一株耐鉻真菌的分離鑒定及基于抗氧化酶的耐鉻機(jī)制研究

朱超，馬靚琛，王曼婷，馬宏瑞，趙瀾博

（1.陜西科技大學(xué)，陜西 西安 710021；2.西北工業(yè)大學(xué)，陜西 西安 710072）

引言

隨著現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展，人類活動(dòng)對(duì)環(huán)境的影響不斷加劇，向環(huán)境中釋放了大量的重金屬，使得重金屬污染面積逐步擴(kuò)大，污染程度不斷加深[1]。其中水溶性Cr(VI)的生物毒性是強(qiáng)致突變物質(zhì)，美國(guó)的環(huán)境保護(hù)機(jī)構(gòu)（USEPA）已將其認(rèn)定為是嚴(yán)重危害人類健康的17 種化學(xué)物質(zhì)之一[2]。相關(guān)研究還指出，高濃度Cr(III)的暴露也會(huì)對(duì)植物造成明顯的毒害作用，影響其萌發(fā)過(guò)程，甚至抑制光合作用等生理過(guò)程[3]。皮革經(jīng)過(guò)浸水、脫毛、鞣制及其他加工工段產(chǎn)生許多皮革廢液，鉻作為皮革廢水的主要污染物之一，主要存在形式為Cr(VI)和Cr(III)[4]。中國(guó)制革產(chǎn)量全球第一，據(jù)統(tǒng)計(jì)制革廢水年排放量約為1.38億噸，其中總鉻排放量在6.7 t 左右，在我國(guó)各類行業(yè)造成的Cr 污染中，制革行業(yè)占比超過(guò)40%[5-6]，潛在環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)較大[7]。

目前，含鉻廢水的治理方法主要有物理法[8]、化學(xué)法[9]和生物法[10]。物理法包括離子交換法，吸附法，膜分離法等[11]?；瘜W(xué)法包括還原沉淀法、電解法和光催化還原法等，但都存在一定的局限性。近年來(lái)，由于生物法[12]具有經(jīng)濟(jì)高效、作用溫度低、pH 適應(yīng)范圍寬、污泥量少、無(wú)二次污染[13]等優(yōu)勢(shì)，成為生物除鉻技術(shù)和機(jī)制研究熱點(diǎn)之一[14]。

目前關(guān)于生物除鉻的研究主要集中在利用真菌或細(xì)菌對(duì)Cr(VI)進(jìn)行吸附和還原[15]。王瑜謙[16]在高濃度鉻污泥中得到的五種優(yōu)勢(shì)菌株在70 h 內(nèi)對(duì)Cr(VI)（600 mg/L）的還原性可達(dá)80%以上[17]。王巖等[18]以浮游藻類制成的生物吸附劑在3 h 時(shí)對(duì)Cr(VI)的吸附可達(dá)92.10%。生物法治鉻的主要核心在于耐鉻機(jī)制的研究上，現(xiàn)有研究[19]表明當(dāng)Cr(III)濃度低于10 mg/L 時(shí)，對(duì)普通小球藻細(xì)胞抗氧化酶系統(tǒng)中的SOD、CAT、POD 表現(xiàn)為促進(jìn)作用，大于10 mg/L 時(shí)具有抑制作用。陳蘭等[20]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)根菇菌絲體對(duì)Pb(II)和Cd(II)的耐受能力分別為400 mg/L 和16 mg/L，其中SOD 和CAT 的活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其他重金屬脅迫初期，黃孢原毛平革菌抗氧化酶系中的SOD 優(yōu)先響應(yīng)，其次是CAT 和GSH-Px[21]。

目前基于抗氧化酶系響應(yīng)研究微生物耐受高濃度鉻的機(jī)制研究主要集中在細(xì)菌和植物上[22]，對(duì)于真菌的耐鉻機(jī)制研究幾乎沒(méi)有，但真菌是制革含鉻廢水生物處理系統(tǒng)中的常見(jiàn)菌種，將其用于廢水中Cr(VI)和Cr(III)的去除很有潛力，故闡明真菌的耐鉻機(jī)制對(duì)優(yōu)化其應(yīng)用技術(shù)研發(fā)具有重要意義[23]。

本研究擬直接從高濃度鉻液中分離鑒定耐受高濃度鉻真菌，優(yōu)化其培養(yǎng)條件，并研究其基于抗氧化酶系的耐受機(jī)制, 為應(yīng)用此類菌種進(jìn)行含鉻廢水處理或制備重金屬鉻吸附劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)菌種取自實(shí)驗(yàn)室被真菌污染的質(zhì)量濃度為100 mg/L Cr-EDTA 溶液。

蛋白胨、葡萄糖、瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；總抗氧化能力測(cè)試盒、總超氧化物歧化酶測(cè)試盒、過(guò)氧化氫測(cè)試盒、蛋白質(zhì)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所。

ICP，美國(guó)THEM 公司；能譜儀，EDAX Octane Prime 公司；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

液體培養(yǎng)基采用改良馬丁培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母浸出粉2 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g；固體培養(yǎng)基采用改良馬丁培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母浸出粉2 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂2%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的分離培養(yǎng)

配制液體培養(yǎng)基，根據(jù)微生物實(shí)驗(yàn)方法，將培養(yǎng)基以及所需儀器進(jìn)行分裝滅菌。于超凈工作臺(tái)中，從真菌污染的100 mg/L 1∶1 Cr-EDTA 溶液中分離提取真菌菌株。將真菌用接種環(huán)挑出，分別放入三個(gè)裝有100 mL 液體培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行擴(kuò)繁，150 r/min、30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)成功后，于4 ℃保存，作為接種物備用。

1.2.2 真菌的理化性質(zhì)研究

觀察生長(zhǎng)出的菌株，肉眼觀察菌株的特征，利用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察其菌絲、分生孢子梗、分生孢子等形態(tài)特征，根據(jù)其菌落特征以及形態(tài)特征進(jìn)行菌種的初步鑒定。

分別在培養(yǎng)溫度為26，28，30，32，34 ℃時(shí)，培養(yǎng)真菌，研究溫度對(duì)其生長(zhǎng)影響，并確定最適生長(zhǎng)溫度。配制液體培養(yǎng)基，在加熱狀態(tài)下調(diào)節(jié)pH 分別為4，5，6，7，8，9，在培養(yǎng)皿分別培養(yǎng)真菌，研究pH對(duì)其生長(zhǎng)影響，確定最適生長(zhǎng)pH。根據(jù)確定的最適生長(zhǎng)溫度以及最適生長(zhǎng)pH，進(jìn)行其他因素對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響的研究。

1.2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

液體擴(kuò)培的菌體經(jīng)1500 r/min 離心5 min 收集后，采用TSINGKE 植物DNA 提取試劑盒（通用型）進(jìn)行基因組DNA 的提取，并由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行18s rRNA 基因測(cè)序，所得序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行blast 比對(duì)分析，獲得具有同源序列的菌株信息，下載相關(guān)參比序列，以Aspergillus flavus 為外類群，運(yùn)用MEGA 5 軟件通過(guò)鄰接法（Join-neighbor）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap 檢測(cè)設(shè)置為1000 次重復(fù)。

1.2.4 菌種的耐鉻濃度梯度實(shí)驗(yàn)

（1）Cr(VI)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

稱取重鉻酸鉀2.835 g，蒸餾水定容至1000 mL，則該溶液中Cr(VI)的最終質(zhì)量濃度是1 g/L，準(zhǔn)確吸取1 g/L 的Cr(VI)標(biāo)準(zhǔn)溶液1,2,3,4,5 mL 分別置于250 mL 的三角瓶中，加液體培養(yǎng)基稀釋至100 mL，即可得到Cr(VI)質(zhì)量濃度為10，20，30，40，50 mg/L 的培養(yǎng)基，同理配制Cr (VI) 質(zhì)量濃度為60，70，80，90，100 mg/L；200，300，400，500，600，700，800，900，1000 mg/L；2000，3000，4000，5000 mg/L 的培養(yǎng)基。

（2）菌種的馴化

將配制好的培養(yǎng)基以及所需儀器進(jìn)行分裝滅菌，使用接種環(huán)將培育出的母種分別接種到配制好的低濃度鉻的液體培養(yǎng)基中，150 r/min 30 ℃振蕩培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)完成后置于冰箱4 ℃保存。

（3）耐鉻濃度梯度實(shí)驗(yàn)

將配制好的培養(yǎng)基以及所需儀器進(jìn)行滅菌，將培育出的母種分別接種到配制好的液體培養(yǎng)基中，150 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)72 h，根據(jù)菌株生長(zhǎng)情況確定菌株的最高耐鉻能力。

1.3 分析方法

使用測(cè)試盒分別測(cè)試T-AOC，T-SOD，CAT，嚴(yán)格按照測(cè)試盒要求進(jìn)行測(cè)試，根據(jù)各自所需波長(zhǎng)下得到的OD 值，計(jì)算出菌株的主要抗氧化酶。

COD 的測(cè)定嚴(yán)格按照測(cè)試盒操作表使用各試劑，于波長(zhǎng)550 nm 處，1 cm 光徑比色杯，雙蒸水調(diào)零，比色，根據(jù)測(cè)定的結(jié)果由式1 求出總抗氧化能力。

總抗氧化能力（U/mgprot）=（（測(cè)定OD 值- 對(duì)照OD 值）÷0.01））÷30×（（反應(yīng)液總量（mL）÷（取樣量（mL）÷蛋白濃度（mgprot/mL）） （1）

T-SOD 的測(cè)定嚴(yán)格按照測(cè)試盒操作表使用各試劑，于波長(zhǎng)550 nm 處，1 cm 光徑比色杯，雙蒸水調(diào)零，比色，根據(jù)測(cè)定的結(jié)果由式2 求出總SOD 活力。

總SOD 活力（U/mgprot）=（（對(duì)照OD 值- 測(cè)定OD 值）÷對(duì)照OD 值）÷50%×（（反應(yīng)液總體積（mL）÷（取樣量（mL））÷待測(cè)樣蛋白濃度（mgprot/mL）（2）

CAT 嚴(yán)格按照測(cè)試盒操作表使用各試劑，于波長(zhǎng)405 nm 處，1 cm 光徑比色杯，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各管吸光度值，根據(jù)測(cè)定的結(jié)果由式3 求出CAT 活力。

CAT 活力（mmol/mgprot）=（（測(cè)定OD 值-空白OD 值）÷（標(biāo)準(zhǔn)OD 值-空白OD 值））×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（163 mmol/L）×（1÷蛋白濃度（gprot/L）） （3）

蛋白濃度嚴(yán)格按照測(cè)試盒操作表使用各試劑，于波長(zhǎng)550 nm 處，1 cm 光徑比色杯，雙蒸水調(diào)零，比色，根據(jù)測(cè)定的結(jié)果由式4 求出蛋白濃度。

待測(cè)樣品蛋白濃度（g/L）=（（測(cè)定OD 值-空白OD 值）÷（標(biāo)準(zhǔn)OD 值-空白OD 值））×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.563 g/L） （4）

1.3.1 基于抗氧化酶的耐鉻機(jī)制的研究

根據(jù)T-SOD，T-AOC，CAT，蛋白質(zhì)的測(cè)試結(jié)果，進(jìn)行線性擬合，分析出菌株的綜合抗氧化能力，根據(jù)抗氧化酶活性和Cr(VI)的劑量效應(yīng)關(guān)系，分析其耐鉻機(jī)制，并通過(guò)暴露脅迫去除后培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，研究分離菌株的最大Cr(VI)耐受濃度。

1.3.2 菌株對(duì)Cr(VI)的吸收量

使用等離子電感耦合原子發(fā)射光譜儀（ICP-AES，陜西科技大學(xué)輕工學(xué)院），測(cè)定1000 mg/L Cr(VI)暴露72 h 后，剩余的Cr(VI)濃度，并基于250 mL 培養(yǎng)體系計(jì)算溶解態(tài)鉻的百分比，同時(shí)使用環(huán)境掃描電子顯微鏡（分別在1500 kv 和1000 kv 發(fā)射電壓；放大倍數(shù)3000 倍和4000 倍下觀察）觀察真菌形態(tài)，并配合能譜儀掃描測(cè)定菌體表面Cr 質(zhì)量百分比作為吸附態(tài)Cr 濃度，依據(jù)培養(yǎng)體系中真菌總干重計(jì)算吸附態(tài)Cr 總量及占培養(yǎng)體系總鉻的百分比，其余占比部分的鉻則推定為進(jìn)入真菌細(xì)胞內(nèi)部的鉻。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的理化性質(zhì)

2.1.1 菌落特征

菌株的形態(tài)學(xué)鑒定如圖1a，1b 所示。在固體培養(yǎng)基中上呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的絨毛狀菌體，菌株形態(tài)較大，質(zhì)地疏松，外觀干燥，白色，呈現(xiàn)或松或緊的形狀，菌落和培養(yǎng)基間緊密連接，不易挑取，菌落正面為白色，背面為棕紅色。

圖1 菌株形貌觀察（a 為菌體正面形態(tài)，b 為菌體背面形態(tài)，c 為分離菌株上浮菌體電子顯微鏡形貌圖，d 為為下棲菌體電子顯微鏡形貌圖，e 為分離菌株Cr1000 光學(xué)顯微鏡照片200×）Fig. 1 Morphology observation of strain(a is the front morphology of bacteria,b is the back morphology of bacteria,c is the electron microscope morphology of floating bacteria,d is the electron microscope morphology of benthic bacteria,e is the optical microscope photograph of isolated strain Cr1000 200×)

在液體培養(yǎng)基中，白色菌體上浮連成片，不易分開(kāi)，不透明狀孢子下沉，部分白色菌絲附著于瓶壁，上浮菌體和下棲菌體電子顯微鏡照片見(jiàn)圖1c和1d，分離株光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果分別見(jiàn)圖1e,由圖可知上浮菌體為氣生菌絲構(gòu)成的較致密的膜形態(tài)，下棲菌體則為基底菌絲和包子囊形成的復(fù)合體，光學(xué)顯微鏡顯示分離株孢子囊在分枝的孢子囊梗上發(fā)育，孢子囊著生在彎曲的錐形分生孢子梗的頂端，具有典型的霜霉屬特點(diǎn)，這與分子生物學(xué)鑒定的結(jié)果相一致。

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定

圖2 為基于分離株18s rRNA 基因序列比對(duì)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，由進(jìn)化距離和分簇信息可知，分離株Cr1000 和已報(bào)道的Peronospora meconopsidis 高度同源，經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)可知分離株Cr1000 同Peronospora meconopsidis18s rRNA 基因序列（登錄號(hào)：KU948930.1）相似度為99.5%，可以確定本研究所得真菌分離株為霜霉屬，有研究表明該菌株可通過(guò)一般抗性機(jī)制、生物吸附和流出機(jī)制處理重金屬[24]。

圖2 分離株Cr1000 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化Fig.2 Phylogenetic tree of Cr1000 isolated strain

2.1.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，該菌株的最高耐鉻質(zhì)量濃度為1000 mg/L、在轉(zhuǎn)速為150 r/min 條件下震蕩培養(yǎng)72 h、最適培養(yǎng)溫度為30 ℃、最適培養(yǎng)pH 為6。

2.2 菌株對(duì)Cr(VI)的吸附

以Cr1000 菌株（培養(yǎng)基含Cr (VI) 質(zhì)量濃度為1000 mg/L 的菌株）為例，根據(jù)ICP-AES 測(cè)定結(jié)果（圖3）可知，Cr1000 菌株培養(yǎng)液中剩余鉻質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.4%，而Cr1000 菌體表面吸附鉻量占菌體生物量約為33%，換算為培養(yǎng)體系中總鉻質(zhì)量分?jǐn)?shù)24.3%，可推算Cr1000 菌體吸收的鉻占比約為49.3%，說(shuō)明該菌株有作為重金屬鉻活性吸附劑的價(jià)值。

圖3 培養(yǎng)液中剩余Cr(VI)質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig. 3 Percentage of the residual Cr(VI) concentration in culture medium

2.3 抗氧化酶的耐鉻機(jī)制

2.3.1 六價(jià)鉻濃度與抗氧化酶系活性關(guān)系

圖4 為不同Cr(VI)濃度下分離株抗氧化酶系活性的變化特征。

正常情況下，生物體內(nèi)會(huì)存在一套完整的抗氧化體系清除自由基，使細(xì)胞內(nèi)的自由基維持在適當(dāng)水平，維持細(xì)胞的氧化還原平衡狀態(tài)，但是當(dāng)細(xì)胞遭遇逆境脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平可能急劇上升，其產(chǎn)生速度可能超出了細(xì)胞平衡狀態(tài)下的清除能力，造成細(xì)胞的氧化損傷。微生物體內(nèi)活性氧的清除主要由某些酶系統(tǒng)和抗氧化物質(zhì)來(lái)完成，其中T-AOC、T-SOD、CAT 是最重要的活性氧清除酶系統(tǒng)，SOD 將O2-歧化成H2O2，再由CAT 將H2O2分解成H2O 和O2，T-AOC 則為生物細(xì)胞整體抗氧化性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

由圖4 可知，在不同Cr(VI)濃度暴露情況下，分離株的T-AOC、T-SOD、CAT 的活性較之對(duì)照均顯著增加，其中T-SOD 活性增速最快，在Cr(VI)質(zhì)量濃度為155 mg/L 時(shí)可達(dá)到空白對(duì)照組的4 倍，CAT為對(duì)照組的3.8 倍，T-AOC 是為對(duì)照組的2 倍；當(dāng)鉻質(zhì)量濃度范圍在155～750 mg/L 時(shí)表現(xiàn)為緩慢增長(zhǎng)，當(dāng)質(zhì)量濃度范圍大于750 mg/L 是時(shí)，T-AOC 活力進(jìn)入平穩(wěn)期，但T-SOD、CAT 活力仍處于增長(zhǎng)期。試驗(yàn)結(jié)果肯定了Cr(VI)暴露下該分離株可通過(guò)抗氧化系統(tǒng)的應(yīng)激反應(yīng)來(lái)平衡Cr(VI)導(dǎo)致的氧化脅迫。

圖4 Cr(VI)濃度與抗氧化酶活性響應(yīng)圖Fig.4 Responding variation of the activities of antioxidant enzymes to different Cr(VI) concentrations

2.3.2 各抗氧化酶之間的關(guān)系

根據(jù)各抗氧化酶的測(cè)定結(jié)果，T-AOC 與T-SOD 的關(guān)系，T-AOC 與CAT 的關(guān)系，T-SOD 與CAT 的關(guān)系如圖5。

由圖5a 可得，隨著T-SOD 越高，菌株的總抗氧化能力越強(qiáng)，進(jìn)行線性擬合，各參數(shù)如圖5a，關(guān)系見(jiàn)公式5。

總抗氧化能力（U/mgprot）=0.204×總SOD 活力（U/mgprot）-0.535 （5）

根據(jù)T-AOC 與H2O2的測(cè)定結(jié)果，T-AOC 與CAT 的關(guān)系如圖5b。

由圖可得，隨著CAT 越高，菌株的總抗氧化能力越強(qiáng)，進(jìn)行線性擬合，各參數(shù)如圖5b，關(guān)系見(jiàn)公式6。

圖5 各抗氧化酶系之間的關(guān)系（a.T-AOC 與T-SOD 的關(guān)系，b.T-AOC 與CAT 的關(guān)系C.T-SOD 與CAT 的關(guān)系）Fig. 5 Relationship between antioxidant enzymes(a.Relationship between T-AOC and T-SOD,;b.Relationship between T-AOC and CAT;C.Relationship between T-SOD and CAT)

總 抗 氧 化 能 力（U/mgprot）=0.1942 ×H2O2（U/mgprot）+1.7782 （6）

根據(jù)T-SOD 與CAT 的測(cè)定結(jié)果，T-SOD 與H2O2的關(guān)系如圖5c。

由圖可得，隨著CAT 越高，菌株的總抗氧化能力越強(qiáng)，進(jìn)行線性擬合，各參數(shù)如圖5c，關(guān)系見(jiàn)公式7。

總SOD 活力（U/mgprot）=0.9686×H2O2（U/mgprot）-7.945 （7）

3 結(jié)論

（1）該分離株為霜霉菌菌屬，為好氧生長(zhǎng)，能在較寬的pH 值（4～9）和溫度（25～35 ℃）范圍內(nèi)生長(zhǎng)，生長(zhǎng)最適環(huán)境條件為150 r/min 震蕩，pH=7，培養(yǎng)溫度為30 ℃。

（2）重鉻酸鉀質(zhì)量濃度為50～1000 mg/L 時(shí)，菌株生長(zhǎng)隨Cr (VI) 濃度升高受抑制情況逐漸增強(qiáng)，1000～5000 mg/L 時(shí)，菌株生長(zhǎng)受到顯著抑制，基本不生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移到不含鉻培養(yǎng)基時(shí)，3000 mg/L 鉻暴露下的菌株又重新生長(zhǎng)，因此該菌的最高耐鉻質(zhì)量濃度為3000 mg/L。

（3）培養(yǎng)液濃度分別與抗氧化酶活性(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)呈正相關(guān)，且活性增速?gòu)母叩降蜑門(mén)-SOD、CAT、T-AOC，說(shuō)明本菌對(duì)于鉻的抗性是由抗氧化酶系協(xié)同作用的結(jié)果；抗氧化酶活性(T-AOC)與總超氧化物歧化酶(T-SOD)、抗氧化酶活性(T-AOC)與過(guò)氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)與過(guò)氧化氫酶(CAT)也分別呈線性正相關(guān)。