基于PI3K/Akt 通路豨薟草抗腦缺血再灌注損傷作用機(jī)制研究

王文杰 徐煜彬 徐珊珊▲

1.浙江省臺(tái)州市中心醫(yī)院（臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院）神經(jīng)內(nèi)科，浙江臺(tái)州 318000；2.浙江省臺(tái)州市中心醫(yī)院（臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院）藥劑科，浙江臺(tái)州 318000

腦卒中具有發(fā)病率高、病死率高、致殘率高及復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，恢復(fù)缺血區(qū)域的腦灌注是腦卒中治療的核心問(wèn)題，而這也可能誘發(fā)進(jìn)一步的組織損傷和功能障礙，即腦缺血再灌注（IR）損傷。IR 損傷在腦卒中的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，因此，減少IR損傷是治療腦卒中的關(guān)鍵。

豨薟草出自《唐本草》，宜用于風(fēng)濕痹癥、痿證及中風(fēng)等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)豨薟草具有改善微循環(huán)、抗血栓等作用，臨床主要用于腦缺血、冠心病等治療。本文基于PI3K/Akt 通路研究豨薟草抗IR 的作用機(jī)制，為豨薟草后續(xù)開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠40 只，雌雄各20 只，平均體重（200±20）g，購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 藥物及試劑

豨薟草購(gòu)自臺(tái)州愛(ài)康大藥房；IL-1β、IL-6、NFκB 和TNF-α 試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司；兔抗大鼠PI3K、Akt 購(gòu)自美國(guó)CST 公司，RT-qPCR 試劑盒購(gòu)自南京Vazyme。

1.3 動(dòng)物分組及給藥

首先隨機(jī)將40 只大鼠分為假手術(shù)組、模型組和豨薟草水煎液低、中、高劑量組（分別相當(dāng)于生藥0.45、0.90、1.35 g/kg），每組各8 只。給藥組分別灌胃給予豨薟草0.45、0.90、1.35 g/kg，或相同劑量的生理鹽水（模型組和假手術(shù)組），連續(xù)灌胃給藥14 d 之后采用改良線栓法進(jìn)行造模，詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)。

1.4 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

參照Longa 等神經(jīng)功能缺損標(biāo)準(zhǔn)對(duì)IR 24 h 后的大鼠進(jìn)行評(píng)分。

1.5 病理檢測(cè)

IR 24 h 后，各組大鼠隨機(jī)抽取2 只處死于冰面上取出大腦組織，固定于4%多聚甲醛溶液并制備石蠟切片，采用蘇木素-伊紅染色，檢測(cè)其病理變化。

1.6 RT-PCR 和Western-blot 檢測(cè)

IR 24 h 后，隨機(jī)在各組抽取3 只大鼠，取出腦組織的缺血部分50 mg，采用Trizol 提取RNA，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用于qPCR 反應(yīng)。PCR 引物序列見(jiàn)表2。IR 24 h 后，取出腦組織的缺血部分50 mg，加入1 ml 的裂解液提取蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，孵育一抗，4℃過(guò)夜，洗膜后孵育二抗2 h 后顯影成像，詳見(jiàn)文獻(xiàn)。

表2 PCR 引物序列

1.7 ELISA 檢測(cè)

再灌注24 h 后，參照操作說(shuō)明采用ELISA 法檢測(cè)各組大鼠缺血腦組織中的IL-1β、IL-6、TNF-α 和NF-κB 含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

IR 24 h 后，神經(jīng)功能缺損評(píng)分如下：假手術(shù)組為（0.00±0.00）分，模型組為（2.75±0.46）分，顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）；0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨薟草組分別為（2.12±0.64）分及（1.50±0.53）分，與模型組相比顯著降低（P＜0.05 和P＜0.01），而0.45 g/kg 豨薟草組為（2.50±0.53）分，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 豨薟草水煎液對(duì)IR 模型大鼠腦組織病理變化的影響

HE 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組大鼠腦組織并無(wú)異常，模型組和0.45 g/kg 豨薟草組均可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；而0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨薟草組大鼠腦組織可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)封三圖3。

2.3 豨薟草對(duì)IR 模型大鼠腦組織PI3K 和Akt mRNA 表達(dá)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組PI3K 與Akt mRNA 表達(dá)顯著上升（均P＜0.01）；而0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨薟草組較模型組顯著降低（均P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 豨薟草水煎液對(duì)IR 模型大鼠腦組織PI3K 和Akt mRNA 表達(dá)的影響（）

2.4 豨薟草對(duì)IR 模型大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α 和NF-κB 含量的影響

結(jié)果顯示IL-1β、IL-6、TNF-α 和NF-κB 含量在模型組大鼠中較假手術(shù)組顯著升高（均P＜0.01）；給予0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨薟草水煎液含量顯著降低（均P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表4 豨薟草對(duì)IR 大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α 和NF-κB 含量的影響（ng/L，）

2.5 豨薟草對(duì)IR 模型大鼠腦組織PI3K 和Akt 蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，模型組PI3K 和Akt 蛋白表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高（均P＜0.01）；給予0.90 g/kg 和1.35 g/kg豨薟草后表達(dá)顯著降低（均P＜0.01）。見(jiàn)表5。

表5 豨薟草對(duì)IR 大鼠腦組織PI3K 和Akt 蛋白表達(dá)的影響（）

3 討論

缺血再灌注損傷是腦卒中的一個(gè)主要合并癥，研究顯示腦缺血由兩部分組成：低氧和血管反應(yīng)。其中一個(gè)重要的血管反應(yīng)即腦水腫，是腦缺血后導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，破壞血腦屏障進(jìn)而產(chǎn)生。在腦缺血后復(fù)雜的病理?yè)p傷機(jī)制中，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激是IR 損傷的主要原因，是目前神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)，抗氧化應(yīng)激、減輕炎癥損傷成為治療缺血性腦血管病的主要途徑之一。目前對(duì)于IR 損傷并無(wú)特效藥，通過(guò)神經(jīng)功能評(píng)估和病理檢測(cè)可表明0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨薟草水煎液對(duì)IR 損傷具有良好的保護(hù)作用，且古籍《品匯精要》“治中風(fēng)失音不語(yǔ)，口眼歪斜，時(shí)吐涎沫”及《本草蒙筌》“療暴中風(fēng)行邪，口眼喎斜者立效”均表明豨薟草對(duì)腦卒中具有良好的療效，但對(duì)豨薟草抗IR損傷研究較少。因此本文基于PI3K/Akt 信號(hào)通路探討其抗IR 損傷的作用機(jī)制。

PI3K/Akt 通路已被確定為調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和血管生成重要參與者的主要信號(hào)通路之一，可減少炎癥基因的誘導(dǎo)，在IR 損傷的炎癥反應(yīng)中起著重要的作用。近年來(lái)，針對(duì)PI3K/Akt 信號(hào)軸為靶點(diǎn)的藥物開(kāi)發(fā)也越來(lái)越受到關(guān)注，研究表明川芎嗪可通過(guò)PI3K/Akt 信號(hào)通路緩解IR 損傷；珠子參皂苷能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt 信號(hào)軸抑制線粒體介導(dǎo)的凋亡，防止腦缺血細(xì)胞凋亡；小檗堿可通過(guò)激活PI3K/Akt 信號(hào)通路減少炎癥從而降低IR 損傷，這些均表明PI3K/Akt 信號(hào)軸在腦缺血中的重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨薟草水煎液可顯著降低PI3K和Akt mRNA 的表達(dá)，同時(shí)顯著降低PI3K 和Akt 蛋白的表達(dá)，表明豨薟草水煎液可能是以PI3K/Akt 信號(hào)軸為靶點(diǎn)的抗IR 損傷候選藥物，這種作用可能是通過(guò)抗炎發(fā)揮作用的。

NF-κB 在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)中具有重要作用，也是參與炎癥反應(yīng)最重要的蛋白質(zhì)之一，其在IR 損傷的炎癥反應(yīng)中的作用已有報(bào)道。在本研究中觀察到IR損傷后NF-κB、TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量上升，但這些參與炎癥的因子在0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨薟草水煎液組均下調(diào)，表明豨薟草水煎液具有抗炎作用，能減輕IR 損傷所致炎癥反應(yīng)。另外，研究表明TNFα 在炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用，可通過(guò)刺激NF-κB的產(chǎn)生而加重卒中大鼠的IR 損傷，并可通過(guò)增加血管通透性，增加血腦屏障的損傷，引起腦水腫。本研究中，豨薟草水煎液的神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過(guò)下調(diào)NF-κB 和TNF-α 的含量發(fā)揮抗炎作用實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，豨薟草水煎液抗IR 損傷可能是通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt 信號(hào)通路抑制NF-κB、TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量得以實(shí)現(xiàn)的。本研究是在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行的，因此，今后有必要在臨床條件下評(píng)價(jià)豨薟草對(duì)腦卒中患者的療效。