LncRNA SNHG14通過(guò)調(diào)控miR-372-3p對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡和炎性反應(yīng)的影響

王丹 成剛 廖英

缺血性腦卒中是由于腦部供血不足、供血?jiǎng)用}狹窄或閉塞引起的腦部組織壞死，具有較高的致殘率、發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅人類的生命健康安全[1,2]。星形膠質(zhì)細(xì)胞廣泛分布在大腦中，通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等方式對(duì)神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用，腦部缺血引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷能加劇神經(jīng)細(xì)胞的死亡[3]。所以，如何有效減緩星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷是預(yù)防缺血性腦卒中的重要研究方向。隨著研究的不斷深入，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)在缺血性腦卒中包括神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)疾病是近年醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，如MALAT1、MEG3、H19、CaMK2D等已被證實(shí)[4]。有研究結(jié)果顯示，SNHG14在OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上調(diào)，抑制SNHG14能降低OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的炎性反應(yīng)[5]，但是OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞研究相對(duì)較少。miRNA與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[6]，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-372-3p在OGD誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)下調(diào)，miR-372-3p靶向負(fù)調(diào)控TLR4減緩OGD誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和氧化損傷，并促進(jìn)細(xì)胞的增殖[7]。在線生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示SNHG14和miR-372-3p存在互補(bǔ)的核苷酸序列，本研究通過(guò)OGD/R損傷細(xì)胞模型，探討SNHG14通過(guò)調(diào)控miR-372-3p對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡和炎性反應(yīng)的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 剛出生24 h的5只SD級(jí)大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有公司，許可證號(hào)SCXY(滬)2017-0005。大鼠飼養(yǎng)在本實(shí)驗(yàn)內(nèi)，室溫20～24℃，相對(duì)濕度50%～60%，自由進(jìn)食和飲水，待適應(yīng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。DMEM/F12無(wú)糖培養(yǎng)基、胎牛血清、DMEM/F12高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；si-NC、si-SNHG14、miR-NC、miR-372-3p、anti-miR-NC、anti-miR-372-3p和引物購(gòu)自賽默飛世爾公司；Lipofectamine 2000試劑盒、TRIzol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PrimeScript RT試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；MTT試劑盒購(gòu)自上海晶抗生物；凋亡試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物；Bcl-2抗體、Bax抗體、GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自武漢博士德生物；TNF-α試劑盒、IL-10試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所；雙熒光素酶試劑盒購(gòu)自Promega公司。

1.2 細(xì)胞分離和培養(yǎng) 將SD大鼠斷頭處死后，在無(wú)菌條件下分離大鼠腦皮質(zhì)，剪碎后在2.5 g/L胰蛋白酶內(nèi)室溫消化30 min，并加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打過(guò)200目篩，1 000 r/min離心5 min，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml接種至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37℃、5%CO2條件培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3天更換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞融合生長(zhǎng)至80%時(shí)傳代培養(yǎng)。

1.3 建立模型和分組 取1.2培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，沖洗3次，更換為不含血清的DMEM/F12無(wú)糖培養(yǎng)基，然后在三氣培養(yǎng)箱(1% O2、5% CO2和94% N2)內(nèi)培養(yǎng)6 h，然后更換為DMEM/F12完全培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，模擬建立OGD/R細(xì)胞模型。將細(xì)胞分為Control組、OGD/R組、OGD/R+si-NC組、OGD/R+si-SNHG14組、OGD/R+miR-NC組、OGD/R+miR-372-3p組、OGD/R+si-SNHG14+anti-miR-NC組和OGD/R+si-SNHG14+anti-miR-372-3p組。其中Control組為進(jìn)行任何處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞，OGD/R組為進(jìn)行OGD/R處理；將按照脂質(zhì)體法將si-NC、si-SNHG14、miR-NC、miR-372-3p、si-SNHG14和anti-miR-NC、si-SNHG14和anti-miR-372-3p轉(zhuǎn)染至星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，然后進(jìn)行OGD/R處理，記為OGD/R+si-NC組、OGD/R+si-SNHG14組、OGD/R+miR-NC組、OGD/R+miR-372-3p組、OGD/R+si-SNHG14+anti-miR-NC組和OGD/R+si-SNHG14+anti-miR-372-3p組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)按照Lipofectamine 2000試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，細(xì)胞培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)SNHG14和miR-372-3p的表達(dá)量 取1.3各組星形膠質(zhì)細(xì)胞使用TRIzol試劑提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，并檢測(cè)純度和濃度，使用Prime Script RT試劑盒與2 μg的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后將1 μl的cDNA與SYBR-Green染料在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。分別以GAPDH和U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算SNHG14和miR-372-3p的表達(dá)量。SNHG14正向引物序列：5’-GGGTGTTTACGTAGACCAGAACC-3’，反向引物序列：5’-CTTCCAAAAGCCTTCTGCCTTAG-3’；miR-372-3p正向引物序列：5’-CGGAAAGTGCTGCGACATTT-3’，反向引物序列：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 取1.3各組星形膠質(zhì)細(xì)胞固定培養(yǎng)48 h后，每孔內(nèi)加入20 μl的MTT試劑，然后在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后繼續(xù)加入150 μl的二甲基亞砜試劑，充分混勻后，置于酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取1.3各組星形膠質(zhì)細(xì)胞采用PBS清洗細(xì)胞，加入500 μl的Binding buffer懸浮細(xì)胞，根據(jù)凋亡試劑盒說(shuō)明，加入5 μl的Annexin V-FITC以及PI試劑，避光反應(yīng)15 min后在流式細(xì)胞儀上觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Western blot檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá) 取1.3各組星形膠質(zhì)細(xì)胞加入RIPA裂解液，混勻后在冰上裂解10 min，按照BCA法檢測(cè)定量蛋白濃度，取50 μg蛋白樣品經(jīng)過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳處理，轉(zhuǎn)膜，封閉培養(yǎng)，加入Bcl-2(稀釋比例1∶500)、Bax(稀釋比例1∶500)和GAPDH(稀釋比例1∶1 500)抗體，4℃過(guò)夜孵育，計(jì)入HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比例1∶5 000)，室溫下孵育2 h，然后在PVDF膜上滴加化學(xué)發(fā)光液顯色、曝光，采用Image Pro軟件進(jìn)行分析。

1.8 ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-10表達(dá) 取1.3各組星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按照TNF-α試劑盒、IL-10試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)TNF-α、IL-10的表達(dá)。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建SNHG14的野生型和突變型熒光素酶載體(SNHG14-WT和SNHG14-MUT)，然后與miR-NC或miR-372-3p共轉(zhuǎn)染至星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染48 h后按照雙熒光素酶試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 SNHG14和miR-372-3p在OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá) 與Control組比較，OGD/R組內(nèi)SNHG14表達(dá)量明顯增加(P<0.05)，miR-372-3p表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 SNHG14和miR-372-3p在OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)

2.2 敲低SNHG14對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡和炎性反應(yīng)的影響 與Control組比較，OGD/R組內(nèi)SNHG14表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、TNF-α、IL-10明顯增加(P<0.05)，細(xì)胞活力、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與OGD/R+si-NC組比較，OGD/R+si-SNHG14組的內(nèi)SNHG14表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、TNF-α、IL-10明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞活力、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表2。

圖1 敲低SNHG14對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響；A 凋亡圖；B Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

表2 敲低SNHG14對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡和炎性反應(yīng)的影響

2.3 過(guò)表達(dá)miR-372-3p對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡和炎性反應(yīng)的影響 與Control組比較，OGD/R組內(nèi)miR-372-3p、細(xì)胞活力、Bcl-2表達(dá)明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率、Bax、TNF-α、IL-10明顯增加(P<0.05)；與OGD/R+miR-NC組比較，OGD/R+miR-372-3p組內(nèi)miR-372-3p、細(xì)胞活力、Bcl-2明顯增加(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率、Bax、TNF-α、IL-10明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖2。

圖2 過(guò)表達(dá)miR-372-3p對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響；A 凋亡圖；B Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

表3 過(guò)表達(dá)miR-372-3p對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡和炎性反應(yīng)的影響

2.4 SNHG14靶向miR-372-3p的表達(dá) 通過(guò)在線生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示SNHG14和miR-372-3p存在互補(bǔ)的核苷酸序列。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SNHG14和miR-372-3p的關(guān)系，采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證二者的關(guān)系，結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-372-3p組內(nèi)SNHG14-WT熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，SNHG14-MUT熒光素酶活性沒(méi)有任何變化。見(jiàn)圖3，表4。

圖3 SNHG14和miR-372-3p存在互補(bǔ)的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5 抑制miR-372-3p可以逆轉(zhuǎn)敲低SNHG14對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡和炎性反應(yīng)的影響 與OGD/R+si-SNHG14+anti-miR-NC組比較，OGD/R+si-SNHG14+anti-miR-372-3p組內(nèi)miR-372-3p表達(dá)量、細(xì)胞活力、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、TNF-α、IL-10明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)圖4，表5。

圖4 抑制miR-372-3p可以逆轉(zhuǎn)敲低SNHG14對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響；A 凋亡圖；B Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

表5 抑制miR-372-3p可以逆轉(zhuǎn)敲低SNHG14對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡和炎性反應(yīng)的影響

3 討論

SNHG14是由19.2 kb轉(zhuǎn)錄本組成的，位于15q11.2號(hào)染色體上，多數(shù)研究結(jié)果表明SNHG14通過(guò)參與細(xì)胞活力、凋亡、炎性反應(yīng)等對(duì)多種細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用[8,9]。有研究發(fā)現(xiàn)，在腦部缺血再灌注損傷研究中，SNHG14在OGD/R誘導(dǎo)的小鼠海馬細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，SNHG14通過(guò)調(diào)控miR-182-5p/BINP3軸促進(jìn)神經(jīng)元的損傷[10]。Zhang等[11]的研究結(jié)果顯示，SNHG14在腦缺血再灌注模型內(nèi)高表達(dá)，抑制SNHG14能夠減輕OGD誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激。Qi等[12]研究結(jié)果顯示，SNHG14在OGD誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，miR-145-5p是SNHG14靶基因，SNHG14通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控miR-145-5p減緩OGD誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎性損傷。本研究結(jié)果顯示，OGD/R處理星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠抑制細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡率，TNF-α、IL-10顯著增加，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，SNHG14表達(dá)量顯著增加，這說(shuō)明SNHG14可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷有關(guān)。本研究通過(guò)敲低SNHG14發(fā)現(xiàn)，敲低SNHG14能促進(jìn)OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力，抑制細(xì)胞凋亡率，TNF-α、IL-10顯著降低，Bax蛋白表達(dá)下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，這說(shuō)明敲低SNHG14能保護(hù)OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷。

miRNA在腦缺血再灌注損傷內(nèi)異常表達(dá)[13]，如miR-216a在腦缺血再灌注損傷小鼠模型內(nèi)低表達(dá)，miR-216a通過(guò)調(diào)控JAK2減緩OGD/R誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和炎性反應(yīng)，并促進(jìn)細(xì)胞的活力[14]。林斯革等[15]在研究腦缺血再灌注損傷中發(fā)現(xiàn)，miR-153通過(guò)調(diào)控Keap1/Nrf2/HO-1通路減緩小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激。閆海清等[16]研究結(jié)果顯示，miR-497-5p在OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，miR-497-5p通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控FOXO3減緩OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，以上均說(shuō)明miRNA與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)OGD/R處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后miR-372-3p表達(dá)量顯著降低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-372-3p能夠促進(jìn)OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力，抑制細(xì)胞凋亡率、TNF-α、IL-10顯著降低，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-372-3p減輕OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷。SNHG14能夠調(diào)控下游多個(gè)miRNA并發(fā)著作用，例如SNHG14通過(guò)調(diào)控miR-124-3p/MMP2軸減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激[17]。本研究采用starbase預(yù)測(cè)、并通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-372-3p是SNHG14的靶基因，深入一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-372-3p可以逆轉(zhuǎn)敲低SNHG14對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡和炎性反應(yīng)的影響，這說(shuō)明SNHG14通過(guò)靶向miR-372-3p的表達(dá)參與OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷。

綜上所述，敲低SNHG14能促進(jìn)OGD/R誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，減輕細(xì)胞的凋亡和炎性損傷，其作用機(jī)制可能與過(guò)表達(dá)miR-372-3p有關(guān)。