基因檢測(cè)微流控芯片的研究、應(yīng)用與發(fā)展

劉 宇， GIUSEPPINA SIMONE

(西北工業(yè)大學(xué)空天微納系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710072)

0 引 言

基因(DNA)是人類的遺傳密碼，從根源上控制著人的生老病死，人類基因組計(jì)劃的正式完成，極大地推動(dòng)了基因檢測(cè)等技術(shù)的發(fā)展，為人類了解生命本質(zhì)以及預(yù)防疾病提供了方法。但傳統(tǒng)的生化檢測(cè)、染色體分析、DNA分析等基因檢測(cè)技術(shù)往往具有操作難度高、成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、準(zhǔn)確度低及性價(jià)比低等缺點(diǎn)[1]。而微流控技術(shù)很好地解決了這些問(wèn)題。

微流控是一種全新微量分析技術(shù)，具備小劑量分析、快速、低成本、可集成等優(yōu)勢(shì)[2]。目前，微流控芯片的應(yīng)用已經(jīng)遍及生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域，相關(guān)技術(shù)、器件和工藝發(fā)展迅速[3]。本文重點(diǎn)對(duì)近幾年國(guó)內(nèi)外基因檢測(cè)微流控芯片的研究與應(yīng)用進(jìn)行了綜述，并對(duì)其未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

1 基因檢測(cè)與微流控檢測(cè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)

基因檢測(cè)通常包括提取、擴(kuò)增和檢測(cè)三個(gè)步驟，傳統(tǒng)的基因芯片的工作原理是核酸分子雜交。即制造一個(gè)靶基因cDNA片段按特定規(guī)律排布的支持物，然后將從體液、唾液等中提取的被檢測(cè)的DNA或RNA通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增，并摻入熒光標(biāo)記分子探針，然后，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理檢測(cè)熒光標(biāo)記，從而獲得被檢測(cè)基因的相關(guān)信息。

微流控芯片可以在很短的時(shí)間內(nèi)提取、擴(kuò)增和檢測(cè)DNA。將微流控芯片技術(shù)應(yīng)用于基因檢測(cè)領(lǐng)域具有以下優(yōu)勢(shì)：1)降低污染風(fēng)險(xiǎn)：人工操作DNA提取耗時(shí)長(zhǎng)且測(cè)試過(guò)程容易受到污染，而集成的微流控芯片可以自動(dòng)完成各項(xiàng)操作，減少樣本污染。2)高通量：微流控芯片可以設(shè)計(jì)多條微通道[4]，同一個(gè)微流控芯片可以對(duì)同一樣本同時(shí)進(jìn)行不同項(xiàng)目的檢測(cè)，縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。3)試劑消耗少、時(shí)間短：非常少的樣本和檢測(cè)試劑即可進(jìn)行高精度的測(cè)試，且由于微流控芯片的微型化提高了傳熱效率[5]，因此可以更短的反應(yīng)時(shí)間促進(jìn)DNA擴(kuò)增，并且由于短的擴(kuò)散距離，具有更高的響應(yīng)速度，縮短反應(yīng)時(shí)間。4)操作難度低：集成芯片中的各檢測(cè)步驟可以全自動(dòng)進(jìn)行，降低了傳統(tǒng)基因檢測(cè)的難度。5)成本低：與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室中笨重且昂貴的設(shè)備相比，大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)集成生產(chǎn)的微流體芯片大大降低了生產(chǎn)成本。

2 基因檢測(cè)微流控芯片的研究現(xiàn)狀

2.1 微流控芯片的制作材料

用于制作基因檢測(cè)微流控芯片的材料主要有單晶硅、石英和玻璃、高分子聚合材料，如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。單晶硅是最早適用芯片的基材，加工工藝及設(shè)備完善，但硅材料易碎、價(jià)格貴、絕緣性差、對(duì)PCR反應(yīng)有抑制作用[6]。石英和玻璃具有很好的抗腐蝕性，且廉價(jià)易得，但其加工工藝復(fù)雜，也逐漸被人們舍棄。PDMS是目前使用量最多的高分子聚合物材料，其兼具成本低廉、生產(chǎn)規(guī)模化等特點(diǎn)，并且具有很好的生物相容性和熱穩(wěn)定性，但其加工工藝較為復(fù)雜[7]。

除了傳統(tǒng)的制作材料外，紙張也是一種很好的制作微流控芯片的原材料，紙微流控芯片從提出至今雖然只有幾十年的發(fā)展歷程，但其成本低、制作簡(jiǎn)單、具有很好生物相容性[8]，逐漸受到人們的青睞。除此之外，基于紙張的微流控芯片無(wú)需外加驅(qū)動(dòng)裝置，可以利用自身的毛細(xì)力輸送流體。Trieu P T等人[9]研究了一種集成了DNA純化、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和現(xiàn)場(chǎng)比色檢測(cè)的紙質(zhì)微流控芯片，紙張先通過(guò)互補(bǔ)模具壓花雕刻理想的幾何形狀，然后用PDMS進(jìn)行疏水涂層。

2.2 微流控芯片的制作方法

基因檢測(cè)微流控芯片的制作方法與主流微流控芯片相同，不同的材料具有不同的制造工藝。硅、玻璃等材料微流控芯片上的微細(xì)結(jié)構(gòu)主要采用光刻和蝕刻技術(shù)進(jìn)行加工。高分子聚合材料芯片上的微細(xì)結(jié)構(gòu)一般采用模塑法、注塑法、熱壓法、軟光刻、激光燒蝕法等方法制造。近年來(lái)，3D打印和絲網(wǎng)印刷技術(shù)等新型加工技術(shù)開(kāi)始受到研究者的廣泛關(guān)注。

3D打印是一種可以在精確的控制下，逐層構(gòu)建3D物體的增材制造技術(shù)，其中可應(yīng)用于微流控器件制造的是：1)立體光刻;2)多射流建模;3)熔融沉積建模[10]。3D打印技術(shù)不但克服了傳統(tǒng)制造技術(shù)的障礙，而且實(shí)現(xiàn)了低成本、快速、一步三維制造[11]，具有廣泛的應(yīng)用前景。

2.3 微流控芯片的驅(qū)動(dòng)方式

2.3.1 微泵驅(qū)動(dòng)

微泵分為機(jī)械式和非機(jī)械式。機(jī)械式微泵主要通過(guò)固體或液體運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的壓差來(lái)驅(qū)動(dòng)流體，非機(jī)械式微泵主要通過(guò)能量傳遞來(lái)驅(qū)動(dòng)流體運(yùn)動(dòng)[12]。任芳玲等人[13]利用高密度雙錐納米孔(孔徑約為30 nm)的徑跡刻蝕薄膜制成了厚度約為12 μm的高性能低壓電滲泵芯片，并表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)的孫仕欣等人[14]基于三腔蠕動(dòng)微泵的液體回流問(wèn)題，開(kāi)發(fā)了一種五腔壓電蠕動(dòng)微泵。

2.3.2 磁珠驅(qū)動(dòng)

磁珠驅(qū)動(dòng)的原理是通過(guò)操控外加磁場(chǎng)來(lái)操控吸附核酸分子的磁珠，從而實(shí)現(xiàn)微流體的驅(qū)動(dòng)，其中磁場(chǎng)主要是通過(guò)永磁體、電磁體和軟磁體來(lái)產(chǎn)生[15]。鄭州大學(xué)的杭躍航等人[16]設(shè)計(jì)了一種用永磁體產(chǎn)生磁場(chǎng)的表面開(kāi)放的一體化液滴微流控芯片(圖1)，可實(shí)現(xiàn)核酸檢測(cè)的全過(guò)程。武漢大學(xué)的張作然等人[17]利用了微流控芯片上側(cè)向磁泳的方法，同時(shí)分選了乙型肝炎病毒DNA和丙型肝炎病毒反轉(zhuǎn)錄DNA。

圖1 永磁體微流控芯片結(jié)構(gòu)[16]

2.3.3 離心力驅(qū)動(dòng)

離心力驅(qū)動(dòng)的原理是利用一個(gè)電機(jī)來(lái)產(chǎn)生流體流動(dòng)所需要的力，相較于其他驅(qū)動(dòng)類型的微流控芯片，離心驅(qū)動(dòng)更多地應(yīng)用于樣品制備的步驟[18]。結(jié)合重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)，周新麗等人[19]開(kāi)發(fā)了一種集核酸擴(kuò)增與檢測(cè)一體的扇形微流控芯片，該扇形微流控芯片受離心力控制。由于該扇形微流控芯片具有多個(gè)微小腔室，能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本的多種指標(biāo)。

2.3.4 其他驅(qū)動(dòng)方式

Li X等人[20]開(kāi)發(fā)了一種利用拉伸力作為驅(qū)動(dòng)方式的核酸檢測(cè)微流控芯片，該芯片由3個(gè)經(jīng)不同方式處理的PDMS層制成(圖2(a))，樣品溶液通過(guò)毛細(xì)管作用進(jìn)入微流體通道，應(yīng)變閥在拉力的作用下打開(kāi)并產(chǎn)生負(fù)壓，樣品溶液和檢測(cè)溶液在彈簧泵流道混合并通過(guò)彈簧泵產(chǎn)生的動(dòng)力驅(qū)動(dòng)流體流入檢測(cè)室(圖2(b))，在核酸擴(kuò)增的過(guò)程中，會(huì)釋放氫離子導(dǎo)致溶液pH值下降，檢測(cè)液種的pH指示劑的顏色隨之變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的檢測(cè)。

圖2 拉伸式核酸檢測(cè)微流控芯片[20]

3 微流控芯片在基因檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 臨床醫(yī)學(xué)診斷

3.1.1 遺傳病篩查

單核苷酸多態(tài)性(SNP)的基因分型是分析許多遺傳病的基礎(chǔ)?；赟NP分型方法，Lu Y等人[21]提出構(gòu)建了一種多腔室微流控芯片，用于檢測(cè)遺傳性聽(tīng)力損失。樣品在多腔室獨(dú)立進(jìn)行等位基因特異性PCR，很好地解決了現(xiàn)有SNP檢測(cè)方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作繁瑣、殘留污染風(fēng)險(xiǎn)高的問(wèn)題。

3.1.2 癌癥診斷

外分泌體及其伴隨的蛋白質(zhì)和核酸被認(rèn)為是腫瘤診斷的生物標(biāo)志物，因此，對(duì)外分泌體的檢測(cè)成為了區(qū)分癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的重要手段[22]。Qian C等人[23]開(kāi)發(fā)了一種名為isExoCD的瓊脂糖微流控芯片，并將外分泌體濃縮和microRNA(miRNA)檢測(cè)集于一體，入口處加載的目標(biāo)外分泌體利用毛細(xì)管效應(yīng)和瓊脂糖凝膠的透水性自動(dòng)富集。Gao Y等人[24]提出了一種特異性miRNA定量檢測(cè)平臺(tái)，基于三段雜交同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品中的miRNA進(jìn)行多重檢測(cè)，用于乳腺癌的早期診斷。羅丹等人[25]開(kāi)發(fā)了一種對(duì)人血漿外泌體中miRNA—21測(cè)定的凝膠電泳微流控芯片，對(duì)推動(dòng)外泌體與腫瘤相關(guān)研究具有重要的價(jià)值。

3.2 病原體檢測(cè)

傳統(tǒng)用于細(xì)菌檢測(cè)方法的平板計(jì)數(shù)法由于耗時(shí)長(zhǎng)和靈敏度等問(wèn)題已經(jīng)無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的食品安全檢查要求[26]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)已成為一種非常有前景的快速靈敏檢測(cè)病原體的方式[27]。Teixeira A等人[28]將LAMP技術(shù)與表面增強(qiáng)拉曼散射相結(jié)合開(kāi)發(fā)了的微流控器件實(shí)現(xiàn)了對(duì)李斯特菌的檢測(cè)。Jin J等人[29]開(kāi)發(fā)了一種集成LAMP的雙樣本檢測(cè)微流控芯片，可同時(shí)完成兩個(gè)樣本的22次基因分析，顯著提高了檢測(cè)效率。Yin K等人[30]建立了一種SMCD(多路比色檢測(cè))方法用于檢測(cè)廢水中的嚴(yán)重急性呼吸綜合征狀病毒2型(SARS—Cov—2)，SMCD方法在3D打印的微流控芯片上集成了核酸提取，等溫?cái)U(kuò)增和比色檢測(cè)，通過(guò)智能手機(jī)分析記錄的實(shí)時(shí)比色信號(hào)便可檢測(cè)到廢水中的SARS—CoV—2病原體。

3.3 生物化學(xué)研究

基因檢測(cè)微流控芯片為體外基因改造分析提供了可能。Wang W等人[31]開(kāi)發(fā)了一種可以對(duì)一些化學(xué)試劑和輻射對(duì)DNA的損傷作用進(jìn)行評(píng)估的微流控芯片(圖3(a))，并對(duì)工程菌進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，對(duì)維護(hù)長(zhǎng)期暴露于太空環(huán)境的宇航員的安全和健康提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。考慮到微生物耐藥性的日益增強(qiáng)對(duì)全球公共衛(wèi)生的威脅，Rodriguez—Manzano J等人[32]開(kāi)發(fā)了基于LAMP的核酸檢測(cè)微流控芯片設(shè)備檢測(cè)活動(dòng)性粘菌素的耐藥性(圖3(b))。

圖3 用于生化分析微流控設(shè)備實(shí)物

4 關(guān)鍵問(wèn)題與未來(lái)發(fā)展

4.1 制造材料

制作微流體的理想材料需要具有光學(xué)透明性、機(jī)械強(qiáng)度高、熱穩(wěn)定性好、易于加工且適合大規(guī)模生產(chǎn)，但沒(méi)有一種材料能同時(shí)滿足所有這些要求。因此,可以將硅、玻璃、陶瓷、紙張和高分子材料協(xié)同使用構(gòu)造混合器件，發(fā)揮其各自的優(yōu)勢(shì)。

4.2 3D打印技術(shù)

3D打印作為一種新型快速成型技術(shù)，具有加工速度快、成本低等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于制造微流控芯片的各個(gè)領(lǐng)域。但3D打印低的分辨率以及有限的印刷材料限制了其應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)高分辨率微流控芯片的快速制造，需要發(fā)展基于表面投影和逐層光固化的高精度數(shù)字光處理(digital light processing,DLP)3D打印技術(shù)。相較于傳統(tǒng)制備方法，DLP 3D打印技術(shù)具有更快的速度、更高的通道精度和更好的安全性能。

4.3 驅(qū)動(dòng)方式

基因檢測(cè)微流控芯片在工作時(shí)通常需要加熱模塊對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增和外置驅(qū)動(dòng)裝置驅(qū)動(dòng)流體檢測(cè)，但是，對(duì)于一些缺乏資源的偏遠(yuǎn)地區(qū)，無(wú)法滿足床旁檢測(cè)檢測(cè)要求。為了實(shí)現(xiàn)這類地區(qū)的基因檢測(cè)，可以發(fā)展利用人體自身熱量驅(qū)動(dòng)核酸擴(kuò)增的技術(shù)，并在此基礎(chǔ)上，結(jié)合利用毛細(xì)作用驅(qū)動(dòng)的紙基微流控芯片，開(kāi)發(fā)利用人體熱量驅(qū)動(dòng)的可穿戴紙基基因檢測(cè)微流控芯片。

5 結(jié)束語(yǔ)

1)微流控芯片在基因檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用，極大提高了基因檢測(cè)的靈敏度和效率，但微流控芯片的制造材料、制造方法和驅(qū)動(dòng)方式仍是當(dāng)今研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

2)目前微流控芯片在基因檢測(cè)中的應(yīng)用包括臨床醫(yī)學(xué)診斷、病原體檢測(cè)、生物化學(xué)研究和藥物篩查。其中臨床醫(yī)學(xué)診斷的應(yīng)用主要集中在遺傳病篩查和癌癥診斷，微流控芯片的應(yīng)用很好地改善了傳統(tǒng)篩查診斷方式的耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低等不足。