NPC病變過程密切相關(guān)。本研究中NPC組織P38蛋白陽(yáng)性表達(dá)率較高，提示P38可能在NPC中具有重要作用，推測(cè)P38過表達(dá)可能通過影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移、異常增殖、遷移、血管生成等過程進(jìn)而在NPC發(fā)生發(fā)展中起作用，其機(jī)制有待結(jié)合基礎(chǔ)研究證實(shí)。本研究顯示，NPC組織P38蛋白表達(dá)水平隨腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期增高、分化程度降低而升高，提示P38與NPC疾病發(fā)展相關(guān)，測(cè)定鼻咽組織P38表達(dá)水平有助于確定NPC患者病情嚴(yán)重程度，確定治療方案。

本研究中NPC患者癌組織中CCR6表達(dá)水平與p38呈正相關(guān)，提示CCR6可能與p38共同影響NPC病變進(jìn)程，推測(cè)CCR6可能與CCL20結(jié)合，激活P38信號(hào)通路，影響NPC發(fā)生發(fā)展，但具體機(jī)制仍需深入探討。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CCR6陽(yáng)性組、p38陽(yáng)性組NPC患者術(shù)后36個(gè)月總生存率明顯低于CCR6陰性組、p38陰性組，提示CCR6、p38與NPC患者預(yù)后相關(guān)，CCR6、p38表達(dá)水平越高，NPC患者預(yù)后可能越差，兩者有望成為臨床評(píng)估NPC患者預(yù)后的指標(biāo)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、p38、TNM分期、CCR6是影響NPC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移、TNM分期越高、CCR6、p38表達(dá)水平升高均可能會(huì)使NPC患者發(fā)生不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)升高，及時(shí)測(cè)定鼻咽組織CCR6、p38表達(dá)水平可能有利于及早診治、評(píng)估NPC預(yù)后。

綜上所述，CCR6、p38在NPC患者癌組織中均呈高表達(dá)，兩者均可能在NPC中發(fā)揮一定作用，且CCR6、p38可作為評(píng)估NPC患者預(yù)后的標(biāo)志物。后期仍需深入探究CCR6、p38在NPC中的作用機(jī)制，為臨床診治NPC提供新靶點(diǎn)，增加說服力。