右美托咪定調(diào)控NLRP3炎癥小體活化改善動(dòng)物模型術(shù)后認(rèn)知功能障礙的作用

項(xiàng)金慧 汪靜 李興 仲勇

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)以認(rèn)知能力的短期損害為特征，包括記憶、情緒、意識(shí)和睡眠障礙，是全麻后影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，特別是對(duì)于老年患者[1]。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一種強(qiáng)效且高度選擇性的跨膜G蛋白偶聯(lián)α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，可減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)交感神經(jīng)流出并提供鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用[2]。動(dòng)物研究表明，DEX在手術(shù)后具有神經(jīng)保護(hù)作用并改善認(rèn)知功能，在臨床研究中，也有報(bào)道顯示其具有神經(jīng)認(rèn)知方面的有益作用[3]。研究認(rèn)為包含NACHT、LRR和PYD域的蛋白3(NACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3，NLRP3)是NLRP3炎癥小體的關(guān)鍵蛋白，其可促進(jìn)下游白介素(interleukin，IL)-1β前體(pro-IL-1β)的水解激活，從而引起炎性損傷[4]。NLRP3小體受到氧化應(yīng)激的激活，并參與POCD的重要機(jī)制[5]。本文主要分析DEX調(diào)控NLRP3炎癥小體活化改善POCD的作用和機(jī)制，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 Sprague Dawley大鼠[年齡：18個(gè)月；體重：500～600 g；澎立生物公司，合格證號(hào)：SYXK(瀘)2019-0010]。右美托咪啶(四川國(guó)瑞藥業(yè))。莫里斯水迷宮(XR-XM101，上海新軟信息技術(shù)有限公司，中國(guó))。HE試劑盒(碧云天公司，中國(guó))。TUNEL試劑盒(Roche公司，德國(guó))。BestarTMqPCR試劑盒(DBI Bioscience公司，德國(guó))?？贵w、一抗和山羊抗免疫球蛋白G(IgG)二抗(1∶1 000稀釋，#ab6721)(Abcam公司，美國(guó))。硝酸纖維素膜(EMD Millipore，美國(guó))。ECL 顯色試劑盒(Thermo Fisher公司，美國(guó))。光學(xué)顯微鏡(Nikon，美國(guó))。

1.2 動(dòng)物分組、建模和干預(yù) 60只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、POCD組和POCD+DEX組，每組20只。根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]建立大鼠POCD模型。將動(dòng)物圈養(yǎng)在(22±2)℃、45～75%相對(duì)濕度和12 h的明暗循環(huán)的環(huán)境中。術(shù)前禁食12 h。大鼠吸入異氟醚(2.0%)進(jìn)行麻醉。對(duì)大鼠進(jìn)行氣管插管和機(jī)械通氣，潮氣量：10 ml/kg，呼吸頻率：60～65 次/min。在整個(gè)手術(shù)過(guò)程中，通過(guò)暴露于空氣(21% O2和 79% N2)和 1.5%～2.0% 異氟醚的混合物對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。消毒后，在劍突下緣做一個(gè) 3 cm的垂直切口，解剖左肝葉。探查肝左葉并結(jié)扎根部，隨后切除。切口用0.25%布比卡因浸潤(rùn)，用3-0縫線縫合。手術(shù)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，手術(shù)時(shí)間控制在30 min以內(nèi)。Dex 組在手術(shù)前 30 min接受腹膜內(nèi)注射DEX，劑量為20 μg/kg[7]。通過(guò)Morris水迷宮試驗(yàn)在術(shù)后第1、3、7天。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 水迷宮實(shí)驗(yàn):水迷宮注滿水，溫度控制在(25±1)℃。水池直徑為1.6 m，高度為40 cm。一個(gè)平臺(tái)隱藏在水面以下1 cm處。第一階段(定位導(dǎo)航)：將大鼠依次靠墻放置在四象限水迷宮中，如果動(dòng)物在 90 s內(nèi)登上平臺(tái)區(qū)域，則記錄結(jié)束；如果動(dòng)物在90 s內(nèi)沒(méi)有登上平臺(tái)區(qū)域，則用棍子將大鼠引導(dǎo)到平臺(tái)并在那里保持30 s。每只大鼠訓(xùn)練4次/d。試驗(yàn)之間的間隔>2 min。第二階段(探索)：第一至第四象限全部完成，拆除水迷宮平臺(tái)，將大鼠置于同一象限靠墻觀察動(dòng)物90 s的動(dòng)作軌跡，記錄目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)，二者數(shù)值越低提示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.3.2 蘇木精和伊紅(HE)染色：HE染色檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元的病理變化。海馬神經(jīng)元組織用10%甲醛溶液固定48 h，流水沖洗。不同濃度的乙醇脫水，然后將組織浸入蠟中，并切成4～7 μm的厚度。將載玻片置于65℃恒溫烘箱中30 min。然后二甲苯Ⅰ中15 min、二甲苯Ⅱ中15 min脫蠟。脫蠟切片用不同濃度乙醇浸泡5 min，自來(lái)水沖洗10 min。然后將切片分別用 HE染色。細(xì)胞核用蘇木精染色5 min，細(xì)胞質(zhì)用伊紅染色1～2 min。染色切片用純乙醇脫水并在光學(xué)顯微鏡(ECLIPSE Ni，Nikon USA)下檢查。

1.3.3 TUNEL染色：石蠟包埋的海馬組織的5 μm切片用二甲苯脫石蠟2次，10 min/次，然后經(jīng)過(guò)梯度乙醇透脫水(乙醇濃度：100%、95%、90%、80%和70%)。切片在37℃的潮濕暗箱中用50 μl的TUNEL反應(yīng)溶液處理60 min。隨后，將50 μl鏈霉親和素-HRP 工作液加入切片中孵育30 min。用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行熒光染色，然后進(jìn)行常規(guī)脫水、脫色和固定。檢查細(xì)胞凋亡率并使用光學(xué)顯微鏡400 的放大倍數(shù)捕獲圖像，計(jì)算TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比例：細(xì)胞凋亡指數(shù)=(TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3.4 免疫組化染色:通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)和NLRP3的表達(dá)水平。用4%的多聚甲醛將海馬組織固定，乙醇脫水包埋在石蠟中，制成厚度為4 μm的切片制作玻片標(biāo)本。加入3%過(guò)氧化氫溶液，室溫靜置20 min，然后分別加入1∶400稀釋的NLRP3抗體在37℃孵育60 min；洗滌后加入100 μl的山羊抗兔IgG聚合物室溫下孵育50 min；洗滌后加入適量新鮮配制的DAB顯色液，然后加入蘇木素染色液孵育20 s，沖洗后顯微鏡觀察。利用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算為4個(gè)隨機(jī)視野中NLRP3的的顏色強(qiáng)度(0～3分)和染色范圍(0～4分)，染色強(qiáng)度為二者乘積。

1.3.5 RT-qPCR：使用RNeasy Mini試劑盒取海馬組織中的總RNA，然后將其逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件如下：37℃/15 min；98℃/5min。使用BestarTMqPCR預(yù)混液進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，條件如下：95℃/2 min，94℃/20 s，58℃ 20 s，72℃/20 s，40個(gè)循環(huán)，最后在72℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR分析。通過(guò)比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.6 Western blot檢測(cè)蛋白：細(xì)胞裂解后通過(guò)離心(4℃，12 000 r/min，5 min)收集總蛋白。通過(guò)8%的SDS-PAGE分離每個(gè)樣品中等量(50 μg)的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。通過(guò)在室溫下將膜浸入5%脫脂牛奶中2 h來(lái)封閉非特異性抗原。隨后，將膜與anti-DNMT3A體在4℃下孵育過(guò)夜，然后將膜與相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯示，使用Quantum One軟件分析灰度計(jì)算IL-1β、半胱天冬酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1)蛋白相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 DEX對(duì)POCD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 POCD組的目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，POCD+DEX組的目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)顯著高于POCD組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 DEX對(duì)POCD模型大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

2.2 DEX對(duì)POCD模型大鼠海馬組織損傷的影響 對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元清晰，細(xì)胞核大而圓，位于細(xì)胞中央。POCD組海馬神經(jīng)元表現(xiàn)為核凝聚、空泡化、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。POCD+DEX組的損傷情況較POCD組有所減輕。見(jiàn)圖1。

對(duì)照組 POCD組 POCD+DEX組

2.3 DEX對(duì)POCD模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響 綠色為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，藍(lán)色為細(xì)胞核。3組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。POCD組的凋亡指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，POCD+DEX組的凋亡指數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表2。

對(duì)照組 POCD組 POCD+DEX組

表2 DEX對(duì)POCD模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

2.4 DEX對(duì)POCD模型大鼠海馬神經(jīng)元中NLRP3表達(dá)的影響 棕色為被染色的NLRP3蛋白。3組大鼠海馬神經(jīng)元中NLRP3 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。POCD組的NLRP3 mRNA和蛋白顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，POCD+DEX組的NLRP3mRNA和蛋白顯著低于POCD組(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖3。

表3 DEX對(duì)POCD模型大鼠海馬神經(jīng)元中NLRP3蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組 POCD組 POCD+DEX組

2.5 DEX對(duì)POCD模型大鼠海馬神經(jīng)元中NLRP3炎癥小體活化的影響 IL-1β和Caspase-1蛋白是NLRP3炎癥小體活化后釋放或活化的蛋白。POCD組的IL-1β和Caspase-1蛋白顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，POCD+DEX組的IL-1β和Caspase-1蛋白顯著低于POCD組(P<0.05)。見(jiàn)圖4，表4。

圖4 Western blot檢測(cè)DEX對(duì)POCD模型大鼠海馬神經(jīng)元中NLRP3炎癥小體活化蛋白IL-1β和Caspase-1的影響

表4 DEX對(duì)POCD模型大鼠海馬神經(jīng)元中NLRP3炎癥小體活化的影響

3 討論

POCD的臨床表現(xiàn)主要包括認(rèn)知功能障礙、人格改變和記憶功能減退；此外，在預(yù)后方面POCD還會(huì)導(dǎo)致死亡率增加、恢復(fù)期延遲、并發(fā)癥發(fā)生率升高和住院時(shí)間延長(zhǎng)，并導(dǎo)致醫(yī)療費(fèi)用增加[8]。更重要的是，這種短期功能障礙可發(fā)展為永久性認(rèn)知障礙，如阿爾茨海默病等，并最終導(dǎo)致患者喪失獨(dú)立生活，并在術(shù)后造成嚴(yán)重的身心傷害[9]。預(yù)防和緩解POCD具有重要的臨床意義。

DEX可與位于大腦和脊髓中的跨膜 G 蛋白結(jié)合受體結(jié)合。它影響中樞神經(jīng)、循環(huán)系統(tǒng)的功能，并表現(xiàn)出鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、交感神經(jīng)的特性[10]。DEX已廣泛應(yīng)用于不同的臨床環(huán)境，如麻醉科和重癥監(jiān)護(hù)病房。最近，DEX對(duì)POCD的影響是臨床研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)，關(guān)于DEX對(duì)POCD 的有效性的爭(zhēng)議仍在繼續(xù)[11,12]。本研究根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]通過(guò)手術(shù)模擬體內(nèi)POCD模型，并根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]的方法在術(shù)前通過(guò)腹膜內(nèi)注射DEX進(jìn)行干預(yù)，水迷宮結(jié)果顯示DEX能夠顯著的緩解POCD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。

研究認(rèn)為人類的記憶、學(xué)習(xí)以及認(rèn)知功能與海馬體密切相關(guān)[13]，本研究結(jié)果還顯示POCD模型大鼠海馬神經(jīng)元出現(xiàn)炎性損傷，大量神經(jīng)元凋亡，DEX干預(yù)能夠顯著的緩解海馬組織損傷并抑制神經(jīng)元凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)DEX可靶向JAK/STAT3信號(hào)通路抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡[14]。也有研究發(fā)現(xiàn)DEX通過(guò)調(diào)控PINK1蛋白介導(dǎo)的線粒體自噬消除受損線粒體，從而減輕脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥[15]。本研究結(jié)果表明在術(shù)前腹腔注射DEX能夠保護(hù)POCD大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能，緩解海馬神經(jīng)元炎性損傷和凋亡。

為進(jìn)一步分析DEX保護(hù)POCD大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能的機(jī)制，本研究檢測(cè)了NLRP3炎癥小體的表達(dá)。NLRP3炎癥小體可被多種因素激活，包括環(huán)境刺激物、內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)、病原體和各種與病原體相關(guān)的分子模式，而活性氧、細(xì)菌等被確定為重要的NLRP3炎癥小體激活劑[16]。NLRP3炎癥小體主要包括NLRP3蛋白、半胱氨酸蛋白酶Caspase-1，研究顯示在POCD中，NLRP3小體被激活后會(huì)促進(jìn)前體IL-1β和Caspase-1蛋白水解為IL-1β和Caspase，從而導(dǎo)致炎性反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡[17,18]。

通過(guò)免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)在POCD模型大鼠的海馬體神經(jīng)元中，NLRP3蛋白表達(dá)水平顯著升高，并且炎癥小體激活后的標(biāo)志蛋白IL-1β和Caspase-1表達(dá)水平也顯著升高，而DEX能夠顯著的抑制POCD模型大鼠的海馬體神經(jīng)元中NLRP3、IL-1β和Caspase-1蛋白的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)DEX能夠通過(guò)抑制NLRP3 炎癥小體以減輕大鼠木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎[19]。Yao等[20]研究發(fā)現(xiàn)DEX通過(guò)調(diào)節(jié) TLR4通路抑制 NLRP3 炎癥小體激活，從而減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性腎損傷。本此研究結(jié)果表明DEX能夠顯著抑制POCD海馬體神經(jīng)元中NLRP3 炎癥小體激活，這可能與DEX緩解POCD學(xué)習(xí)、記憶能力有關(guān)。

綜上所述，DEX能夠保護(hù)POCD大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力，并抑制NLRP3 炎癥小體激活抑制海馬神經(jīng)元凋亡。關(guān)于DEX緩解POCD的劑量和DEX的使用方法仍需要深入研究，其調(diào)控NLRP3 炎癥小體激活的分子機(jī)制值得進(jìn)一步研究。