白頭翁皂苷D介導AMPK/COX-2通路對食管癌細胞增殖、凋亡的影響

王凱 李偉偉 王佳

食管癌為臨床常見消化道腫瘤，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高趨勢，其惡性程度高，死亡率高，食管癌的治療手段主要為手術和放化療，但患者預后不佳，5年生存率較低，因此，研究食管癌發(fā)生發(fā)展的機制對其臨床治療具有重要意義[1,2]。白頭翁皂苷是從白頭翁中提取的具有生物活性的天然產(chǎn)物，具有抗炎、抗腫瘤的作用，白頭翁皂苷有多種有效單體成分，其中白頭翁皂苷D(pulsatilla saponin D)具有抗多種腫瘤的作用[3]。王冰等[4]研究表明，白頭翁皂苷D可通過調控Wnt信號通路而抑制宮頸癌細胞的增殖。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)是細胞能量代謝的調節(jié)器，AMPK的激活可抑制人食管癌細胞的生長增殖，并可誘導細胞凋亡[5]。環(huán)氧合酶-2(cyclo-oxygenase-2，COX-2)作為一種誘導酶，在食管癌等多種腫瘤組織中表達水平升高，具有促癌的作用[6]。研究顯示，吲哚類化合物GY3可激活AMPK并抑制COX-2的表達抑制乳腺癌細胞MCF-7的增殖，并誘導其凋亡[7]。因此，本研究觀察白頭翁皂苷D對EC9706細胞凋亡及AMPK/COX-2通路的影響，初步探討白頭翁皂苷D對食管癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 白頭翁皂苷D(純度≥98%)購自南京春秋生物工程有限公司，人食管癌細胞EC9706購自中國科學院上海細胞庫，AMPK抑制劑Compound C購自德國Merck公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)與DMEM細胞培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒購自Sigma公司；異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗人Bax、Bcl-2、p53、COX-2單克隆抗體及羊抗兔IgG單克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗人p-AMPKα、p-ACC多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；ELx800型酶標儀購自美國Bio-Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 EC9706細胞培養(yǎng)與處理:EC9706細胞復蘇后，將細胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，每隔48 h換液傳代培養(yǎng)，待細胞至對數(shù)生長期時用于后續(xù)實驗。取對數(shù)生長期EC9706細胞，使用濃度為5、10、20、40、80 μmol/L白頭翁皂苷D處理細胞，對照組加入等體積的PBS緩沖液，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加10 μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入DMSO溶液，于酶標儀波長490 nm處檢測各孔吸光度(OD)值，繪制生長曲線，計算白頭翁皂苷D的半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)。

1.2.2 分組與干預:將對數(shù)生長期的EC9706細胞分為5組，分別為對照組(不做任何處理)，白頭翁皂苷D(PSD)低、中、高劑量組，PSD高劑量+AMPK抑制劑(Compound C)組，PSD白頭翁皂苷D低、中、高劑量組分別加入含終濃度10、20、40 μmol/L白頭翁皂苷D的DMEM培養(yǎng)液，PSD高劑量+Compound C組使用40 μmol/L白頭翁皂苷D與10 μmol/L Compound C共同處理細胞，各組細胞培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實驗。

1.2.3 平板克隆形成實驗:取各組處理的EC9706細胞，調整細胞濃度，以每孔1×103個細胞接種于6孔板中，于37℃條件下培養(yǎng)14 d，PBS洗滌后，使用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色30 min，顯微鏡觀察細胞克隆數(shù)，計算克隆形成率。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡:取各組EC9706細胞，胰酶消化后，使用結合緩沖液binding buffer調整細胞濃度為2×105個/ml的細胞懸液，分別加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI溶液混合均勻，室溫避光孵育30 min，流式細胞儀檢測EC9706細胞凋亡情況。

1.2.5 Western blot法檢測Bax、Bcl-2、p53、p-AMPKα、p-ACC、COX-2蛋白表達：各組處理的EC9706細胞培養(yǎng)48 h后，加入100 μl的RIPA裂解液，裂解30 min后取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度，取20 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉膜，5%的BSA封閉1 h，分別加入稀釋過的兔抗人Bax(1∶2 000)、Bcl-2(1∶2 000)、p53(1∶2 000)、p-AMPKα(1∶1 000)、p-ACC(1∶800)、COX-2(1∶2 000)單克隆抗體，室溫孵育2 h，再加入HRP標記的二抗(1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h，ECL試劑顯色，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，SigmaScan Pro 5軟件分析各蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 白頭翁皂苷D對EC9706細胞活性的影響 使用濃度為5、10、20、40、80 μmol/L白頭翁皂苷D分別處理EC9706細胞24 h、48 h、72 h后，細胞存活率逐漸降低。經(jīng)計算，白頭翁皂苷D處理EC9706細胞48 h時IC50約為20 μmol/L，故后續(xù)實驗中選擇10、20、40 μmol/L的濃度作為后續(xù)實驗用藥劑量。見圖1，表1。

圖1 EC9706細胞增殖曲線

表1 不同濃度白頭翁皂苷D處理后EC9706細胞活性

2.2 白頭翁皂苷D對EC9706細胞克隆形成能力的影響 與對照組比較，PSD低、中、高劑量組EC9706細胞克隆形成率顯著降低，并呈濃度依賴性(P<0.05)；與PSD高劑量組(85.47±4.25)%比較，PSD高劑量+Compound C組的細胞克隆形成率(113.35±3.94)%顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2，圖2。

表2 白頭翁皂苷D對EC9706細胞克隆形成率的影響

對照組 PSD低劑量組 PSD中劑量組 PSD高劑量組 PSD高劑量+Compound C組

2.3 白頭翁皂苷D對EC9706細胞凋亡的影響 與對照組比較，PSD低、中、高劑量組EC9706細胞凋亡率顯著升高，并呈濃度依賴性(P<0.05)；與PSD高劑量組比較，PSD高劑量+Compound C組細胞凋亡率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3，表3。

對照組 PSD低劑量組 PSD中劑量組 PSD高劑量組 PSD高劑量+Compound C組

表3 白頭翁皂苷D對EC9706細胞凋亡的影響

2.4 白頭翁皂苷D對EC9706細胞凋亡相關蛋白表達的影響 與對照組比較，PSD低、中、高劑量組EC9706細胞Bax、p53蛋白表達水平升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，并呈濃度依賴性(P<0.05)；與PSD高劑量組比較，PSD高劑量+Compound C組細胞Bax、p53蛋白表達水平顯著降低，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖4，表4。

圖4 5組EC9706細胞Bax、Bcl-2、p53蛋白表達;A 對照組；B PSD低劑量組；C PSD中劑量組；D PSD高劑量組；E PSD高劑量+Compound C組

表4 白頭翁皂苷D對EC9706細胞凋亡相關蛋白表達的影響

2.5 白頭翁皂苷D對EC9706細胞AMPK/COX-2通路相關蛋白表達的影響 與對照組相比，與PSD低、中、高劑量組p-AMPKα、p-ACC表達水平顯著升高，COX-2蛋白表達顯著降低，并呈濃度依賴性(P<0.05)；與PSD高劑量組相比，PSD高劑量+Compound C組p-AMPKα、p-ACC蛋白表達水平顯著降低，COX-2蛋白表達顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5，圖5。

表5 白頭翁皂苷D對EC9706細胞AMPK/COX-2通路相關蛋白表達的影響

圖5 5組EC9706細胞p-AMPKα、p-ACC、COX-2蛋白表達；A 對照組；B PSD低劑量組；C PSD中劑量組；D PSD高劑量組；E PSD高劑量+Compound C組

3 討論

白頭翁具有清熱解毒、涼血止痢等功效，其提取物白頭翁皂苷有A、B4、D、E等多種單體成分，具有抗炎、舒張血管、抗腫瘤等多種藥理作用，在抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞分化與凋亡、抗血管生成活性、逆轉腫瘤細胞耐藥等方面發(fā)揮重要作用，對肝癌、胃癌、結腸癌等多種腫瘤具有體外抑制作用[8-10]。Zhu等[11]研究表明，白頭翁皂苷E通過負調控Akt/FASN信號通路，抑制非小細胞肺癌細胞的遷移、侵襲和凋亡。鄒曉靜等[12]研究表明，白頭翁皂苷A通過調控miR-24-3p/環(huán)指蛋白2抑制乳腺癌細胞的增殖，增強細胞的放射敏感性。

本研究結果顯示，濃度為5、10、20、40、80 μmol/L白頭翁皂苷D能顯著抑制EC9706細胞活性，處理48 h 時IC50約為20μmol/L，故選擇10、20、40 μmol/L的濃度進行后續(xù)實驗。使用不同濃度白頭翁皂苷D處理EC9706細胞后，EC9706細胞克隆形成率、Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，EC9706細胞凋亡及Bax、p53蛋白表達水平顯著升高，且呈藥物濃度依賴性，表明白頭翁皂苷D可顯著抑制EC9706細胞增殖，促進細胞凋亡，然而其機制尚不清楚。

AMPK是調節(jié)能量代謝的酶，可調節(jié)細胞代謝與腫瘤進展，AMPK可以有效地促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡，抑制細胞生長與遷移[13]。多項研究顯示，AMPK與食管癌細胞的凋亡有關，激活AMPK可誘導食管癌細胞的凋亡[14]。另有研究顯示，蟲草素通過誘導AMPK的激活和抑制AKT信號通路來增強食管癌細胞對順鉑的化療敏感性[15]。COX-2在食管癌等多種腫瘤中高表達，具有抗腫瘤細胞凋亡的作用，可通過AKT信號通路依賴的方式促進非小細胞肺癌細胞的上皮間質轉化[16,17]。AMPK的激活可抑制COX-2的表達，促進腫瘤細胞的凋亡，研究表明，熊果酸可通過調節(jié)AMPK/STAT-3/COX-2信號通路抑制乳腺癌細胞的生長、遷移與侵襲[18]。

本研究使用白頭翁皂苷D處理EC9706細胞后，細胞中p-AMPKα、p-ACC蛋白表達水平顯著升高，COX-2蛋白表達顯著降低，并呈濃度依賴性，提示白頭翁皂苷D可能激活AMPK通路，而抑制COX-2的表達。在白頭翁皂苷D處理基礎上加入AMPK抑制劑Compound C后，細胞存活率、Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，細胞凋亡率、Bax、p53蛋白表達水平顯著降低，表明抑制AMPK通路可部分逆轉白頭翁皂苷D對EC9706細胞的增殖抑制作用和凋亡促進作用，進一步證實白頭翁皂苷D具有激活AMPK通路的作用。因此推測白頭翁皂苷D可通過激活AMPK通路，抑制COX-2表達進而抑制EC9706細胞增殖，促進細胞凋亡。

綜上所述，白頭翁皂苷D抑制EC9706細胞增殖，促進其凋亡，可能與激活AMPK通路，抑制COX-2表達有關。但由于細胞內(nèi)信號轉導機制涉及通路復雜，其具體作用機制仍需做進一步研究。