地衣芽孢桿菌發(fā)酵降解脫鉻皮屑的條件優(yōu)化研究

盧欣雨，張曉偉，張佳興，趙勝宗，劉彥＊

（1.四川大學(xué)生物質(zhì)與皮革工程系，四川成都 610065；2.四川大學(xué)制革清潔技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065）

引言

我國(guó)是世界上最大的制革加工國(guó)，每年產(chǎn)生的制革固體廢棄物約30 萬(wàn)噸[1]。由于處理和再利用方法的局限性，這些廢棄物給環(huán)保帶來(lái)了一定的壓力。制革廢棄物中的主要成分是重金屬鉻和膠原蛋白，如果對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，每年至少? 萬(wàn)噸膠原蛋白可以得到利用。目前，降解制革廢棄物的主要方式有酸法、堿法[2]和酶法[3]、以及微生物法[4]?；瘜W(xué)法是用制革廢棄物制備有機(jī)肥料的主要方式[5-15]，但化學(xué)法不僅對(duì)化學(xué)試劑的消耗量大，還會(huì)引入大量的鹽分雜質(zhì)，同時(shí)產(chǎn)生的氨基酸、多肽基本無(wú)生物活性。而酶法得到的基本上是多肽，產(chǎn)物單一。與化學(xué)法和酶法相比，生物發(fā)酵法才是農(nóng)業(yè)中制備有機(jī)肥料的主要方式。生物發(fā)酵制肥的條件溫和，蛋白質(zhì)經(jīng)微生物發(fā)酵后可產(chǎn)生速效性的氨基酸、小分子肽、緩釋性的多肽等產(chǎn)物，營(yíng)養(yǎng)全面，且產(chǎn)物皆有生物活性，更容易為植物所吸收利用。農(nóng)業(yè)使用的生物有機(jī)肥是以畜禽糞便、農(nóng)作物秸稈、生活垃圾等有機(jī)廢棄物為基質(zhì)，經(jīng)過(guò)無(wú)害化、腐熟處理而制成的一類(lèi)兼具有機(jī)肥和微生物功效的肥料[16]，已經(jīng)被廣泛證明具有能夠減少或代替部分化肥、農(nóng)藥的使用，增強(qiáng)作物抗逆性，改善作物品質(zhì)，改良土壤等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)兼具促進(jìn)作物生長(zhǎng)和防控土傳病害功能[17]。因此，用微生物發(fā)酵降解制革廢棄物來(lái)制備生物有機(jī)肥料比化學(xué)法和酶法更具有前景。

由于高含量的鉻不利于微生物的繁殖生長(zhǎng)，本研究擬采用脫鉻皮屑進(jìn)行發(fā)酵降解。脫鉻皮屑的主要成分為膠原蛋白，微生物對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵降解后，會(huì)產(chǎn)生不同種類(lèi)的游離氨基酸以及分子大小不一的多肽類(lèi)物質(zhì)，這些物質(zhì)對(duì)植物的生長(zhǎng)有促進(jìn)和調(diào)節(jié)作用，因此，脫鉻皮屑的發(fā)酵產(chǎn)物可以作為氨基酸肥使用，對(duì)植物發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)、促生的功效。本文將對(duì)地衣芽孢桿菌發(fā)酵脫鉻皮屑的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到進(jìn)一步提高脫鉻皮屑水解率，增加發(fā)酵液中游離氨基酸含量的目的。將以發(fā)酵液中的游離氨基酸種類(lèi)及含量評(píng)估發(fā)酵效果，并對(duì)其重金屬含量進(jìn)行測(cè)定，以評(píng)估脫鉻皮屑發(fā)酵液作為生物有機(jī)緩釋肥的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要材料與儀器

P-4 菌：取1 mL 自然降解的廢皮液，用無(wú)菌水稀釋后在明膠培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線(xiàn)分離，在37 ℃下培養(yǎng)48 h。挑選出培養(yǎng)基上具有明顯透明圈的單菌落，將其于液體種子培養(yǎng)基中活化12 h，取種子液在固體種子培養(yǎng)基上劃線(xiàn)并培養(yǎng)24 h。將獲取的單菌落通過(guò)點(diǎn)種接種到明膠培養(yǎng)基上，培養(yǎng)36 h，得到初篩菌株。將初篩菌株于液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后，以1%接種量接種到添加了一定量脫鉻皮屑的發(fā)酵培養(yǎng)基中（比例為1 g 的脫鉻皮屑加20 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基），培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液中游離氨基含量最高的那組即為本實(shí)驗(yàn)所需的菌株，經(jīng)16SrDNA 法鑒定可基本確定為地衣芽孢桿菌。

脫鉻皮屑：本實(shí)驗(yàn)室自制[18]。將藍(lán)濕皮碎塊用打磨機(jī)粉碎成屑，以一定量的鉻革屑為基重，加入10%的9 g/L 氧化鈣和2000%的水，在25 ℃、120 r/min 的水浴振蕩下，反應(yīng)12 h 后抽濾。取濾屑，加入0.9 mol/L 的鹽酸（固液比1∶20）處理35 min 后，離心去溶液后固體水洗數(shù)次，然后干燥至恒重?；曳趾繛?.26%，總鉻含量為0.819 mg/g，pH 值為7.0。

材料：試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；牛肉膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；SDS-PAGE 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（相對(duì)分子質(zhì)量范圍14～66 kDa），合肥博美生物。

儀器：SHA-B 雙功能水浴恒溫振蕩器，常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)；HSP-80B 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海坤天實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SQP 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；UV-1100 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；PHS-3C 精密酸度計(jì)，上海儀分科學(xué)儀器有限公司；ICP-OES 等離子發(fā)射光譜儀，美國(guó)Perkin Elmer；DYY-2C 垂直板型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；HG-AFS 氫化物發(fā)生原子熒光光譜儀，北京科創(chuàng)海光儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法

1.2.1 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，水1000 mL。

明膠培養(yǎng)基：明膠25 g，磷酸二氫鉀2 g，氯化鈉5 g，七水硫酸鎂0.2 g，瓊脂20 g，水1000 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉2.5 g，葡萄糖5 g，磷酸氫二鉀14 g，磷酸二氫鉀6 g，氯化鈉5 g，七水硫酸鎂0.2 g，檸檬酸鈉1 g，硫酸銨2 g，瓊脂20 g，水1000 mL。

培養(yǎng)基的pH 均用氫氧化鈉調(diào)到8.0。

1.2.2 發(fā)酵條件研究

挑取在平板劃線(xiàn)中生長(zhǎng)良好的P-4 菌單菌落，接種到已滅菌的液體種子培養(yǎng)基（20 mL）中，置于37 ℃、120 r/min 的恒溫振蕩水浴器中培養(yǎng)。

1.2.2.1 接種菌齡[19]

每隔4 個(gè)小時(shí)取一次樣，以蒸餾水作空白，在600 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定OD 值，至數(shù)值基本不變后停止取樣，以O(shè)D 值和培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為坐標(biāo)軸繪制P-4 菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖。

1.2.2.2 固液比

培養(yǎng)24 h，取種子液備用。稱(chēng)取一定量的脫鉻皮屑，與發(fā)酵培養(yǎng)基按照1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25 的比例進(jìn)行混合，即1 g 的脫鉻皮屑分別加5、10、15、20 和25 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基，下同?；靹蚝笳{(diào)pH 值至8.0，置于121 ℃的滅菌鍋中滅菌20 min。冷卻后以1%的接種量接入種子液，置于37℃、120 r/min 的恒溫振蕩水浴器中培養(yǎng)24 h 后測(cè)定游離氨基的含量。

1.2.2.3 接種量、最適溫度、最適pH

培養(yǎng)24 h，取種子液備用。脫鉻皮屑與發(fā)酵培養(yǎng)基按照1∶15 的比例進(jìn)行混合（同1.2.2.2），混勻后調(diào)節(jié)pH 值至8.0（7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0），置于121℃的滅菌鍋中滅菌20 min。冷卻后以0.5%(0.5%、1%、2%、3%、4%)的接種量接入種子液，置于恒溫振蕩水浴器中，在37 ℃(27、32、37、42、47 ℃)、120 r/min 下培養(yǎng)，每6 個(gè)小時(shí)取一次樣，并測(cè)定相應(yīng)時(shí)間下游離氨基的含量。

1.2.2.4 發(fā)酵時(shí)間

調(diào)pH 值為9.0，其余步驟同1.2.2.3。

1.2.3 發(fā)酵液中游離氨基的測(cè)定[20-21]

茚三酮溶液：稱(chēng)取0.5 g 茚三酮，用無(wú)水乙醇溶解并定容于100 mL 棕色容量瓶中；乙酸-乙酸鈉緩沖液：稱(chēng)取120.0 g 乙酸鈉，加入4.0 mL 無(wú)水乙酸，加水定容于1000 mL 容量瓶中；碘酸鉀溶液：稱(chēng)取0.3 g 碘酸鉀，加入90 mL 蒸餾水溶解后加60 mL無(wú)水乙醇；標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取0.1 g 甘氨酸，加水定容于100 mL 棕色容量瓶中，再分別取0、1、2、3、4、5 mL 該甘氨酸溶液于100 mL 容量瓶中定容。

準(zhǔn)確吸取1 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于6 支比色管中，依次加入1 mL 緩沖液和茚三酮溶液，封好搖勻后于沸水浴中加熱15 min，取出放到冷水中冷卻15 min。再分別加入5 mL 碘酸鉀溶液，用蒸餾水定容至10 mL。將波長(zhǎng)調(diào)至568 nm，用空白樣調(diào)零，再依次測(cè)出其余樣品的吸光度。以游離氨基含量和吸光度為坐標(biāo)軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到線(xiàn)性回歸方程。將標(biāo)準(zhǔn)溶液換成稀釋后的發(fā)酵液，其吸光度的測(cè)定同上。根據(jù)上述線(xiàn)性回歸方程得到游離氨基的含量。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物主要成分分析

脫鉻皮屑在其最優(yōu)條件下發(fā)酵后，對(duì)發(fā)酵液的主要成分進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4.1 重金屬含量

按照DB33/T 647—2007 中硝酸-高氯酸濕法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行消解，用ICP-OES 法測(cè)定樣品中鎘、鉻、鉛的含量；按照NY/T 1978-2010 中原子熒光光譜法檢測(cè)樣品中汞、砷的含量[22]。

1.2.4.2 游離氨基酸種類(lèi)及含量

于帶有過(guò)濾膜的小離心管中放入400 μL 發(fā)酵液，100 μL 10%磺基水楊酸，混勻，置于冰箱中在2～8 ℃下靜置冷藏60 min。然后將其置于離心機(jī)中以5000 r/min 離心15 min，接著取上層清液再次以5000 r/min 離心5 min。離心結(jié)束后，取上清液，根據(jù)發(fā)酵液中游離氨基酸的大概濃度，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行稀釋?zhuān)沟闷溆坞x氨基酸濃度在50～250 nmol/mL 之間。樣品稀釋后，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，在A300 全自動(dòng)氨基酸分析儀上進(jìn)行氨基酸分析。

1.2.4.3 多肽含量[23]

采用雙縮脲法測(cè)定。取6 支試管，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mL 的5 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，用水補(bǔ)足到1 mL。再加入4 mL 的雙縮脲試劑，充分搖勻后于25 ℃下靜置30 min。在540 nm 的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以牛血清蛋白含量和吸光度為坐標(biāo)軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到線(xiàn)性回歸方程。

取2 mL 發(fā)酵液，加入2 mL 15%三氯乙酸，混勻后靜置10 min，以5000 r/min 離心10 min。取1 mL經(jīng)適度稀釋的上清液，余下步驟同上。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中的線(xiàn)性關(guān)系，將發(fā)酵液的吸光度換算為相應(yīng)的多肽含量。

1.2.4.4 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的分布

開(kāi)始發(fā)酵后每12 h 取一次樣，采用SDS-PAGE凝膠電泳法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)下蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的分布。制膠配方如表1 所示，制膠完成后，用微量注射器分別取適量Marker 和處理好的樣品注入進(jìn)樣槽中。接通電源，設(shè)置電壓為80 V，待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，調(diào)節(jié)電壓至150 V。待溴酚藍(lán)色染料距離凝膠邊緣約1～2 cm 時(shí)，結(jié)束電泳。關(guān)掉電源，取出膠片，膠片經(jīng)染色、脫色后得到清晰的蛋白質(zhì)條帶。

表1 SDS-PAGE 法制膠配方Tab. 1 Gel formula of SDS-PAGE

2 結(jié)果與討論

在發(fā)酵降解的過(guò)程中，發(fā)酵條件是影響微生物發(fā)酵生產(chǎn)水平的重要因素，主要為菌齡、接種量、溫度、pH 和時(shí)間等，這些條件的改變都會(huì)直接影響發(fā)酵的結(jié)果[24]。溫度和pH 值是影響菌株生長(zhǎng)和代謝體系酶活最主要的因素，每一種菌都有自己最適宜的溫度和pH，一旦偏離了其最適值，均可能造成發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的急劇降低和發(fā)酵的失敗。發(fā)酵時(shí)間是獲取產(chǎn)物種類(lèi)和數(shù)量的重要指標(biāo)，尤其是產(chǎn)物為中間代謝產(chǎn)物的，控制不當(dāng)就有可能造成其被微生物利用掉的后果，最終造成發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率低下。因此，根據(jù)發(fā)酵最終產(chǎn)物的不同對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行研究和優(yōu)化是提高其產(chǎn)量的有效方式之一。

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 接種菌齡

由圖1 可知，OD 值在0～4 h 增長(zhǎng)緩慢，P-4 菌處于延滯期；4～24 h 期間OD 值呈近直線(xiàn)型增長(zhǎng)，P-4 菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；24 h 后P-4 菌開(kāi)始步入穩(wěn)定期。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期的菌株生長(zhǎng)和代謝能力旺盛，菌株數(shù)量基本達(dá)到了最高，因此選取24 h 作為P-4 菌的接種菌齡。

圖1 P-4 菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig. 1 Growth curve of strain P-4

2.1.2 固液比

圖2 數(shù)據(jù)顯示，發(fā)酵液中游離氨基含量隨著固液比的增大而明顯增加，在1∶15 時(shí)達(dá)到最高，當(dāng)繼續(xù)增大后含量趨于平緩。這是因?yàn)楣桃罕忍r(shí)，發(fā)酵液中有機(jī)營(yíng)養(yǎng)濃度過(guò)高，發(fā)酵液黏度過(guò)大而溶氧不足，抑制了微生物的生長(zhǎng)和代謝。同時(shí)，固液比過(guò)大對(duì)產(chǎn)物量的增加沒(méi)有促進(jìn)作用，反而會(huì)增加發(fā)酵罐的載荷負(fù)擔(dān)和水耗量。因此，最佳固液比為1∶15。

圖2 固液比對(duì)脫鉻皮屑水解的影響Fig. 2 The effect of solid-liquid ratio on hydrolysis of dechromed shavings

2.1.3 接種量

由圖3 可知，發(fā)酵6～24 h 時(shí)接種量越大，發(fā)酵液中的游離氨基含量越高；超過(guò)24 h 后，不同接種量的發(fā)酵液中游離氨基含量之間幾乎無(wú)差異。這可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵前期，接種量越大，發(fā)酵液中的活菌數(shù)量越多，產(chǎn)生的游離氨基含量就越高，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)量趨于相同，導(dǎo)致其游離氨基含量差異越來(lái)越小。在接種量為0.5%的基礎(chǔ)上繼續(xù)增大接種量并沒(méi)有增加游離氨基含量，反而浪費(fèi)種子液，增加發(fā)酵成本，因此接種量取0.5%。

圖3 接種量對(duì)脫鉻皮屑水解的影響Fig. 3 The effect of inoculation amount on hydrolysis of dechromed shavings

2.1.4 最適溫度

圖4 顯示，在同一發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)下，不同溫度的發(fā)酵液游離氨基含量并不都隨溫度的升高而增加。溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響P-4 菌株的代謝活動(dòng)，導(dǎo)致游離氨基含量較低。因此可以看出，37 ℃是P-4菌株降解脫鉻皮屑的最適溫度。

圖4 溫度對(duì)脫鉻皮屑水解的影響Fig. 4 The effect of temperature on hydrolysis of dechromed shavings

2.1.5 最適pH

由圖5 可以看出，pH 對(duì)脫鉻皮屑水解的影響與發(fā)酵溫度的影響規(guī)律相似，說(shuō)明pH 過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響P-4 菌株的代謝活動(dòng)，從而影響發(fā)酵液中的游離氨基含量。此實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，9 是P-4 菌株降解脫鉻皮屑的最適pH 值

圖5 pH 對(duì)脫鉻皮屑水解的影響Fig. 5 The effect of pH on hydrolysis of dechromed shavings

2.1.6 發(fā)酵時(shí)間

由圖6 可以看出，發(fā)酵12～24 h 時(shí)，發(fā)酵液中的游離氨基含量急速上升，此時(shí)P-4 菌株的代謝非常活躍，菌株不斷地分泌胞外蛋白酶，使得脫鉻皮屑由大分子的蛋白質(zhì)逐漸分解為小相對(duì)分子質(zhì)量的游離氨基酸和多肽；發(fā)酵24～48 h，游離氨基含量上升變緩，于48 h 時(shí)達(dá)到最高值。此時(shí)盡管P-4 菌株的代謝速度放緩，但氨基酸和多肽的產(chǎn)生速率還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于菌株的代謝消耗速率，所以游離氨基的含量不斷增加；發(fā)酵48～72 h，游離氨基含量出現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。此時(shí)脫鉻皮屑的生物降解基本完成，降解產(chǎn)生的小分子物質(zhì)作為菌株的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷地被消耗，出現(xiàn)了產(chǎn)物阻遏效應(yīng)。因此，P-4 菌株發(fā)酵48 h 時(shí)，游離氨基含量最高，發(fā)酵效果最佳。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)脫鉻皮屑水解的影響Fig. 6 The effect of fermentation time on hydrolysis of dechromed shavings

綜上所述，優(yōu)化的發(fā)酵條件為：菌齡24 h，固液比1∶15，接種量0.5%，溫度37 ℃，pH 9.0 和發(fā)酵時(shí)間48 h。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物成分的分析

脫鉻皮屑發(fā)酵過(guò)后已經(jīng)被水解成液體狀態(tài)，無(wú)肉眼可見(jiàn)的皮屑等固體殘留物。

2.2.1 重金屬含量

由表2 可知，脫鉻皮屑發(fā)酵液中未檢測(cè)到汞、砷、鎘、鉛，而鉻的含量也只有2.91 mg/kg，完全符合農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY 1110-2010 對(duì)水溶肥料的要求[25]。

表2 重金屬含量Tab. 2 Contents of heavy metal

2.2.2 游離氨基酸

由表3 可知，發(fā)酵液中游離氨基酸質(zhì)量濃度最高的為脯氨酸，其次為半胱氨酸、丙氨酸和組氨酸，這些氨基酸能夠?yàn)橹参锷L(zhǎng)提供快速營(yíng)養(yǎng)供給?？偘被豳|(zhì)量濃度達(dá)到了1 g/L，按照目前市售氨基酸肥料的施用質(zhì)量濃度為100 mg/L 計(jì)，發(fā)酵液可以至少稀釋10 倍后用于植物種植。

表3 游離氨基酸質(zhì)量濃度Tab. 3 Contents of free amino acid

2.2.3 多肽含量

用三氯乙酸去除發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)分子后，采用雙縮脲法，測(cè)得發(fā)酵結(jié)束時(shí)(48 h)發(fā)酵液中的多肽質(zhì)量濃度為13.21 g/L。多肽同氨基酸一樣，皆能夠明顯改善作物品質(zhì)，提高作物產(chǎn)量以及增強(qiáng)作物的抗逆性。但多肽還具有緩釋肥效的功能，能夠更持久地為植物提供營(yíng)養(yǎng)。因此，本實(shí)驗(yàn)制備的脫鉻皮屑發(fā)酵液有希望用作營(yíng)養(yǎng)均衡、豐富的植物營(yíng)養(yǎng)液。

2.2.4 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的分布

圖7 顯示，發(fā)酵12 h 后，蛋白質(zhì)條帶呈清晰的連續(xù)狀分布，且相對(duì)分子質(zhì)量較大，基本都在20.0 kda 及以上，此時(shí)尚處于起始階段；24 h 后，凝膠圖上只有模糊的蛋白質(zhì)條帶，尤其是48 h 以后，在標(biāo)準(zhǔn)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量范圍內(nèi)基本看不到蛋白質(zhì)條帶，說(shuō)明此時(shí)脫鉻皮屑已被充分降解為相對(duì)分子質(zhì)量更小的游離氨基酸和多肽，且多肽相對(duì)分子質(zhì)量皆在14.4 kda 以下。由此可知，經(jīng)過(guò)P-4 菌株發(fā)酵處理48 h 后，脫鉻皮屑已經(jīng)降解為氨基酸和小相對(duì)分子質(zhì)量多肽，發(fā)酵液中大量存在的游離氨基酸可以為處于迅速生長(zhǎng)期的植物提供快速均衡的營(yíng)養(yǎng)保障，豐富的多肽含量還可為植物生長(zhǎng)提供源源不斷的緩釋營(yíng)養(yǎng)供給。

3 結(jié)論

（1）優(yōu)化的P-4 菌株（地衣芽孢桿菌）發(fā)酵條件為：種子液菌齡24 h，固液比1∶15，接種量0.5%，溫度37 ℃，pH 9.0 和發(fā)酵時(shí)間48 h。

（2）脫鉻皮屑發(fā)酵液中未檢測(cè)到汞、砷、鎘和鉛元素，鉻質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.91 mg/kg，重金屬含量皆達(dá)到了農(nóng)業(yè)部國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

（3）發(fā)酵液中游離氨基酸主要有脯氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和組氨酸，總游離氨基酸質(zhì)量濃度達(dá)到了1 g/L。

（4）發(fā)酵液中總肽質(zhì)量濃度為13.21 g/L，說(shuō)明脫鉻皮屑發(fā)酵液中含有較高濃度的游離氨基酸和大量的多肽類(lèi)物質(zhì)。

（5）脫鉻皮屑在最優(yōu)條件下發(fā)酵48 h 后，基本降解為游離氨基酸和相對(duì)分子質(zhì)量更小的多肽類(lèi)物質(zhì)，且相對(duì)分子質(zhì)量都在14.4 kda 以下，有望作為生物有機(jī)緩釋肥促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。