UPLC-QTOF-MS快速篩查與確證中藥中馬兜鈴酸類物質(zhì)

陳金鳳，李慧晨，黃巧，姚寧，何聿

(1. 福建工程學(xué)院生態(tài)環(huán)境與城市建設(shè)學(xué)院，福建 福州 350118； 2. 福州大學(xué)食品安全與生物分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350108)

0 引言

馬兜鈴酸類物質(zhì)主要存在于馬兜鈴屬植物和細(xì)辛屬植物中，集中分布在熱帶、亞熱帶[1-2]. 2013年已有報(bào)道，長(zhǎng)期接觸馬兜鈴酸的尿路上皮癌患者，在基因組上會(huì)出現(xiàn)特定的突變[3]. 2017年，研究證實(shí)了亞洲人群的肝癌和馬兜鈴酸及其衍生物導(dǎo)致的基因突變具有高度相關(guān)性，這種現(xiàn)象在中國(guó)的大陸和臺(tái)灣地區(qū)尤為顯著[4]. 另有研究表明，馬兜鈴酸能夠緊密結(jié)合在DNA上，導(dǎo)致細(xì)胞在復(fù)制的時(shí)候出錯(cuò)，只要微量就會(huì)誘發(fā)大量DNA突變，且無(wú)法修復(fù)，成為癌變的誘因[5-7]. 馬兜鈴酸作為一類持久性土壤污染物，被植物和土壤吸收后，會(huì)成為新一類環(huán)境和食品污染物，對(duì)人體和環(huán)境造成危害，因此對(duì)馬兜鈴酸類物質(zhì)的檢測(cè)監(jiān)控尤為迫切[8]. 馬兜鈴酸類物質(zhì)的分析檢測(cè)方法有近紅外光譜法[9]、紫外分光光度法[10]、免疫層析法[11]、高效薄層色譜法[12]、高效毛細(xì)管電泳法[13]、氣相色譜分析法[14]、傳感器法[15]、液質(zhì)聯(lián)用法[16-17]及雙光譜法[18-19]等，但其主要研究對(duì)象為馬兜鈴酸，未覆蓋其多種衍生物. 建立一種準(zhǔn)確、高效、可同時(shí)檢測(cè)多種馬兜鈴酸類物質(zhì)的檢測(cè)方法，對(duì)中草藥、制劑及食品的質(zhì)量和安全性控制具有重要意義.

超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography with quadrupole-time-of-flight mass spectrometry, UPLC-QTOF-MS)技術(shù)是近年來(lái)飛速發(fā)展的高精度質(zhì)譜分析方法，具有靈敏度高、準(zhǔn)確度好、高效快速、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，與其他鑒定方法相比，在分析基質(zhì)復(fù)雜的樣品方面顯示出巨大優(yōu)勢(shì). 本研究基于 UPLC-QTOF-MS 檢測(cè)技術(shù)，對(duì)常見(jiàn)的馬兜鈴酸類中草藥、魚(yú)腥草，以及相關(guān)中草藥制品(中成藥、眼藥水等)中的馬兜鈴酸類物質(zhì)進(jìn)行高通量篩查，并對(duì)在樣品中篩查到的6種馬兜鈴酸類物質(zhì)進(jìn)行定量分析，為馬兜鈴酸類物質(zhì)的快速篩查鑒定提供技術(shù)方法.

1 材料與方法

1.1 儀器

Acquity UPLC H-Class型液相色譜儀、Xevo G2-XS QTOF/MS型質(zhì)譜儀和UPLC BEH C18 色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)(美國(guó)Waters公司)； Milli-Q Advantage A10系統(tǒng)超純水機(jī)(德國(guó)Merck公司)； BSA124S型電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)； KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)； 350Y型高速多功能粉碎機(jī)(永康市鉑歐五金制品有限公司)； IKA RV10數(shù)顯型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司)； KDC-160HR型高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司).

1.2 試劑與材料

馬兜鈴酸A(aristolochic acid A, AA-A)、吲哚美辛購(gòu)自Mackin公司； 馬兜鈴酸B (aristolochic acid B, AA-B)、馬兜鈴酸C(aristolochic acid C, AA-C)、馬兜鈴酸D(aristolochic acid D, AA-D)、馬兜鈴內(nèi)酰胺(aristolactam I, AL-I)、馬兜鈴?fù)?aristolone, AE)均購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司； 乙腈和甲醇(質(zhì)譜級(jí))購(gòu)自德國(guó)Merck公司； 甲酸、氨水(色譜級(jí))購(gòu)自美國(guó)ACS公司； 氫氧化鈉(純度99.99%)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司； 亮氨酸腦啡肽購(gòu)自美國(guó)Waters公司； 乙酸銨(色譜級(jí))購(gòu)自Mackin公司； 其余試劑均為分析純.

75個(gè)樣品(其中：中草藥1～31號(hào)，中成藥32～55號(hào)，新鮮魚(yú)腥草56～60號(hào)，含魚(yú)腥草眼藥水61～75號(hào))通過(guò)網(wǎng)絡(luò)購(gòu)買(mǎi)、藥店購(gòu)買(mǎi)，以及香港浸會(huì)大學(xué)藥學(xué)院友情提供等多渠道獲得，樣品信息詳見(jiàn)附錄.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

對(duì)照品試液的配制：稱取一定質(zhì)量AA-A、AA-B、AA-C、AA-D、AL-I、AE 6種標(biāo)準(zhǔn)品，分別溶于甲醇，取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合均勻，得混合標(biāo)準(zhǔn)液，4 ℃避光冷藏保存； 內(nèi)標(biāo)溶液的配制：稱取吲哚美辛標(biāo)準(zhǔn)品，溶于甲醇，配成10 mg·L-1的內(nèi)標(biāo)溶液，4 ℃冷藏保存.

1.3.2樣品溶液的制備

1) 中草藥. 將中草藥置于通風(fēng)處晾干，用乙醇和丙酮清洗實(shí)驗(yàn)用刀，將中草藥切削粉碎后過(guò)250 μm孔徑的標(biāo)準(zhǔn)篩. 稱取0.3 g粉末置于50 mL離心管中，加入10 μL 10 mg·L-1內(nèi)標(biāo)溶液避光保存30 min，加入30 mL乙酸乙酯沒(méi)過(guò)樣品，避光浸泡30 min. 取出試管，超聲萃取60 min，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后保存于茄型瓶. 重復(fù)萃取1～2次，合并濾液. 旋蒸至干，用1 mL甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后保存于樣品瓶中，4 ℃避光保存待測(cè).

2) 中成藥. a) 膠囊類. 按照藥品說(shuō)明書(shū)取一日用量. 去掉膠囊外殼，將藥粉置于50 mL離心管中，后續(xù)按中草藥前處理方法進(jìn)行萃取. b) 顆粒沖劑類. 按照藥品說(shuō)明書(shū)取一日用量，打開(kāi)包裝放入50 mL離心管中，加入10 μL 10 mg·L-1內(nèi)標(biāo)溶液后避光保存30 min，加適量水溶解后，加入30 mL乙酸乙酯，后續(xù)按中草藥前處理方法進(jìn)行萃取. c) 液體藥劑類. 按照藥品說(shuō)明書(shū)取一日用量，將液體藥劑倒入250 mL分液漏斗中，加入10 μL 10 mg·L-1內(nèi)標(biāo)溶液避光保存30 min后，再加入30 mL乙酸乙酯； 振蕩萃取多次，取上層清液，旋蒸至干后，用1 mL甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后保存于樣品瓶中，4 ℃避光保存待測(cè).

3) 新鮮魚(yú)腥草. 去泥洗凈、自然風(fēng)干，稱取約6 g，切成小段置于50 mL離心管中，用玻璃棒碾碎后，加入10 μL 10 mg·L-1內(nèi)標(biāo)溶液，后續(xù)按中草藥前處理方法進(jìn)行萃取.

4) 含魚(yú)腥草眼藥水. 取5 mL眼藥水置于茄型瓶中，40 ℃水浴旋蒸至干，用250 μL甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后保存于樣品瓶中，4 ℃避光保存待測(cè).

1.3.3色譜方法

ACQUITY UPLC-BEH C18 色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm). 流動(dòng)相A為水(含 10 mmol·L-1乙酸銨)，流動(dòng)相B為甲醇，柱溫為40 ℃，流速為0.2 mL·min-1，進(jìn)樣量為3 μL.

梯度洗脫程序：0～0.25 min，80%(體積分?jǐn)?shù)，以下同)A； 0.25～6.25 min，80% A→1% A； 6.25～12.50 min，1% A； 12.50～12.51 min，1% A→80% A； 12.51～13.50 min，80% A.

1.3.4質(zhì)譜方法

選擇電噴霧離子源，采用正離子掃描模式； 毛細(xì)管電壓為1 kV，錐孔電壓為20 V，離子源溫度為120 ℃，去溶劑溫度為550 ℃，去溶劑氮?dú)饬魉贋? 000 L·h-1，錐孔氮?dú)饬魉贋?0 L·h-1； 掃描時(shí)間為0.250 s，采集相對(duì)分子質(zhì)量范圍為50～1 200，低能量碰撞電壓為 4 V，高能量碰撞電壓梯度為10～45 V.

1.3.5定性篩查、定量方法

對(duì)處理好的待篩查樣品采用MSE模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，借助UNIFI軟件中的天然產(chǎn)物信息庫(kù)，對(duì)分子量、分子離子峰、質(zhì)荷比、碎片離子信息等信息進(jìn)行對(duì)比、篩查，最后以標(biāo)準(zhǔn)品的色譜保留時(shí)間tR、母離子和子離子信息進(jìn)行確證. 以同樣的方法對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析，通過(guò)UNIFI對(duì)定性篩查出的陽(yáng)性藥物選擇母離子進(jìn)行定量分析.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 方法優(yōu)化

分別考察甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、乙腈、異丙醇、正己烷、石油醚、丙酮等溶劑對(duì)馬兜鈴酸類物質(zhì)的提取效率，經(jīng)對(duì)比選擇乙酸乙酯作為最優(yōu)萃取溶劑. 為減少溶劑效應(yīng)，選擇甲醇作為復(fù)溶試劑.

2.2 馬兜鈴酸類物質(zhì)的篩查與確證

MS同時(shí)采用兩種模式采集單次UPLC的進(jìn)樣數(shù)據(jù)，一種是低碰撞能采集全掃M(jìn)S母離子信息，另一種是高碰撞能采集其相應(yīng)的MS/MS碎片離子信息. 借助UNIFI軟件，將低碰撞能MS全掃描得到的組分列表與數(shù)據(jù)庫(kù)中的母離子信息進(jìn)行匹配，同時(shí)通過(guò)匹配數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知關(guān)鍵診斷碎片離子或匹配MassFragmentTM在高碰撞能MSE全掃描中生成的預(yù)測(cè)碎片離子來(lái)確證碎片離子. 列出與天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)匹配的所有化合物(離子計(jì)數(shù)高于5 000)，選擇“良好匹配”模板，即所列出的結(jié)果必須有匹配的母離子(相對(duì)分子質(zhì)量誤差<2×10-3)，且至少有一種診斷碎片離子. 在上述模板下，75個(gè)樣品中共篩查出6種馬兜鈴酸類物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)圖如圖1，對(duì)應(yīng)的匹配標(biāo)準(zhǔn)信息見(jiàn)表1. 馬兜鈴酸類混合標(biāo)準(zhǔn)品與23號(hào)樣品馬鞍山青木香的總離子流圖(total ion chromatogram, TIC)見(jiàn)圖2及圖3，圖4表示馬鞍山青木香中提取的6種馬兜鈴酸類成分的基峰離子色譜圖(base peak chromatogram, BPC).

圖1 6種馬兜鈴酸類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of the six aristolochia substances

表1 馬兜鈴酸類物質(zhì)的篩查結(jié)果

圖2 馬兜鈴酸類混合標(biāo)準(zhǔn)品的TIC圖Fig.2 TIC of the mixed aristolochia substances

圖3 馬鞍山青木香樣品的TIC圖Fig.3 TIC of the radix aristolochiae from Ma’anshan

圖4 馬鞍山青木香樣品中提取AA-A, AA-B, AA-C, AA-D, AL-I和AE的BPC圖Fig.4 BPC of AA-A, AA-B, AA-C, AA-D, AL-I and AE extracted from the radix aristolochiae from Ma’anshan

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍與檢測(cè)限

在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式下對(duì)高精度二級(jí)碎片進(jìn)行定量分析，選擇性更強(qiáng). 使用優(yōu)化后的質(zhì)譜條件，以10 mg·L-1吲哚美辛溶液作為內(nèi)標(biāo)物，按照表1確定的碎片離子及對(duì)應(yīng)的質(zhì)荷比進(jìn)行工作曲線的繪制，確定方法的檢測(cè)限及線性范圍，如表2所示.

表2 6種馬兜鈴酸類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2回收率與精密度

選取含馬兜鈴酸類物質(zhì)種類較少、含量最低的27號(hào)樣品南木魚(yú)作為回收率實(shí)驗(yàn)的樣品，分別添加低、中、高3個(gè)濃度水平的馬兜鈴酸類標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品經(jīng)前處理后測(cè)試，得到各馬兜鈴酸類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)添加平均回收率與精密度，6種馬兜鈴酸類物質(zhì)各濃度的回收率在86.27%～106.89%之間，回收率良好且可信度高.

2.4 樣品檢出結(jié)果與分析

馬兜鈴酸類中草藥中馬兜鈴酸類物質(zhì)的檢出結(jié)果如圖5所示.

圖5 中草藥中馬兜鈴酸類物質(zhì)的檢出結(jié)果Fig.5 Detection results of the aristolochia substances in Chinese herbal medicines

由圖5可知，31種中草藥均有AE 檢出，28 種中草藥檢出 AA-A，24 種中草藥檢出 AA-B，9 種中草藥檢出 AA-C，14 種中草藥檢出 AA-D 及 AL-I. 在2號(hào)純野生木防己、4號(hào)野生廣西馬兜鈴、8號(hào)定心草、11號(hào)朱砂蓮、12號(hào)野生青木香、13號(hào)野生馬兜鈴、18號(hào)青木香、23號(hào)馬鞍山青木香和30號(hào)野生北馬兜鈴中，6 種馬兜鈴酸類物質(zhì)均檢出，其中23號(hào)馬鞍山青木香中 6 種馬兜鈴酸類物質(zhì)的含量最高，AA-A的檢出質(zhì)量濃度達(dá)到 289.21 mg·L-1； 17號(hào)尋骨風(fēng)和26號(hào)天仙藤中 AA-A、AE 的含量也較高. 各類物質(zhì)的檢出質(zhì)量濃度范圍如下：AA-A在0.06～289.21 mg·L-1，AA-B在0.21～17.60 mg·L-1，AA-C在0.34～37.17 mg·L-1，AA-D在0.22～11.28 mg·L-1，AL-I在0.06～2.42 mg·L-1，AE在0.11～14.08 mg·L-1. 檢出率在29.0%～100%范圍內(nèi)，排序?yàn)椋篈E> AA-A> AA-B> AA-D= AL-I> AA-C.

含馬兜鈴酸類的中成藥中馬兜鈴酸類物質(zhì)的篩查定量結(jié)果如圖6所示. 從圖中可知：9種中成藥檢出AA-A，3種中成藥檢出 AA-B，1種中成藥檢出AA-C，7種中成藥檢出AA-D，15種中成藥檢出AL-I及AE. 常用藥中，32號(hào)、36號(hào)、44號(hào)、49號(hào)、51號(hào)和52號(hào)樣品的馬兜鈴酸類物質(zhì)檢出較高. 各類物質(zhì)的檢出質(zhì)量濃度范圍如下：AA-A在0.06～11.88 mg·L-1，AA-B在0.05～5.00 mg·L-1，AA-C在 0.66 mg·L-1，AA-D在0.21～0.37 mg·L-1，AL-I在0.06～20.94 mg·L-1，AE在0.05～1.27 mg·L-1. 檢出率在4.2%～37.5%范圍內(nèi)，排序?yàn)椋篈L-I= AE> AA-A> AA-D> AA-B> AA-C.

圖6 中成藥中馬兜鈴酸類物質(zhì)篩查的結(jié)果Fig.6 Detection results of the aristolochia substances in Chinese patent medicines

由于魚(yú)腥草濕重較大，提取效率低，故檢出值較低. 篩查結(jié)果表明5 種魚(yú)腥草均有 AE 檢出，在57號(hào)四川魚(yú)腥草中檢出AA-A和AL-I，58號(hào)貴州魚(yú)腥草中檢出AA-A、AA-B，60號(hào)福建魚(yú)腥草中檢出AA-A. 可見(jiàn)，不同產(chǎn)地的魚(yú)腥草，馬兜鈴酸類物質(zhì)的含量有所不同.

含魚(yú)腥草眼藥水中也檢出馬兜鈴酸類物質(zhì)，但含量較低. 15 種眼藥水中，7 種眼藥水(樣品編號(hào)為62、65、66、68、69、72、73)有 AL-I 檢出(檢出率為46.7%)，6 種眼藥水(樣品編號(hào)為62、66、69、70、73、75)有 AE 檢出(檢出率為40.0%)，其中樣品編號(hào)62、66、69、73的眼藥水樣品中同時(shí)檢出AL-I和AE.

3 結(jié)語(yǔ)

研究采用UPLC與高分辨MS聯(lián)用，結(jié)合UNIFI的天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)，建立一種準(zhǔn)確、快速、高通量的篩查方法，用于檢測(cè)中草藥、中成藥等相關(guān)制品中的馬兜鈴酸類物質(zhì). 通過(guò)對(duì)4種類型共75 個(gè)樣品的篩查分析，發(fā)現(xiàn)31 種中草藥中均有馬兜鈴酸類物質(zhì)檢出，其中馬鞍山青木香中的馬兜鈴酸類物質(zhì)含量最高，廣東白金古欖中的含量最低； 23 種中成藥中均有檢出馬兜鈴酸類物質(zhì)，部分藥品中馬兜鈴酸類物質(zhì)含量偏高； 5 種新鮮魚(yú)腥草中均檢出馬兜鈴酸類物質(zhì)，且在不同產(chǎn)地魚(yú)腥草中的含量差別較大； 部分含魚(yú)腥草眼藥水中可檢出AL-I和AE. 本方法具有良好的回收率和精密度，能夠應(yīng)用于實(shí)際樣品的快速篩查和鑒定，為馬兜鈴酸類物質(zhì)的快速識(shí)別提供高效、可靠的檢測(cè)方法.