黑果腺肋花楸花色苷微波輔助提取工藝優(yōu)化

韓東，李建穎，孫怡，邢麗穎

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

黑果腺肋花楸[Aronia melanocarpa（Michx.）Elliott]，又稱野櫻莓、不老莓，薔薇科腺肋花楸屬，落葉灌木，原產(chǎn)于北美地區(qū)，起初作為觀賞樹木，用于水果生產(chǎn)的黑果腺肋花楸培育時(shí)間距今100多年，目前在歐美地區(qū)廣泛種植。黑果腺肋花楸抗逆性強(qiáng)，適合多種環(huán)境種植。20世紀(jì)90年代遼寧干旱地區(qū)研究所將一個(gè)黑果腺肋花楸栽培種從朝鮮引種到我國東北地區(qū)[1]，從此開始了黑果腺肋花楸在我國的研究。目前的種植地區(qū)主要集中在我國的東部和中部地區(qū)。黑果腺肋花楸主要有藥用、食用、觀賞三大價(jià)值。黑果腺肋花楸富含花青素、原花青素、黃酮、綠原酸，膳食纖維等物質(zhì)[2-5]。研究發(fā)現(xiàn)，黑果腺肋花楸具有很好的抗氧化活性，在抗炎、抑菌、抑癌、調(diào)節(jié)血糖、護(hù)肝、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血壓[6-17]等方面具有一定作用。

黑果腺肋花楸果實(shí)中富含多酚類物質(zhì)，且多酚含量是目前已知果實(shí)中含量最高的，其中花色苷含量可占總酚的四分之一，花色苷是一類廣泛存在于植物中的天然活性物質(zhì)，是一種水溶性色素。黑果腺肋花楸花色苷主要由4種花色苷組成，包括矢車菊素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-木糖苷，其中矢車菊素-3-半乳糖苷占比最大為68.68%，其次是矢車菊素-3-阿拉伯糖苷占比為25.62%，另外2種糖苷分別占比5.28%和0.42%[18]。

目前對于黑果腺肋花楸花色苷常用的提取方法有溶劑浸提法、超聲波輔助提取法，例如唐璐[19]采用乙醇浸提法對黑果腺肋花楸花色苷進(jìn)行提取，經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化獲得最優(yōu)條件下黑果腺肋花楸花色苷提取量為6.43 mg/g。朱鳳妹等[20]在進(jìn)行黑果腺肋花楸花色苷提取工藝優(yōu)化時(shí)，采用了更高效的超聲輔助提取法。通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到的黑果腺肋花楸花色苷最佳提取工藝條件為乙醇溶液（含0.5%乙酸）濃度40%、提取溫度43℃、超聲時(shí)間23 min、液料比為89∶1（mL/g），此條件下，黑果腺肋花楸中花色苷提取得率為（0.79±0.01）g/100 g。也有研究采用高壓脈沖電場提取方法提取黑果腺肋花楸果實(shí)中的花色苷，在最優(yōu)條件下，此方法的花色苷提取量比溶劑浸提法提高36.70%，比超聲波輔助提取法提高9.87%[21]。微波輔助提取法是利用微波進(jìn)行物質(zhì)萃取的一種技術(shù)，相對于溶液浸提法、超聲輔助提取法，微波輔助提取法具有快速、高效、噪聲小、加熱均勻、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)。

本研究以黑果腺肋花楸作為原料，采用微波輔助萃取法進(jìn)行提取，運(yùn)用單因素和響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，旨在得到黑果腺肋花楸中花色苷提取的最佳工藝，為黑果腺肋花楸中花色苷的深入研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黑果腺肋花楸鮮果：天津市靜海區(qū)崇泰龍泉農(nóng)業(yè)基地，品種為富康源一號；無水乙醇：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；濃鹽酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水乙酸鈉：南京化學(xué)試劑有限公司；氯化鉀：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純；矢車菊素-3-葡萄糖苷：德國sigma公司。

1.2 儀器

Discover SPX全自動(dòng)微波萃取儀：美國CEM公司；CL5R型醫(yī)用離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-2600型紫外分光光度計(jì)：日本SHIMADZU公司；ST3100 pH計(jì)、AX224ZH型電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；VaCo-Ⅱ冷凍干燥機(jī)：德國ZIRBUS公司；YB-2500A多功能粉碎機(jī)：永康市速鋒工貿(mào)有限公司；SY-2-4電熱恒溫水浴鍋：天津市歐諾儀器儀表有限公司；HH-6恒溫水浴鍋：上海勝衛(wèi)電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將黑果腺肋花楸鮮果去梗、去葉，挑選飽滿、無蟲、無腐爛的果實(shí)洗凈后經(jīng)預(yù)凍處理，置于冷凍干燥機(jī)中凍干48 h，凍干后的樣品經(jīng)粉碎、過100目篩后，置于-4℃保存。

1.3.2 黑果腺肋花楸果粉花色苷的提取

精密稱取1.000 g預(yù)處理后的粉末，加入無水乙醇（含0.1%鹽酸）溶液后再放入微波反應(yīng)器中進(jìn)行提取，冷卻至室溫（25℃）后，在4 000 r/min下離心20 min，取上清液，即黑果腺肋花楸花色苷提取液。

1.3.3 黑果腺肋花楸果粉花色苷提取量的測定方法

采用pH示差法[22]測定花色苷提取量，以矢車菊素-3-葡萄糖苷為計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)。

提取液用乙醇定容后，分別用pH1.0鹽酸氯化鉀緩沖液和pH4.5鹽酸醋酸鈉緩沖液稀釋，混勻后，放入40℃水浴鍋中水浴40 min。以蒸餾水為對照組進(jìn)行同樣操作，水浴結(jié)束后，測定520 nm和700 nm處的吸光度，分別記為A520和A700。按下式計(jì)算提取液中花色苷提取量。

式中：ΔA=（A520-A700）pH1.0-（A520-A700）pH4.5；V為最后定容的體積，10 mL；F為稀釋倍數(shù)，20；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26 900 L/（mol·cm）；M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量，449.2 g/mol；L為比色皿的厚度，1 cm；W為黑果腺肋花楸樣品質(zhì)量，1.000 g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

本試驗(yàn)選取乙醇濃度、液料比、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)影響因素，進(jìn)行黑果腺肋花楸中花色苷微波輔助提取單因素試驗(yàn)。分別研究不同乙醇（含0.1%鹽酸）濃度（40%、50%、60%、70%、80%）、不同液料比[10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）]、不同提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）、不同提取時(shí)間（5、10、15、20、25 min）對黑果腺肋花楸花色苷提取量的影響，每個(gè)試驗(yàn)平行重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

將乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）設(shè)為自變量，以花色苷提取量（Y）為響應(yīng)值，建立四因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)。因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodologies

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 10.0.7軟件對響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，作圖采用Origin2018軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 乙醇濃度對黑果腺肋花楸花色苷提取效果分析

乙醇濃度單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇濃度對花色苷提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on anthocyanin content

由圖1可知，當(dāng)提取溶劑中乙醇濃度在40%～60%時(shí)，黑果腺肋花楸花色苷提取量隨著乙醇濃度的增大而升高；當(dāng)提取溶劑中乙醇濃度在60%～80%時(shí)，黑果腺肋花楸花色苷提取量逐漸降低。當(dāng)乙醇濃度較低時(shí)，黑果腺肋花楸果實(shí)中含有的易溶于水的物質(zhì)（例如糖類），可能影響了花色苷的溶出，造成了花色苷提取量低，當(dāng)乙醇濃度較高時(shí)，極性降低，不利于黑果腺肋花楸花色苷溶出，從而導(dǎo)致花色苷提取量降低。所以為了保證花色苷的提取效果并盡量節(jié)省資源，選擇乙醇濃度為50%、60%、70%進(jìn)行下一步的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2 液料比對黑果腺肋花楸花色苷提取效果分析

液料比單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當(dāng)液料比小于30∶1（mL/g）時(shí)，提取液中花色苷提取量隨著液料比的增加而升高；在液料比30∶1（mL/g）時(shí)，花色苷提取量達(dá)到最高；之后，隨著液料比的繼續(xù)增加，花色苷提取量有所下降。這可能是由于隨著提取劑用量的增加，花色苷分子間的作用力隨之減弱，花色苷的穩(wěn)定性降低，同時(shí)隨著提取劑用量的增加干擾性的雜質(zhì)也會增多，造成花色苷提取量降低。所以為了保證花色苷的提取效果并盡量節(jié)省資源，液料比選擇20∶1、30∶1、40∶1（mL/g）進(jìn)行下一步的優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 液料比對花色苷提取量的影響Fig.2 Effect of material to liquid ratio on anthocyanin conten

2.1.3 提取溫度對黑果腺肋花楸花色苷提取效果分析

提取溫度單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對花色苷提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on anthocyanin content

由圖3可知，當(dāng)提取溫度小于50℃時(shí)，黑果腺肋花楸花色苷提取量隨著提取溫度的升高逐漸升高，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，黑果腺肋花楸花色苷提取量達(dá)到最高。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，花色苷提取量開始下降，這是因?yàn)榛ㄉ盏哪蜔嵝暂^差，花色苷在低溫下較穩(wěn)定，當(dāng)在高溫環(huán)境下，花色苷會發(fā)生降解，從而導(dǎo)致提取量降低。所以，為了保證花色苷的提取效果并盡量節(jié)省資源，提取溫度選擇40、50、60℃進(jìn)行下一步的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.4 提取時(shí)間對黑果腺肋花楸花色苷提取效果分析

提取時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 提取時(shí)間對花色苷提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on anthocyanin content

由圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間小于10 min時(shí)，提取液中花色苷提取量隨著提取時(shí)間的延長而升高；當(dāng)提取時(shí)間大于10 min時(shí)，花色苷提取量隨著時(shí)間的延長而降低。這是因?yàn)樘崛r(shí)間的適當(dāng)延長，可以使黑果腺肋花楸花色苷更加充分地溶出，但是當(dāng)提取時(shí)間過長時(shí)，花色苷會被降解，從而導(dǎo)致花色苷提取量的下降。所以，為了保證花色苷的提取效果并盡量節(jié)省資源，提取時(shí)間選擇5、10、15 min進(jìn)行下一步的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

以A（乙醇濃度）、B（液料比）、C（提取溫度）、D（提取時(shí)間）為自變量，以黑果腺肋花楸花色苷提取量（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化分析，具體試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Continue table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology

采用Design Expert 10.0.7對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，所得關(guān)于黑果腺肋花楸花色苷提取量的多元回歸方程為Y=10.29-0.027A+0.016B-0.073C+0.098D+0.060AB-0.0025AC-0.020AD-0.015BC-0.22BD-0.16CD-0.29A2-0.22B2-0.35C2-0.34D2。

由表3可知，該模型的F值為59.68，模型的P＜0.0001，表示該模型具有極顯著性。該模型失擬項(xiàng)F值為4.23，失擬度（P=0.088 7＞0.05）不顯著，表示該模型能很好地預(yù)測結(jié)果，試驗(yàn)預(yù)測數(shù)據(jù)具有良好的可靠性。通過F值大小可以得出各因素對響應(yīng)值影響程度的大小為提取時(shí)間＞提取溫度＞乙醇濃度＞液料比。提取溫度與提取時(shí)間影響極顯著，乙醇濃度和料液比影響不顯著，交互項(xiàng)BD和CD影響極顯著，交互項(xiàng)AB影響顯著，其余交互項(xiàng)不顯著，平方項(xiàng)均為極顯著，與方差分析結(jié)果一致。

各因素之間的交互作用可以從等高線的形狀、密集程度和響應(yīng)曲面的陡峭程度來判斷。等高線密集、形狀呈扁平或橢圓形，響應(yīng)曲面比較陡峭表明試驗(yàn)因數(shù)的變化對響應(yīng)值影響較大，表明兩組因素間的交互作用較大。反之，等高線稀疏、形狀接近圓形，響應(yīng)曲面相對比較平緩表明兩組因素的交互作用較小[23-24]。各因素交互作用對花色苷提取量影響情況見圖5。

圖5 各因素間相互作用的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface diagram of interaction of various factors

由圖5可知，乙醇濃度和提取溫度、乙醇濃度和提取時(shí)間、液料比和提取溫度間的交互作用不顯著。乙醇濃度和液料比、液料比和提取溫度、液料比和提取時(shí)間間交互作用顯著。此結(jié)論與方差分析結(jié)果一致。

2.3 試驗(yàn)驗(yàn)證

由Design Expert 10.0.7軟件得到的微波輔助提取黑果腺肋花楸花色苷的最佳提取條件為乙醇濃度59.377%、液料比29.318∶1（mL/g）、提取溫度 48.506℃、提取時(shí)間10.994 min，在此條件下，理論上花色苷提取量為10.306 mg/g。為了方便具體試驗(yàn)操作，將最佳工藝調(diào)整為乙醇濃度59%、液料比29∶1（mL/g）、提取溫度48℃、提取時(shí)間為11 min，對黑果腺肋花楸中花色苷進(jìn)行提取，做3次平行試驗(yàn)，得到花色苷的提取量為10.298 mg/g。驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果與最佳提取條件下得到的理論值相近，說明結(jié)果可靠。該模型合理可行。

3 結(jié)論

黑果腺肋花楸營養(yǎng)豐富，具有極高的食用與藥用價(jià)值，但是黑果腺肋花楸在我國的起步較晚，隨著黑果腺肋花楸種植面積的擴(kuò)大，對其功效方面的研究逐漸深入，黑果腺肋花楸所蘊(yùn)藏的價(jià)值將會被更廣泛地應(yīng)用。

本文以酸化乙醇為提取劑，采用微波輔助法提取黑果腺肋花楸花色苷，通過單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)，各因素對黑果腺肋花楸花色苷提取量影響順序?yàn)樘崛r(shí)間＞提取溫度＞乙醇濃度＞液料比，得到的黑果腺肋花楸花色苷提取最佳工藝條件：提取劑為體積分?jǐn)?shù)為59%的乙醇、液料比為29∶1（mL/g）、提取溫度為48℃、提取時(shí)間為11 min。通過此方法提取黑果腺肋花楸花色苷提取量有明顯提高。