采前紅藍光連續(xù)光照光強對水培生菜生長、品質(zhì)及AsA代謝的影響

劉家源， 張玉彬， 劉文科

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部設施農(nóng)業(yè)節(jié)能與廢棄物處理重點實驗室，北京 100081）

抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）又稱維生素C， 存在于葉綠體、線粒體、液泡、細胞質(zhì)和細胞壁中，在葉綠體中濃度最高［1］。AsA與其他抗氧化劑共同組成抗氧化系統(tǒng)，保護植物免受有氧代謝、光合作用和多種污染物造成的氧化損害［2］。內(nèi)源性AsA水平的高低會影響植物開花、衰老相關(guān)基因的誘導，與細胞的凋亡、病原體的信號轉(zhuǎn)導和植物體衰老的發(fā)展都有聯(lián)系［3］。維持體內(nèi)AsA在臨界水平之上對人體健康至關(guān)重要，缺乏AsA會引起壞血病等疾病。但是人體缺乏催化AsA合成的酶，并且相關(guān)基因在進化過程中累積了有害突變［4-6］，因此人體自身不能合成AsA，必需通過不斷的膳食攝取才能保證人體健康。植物是人類飲食中最主要和最重要的AsA來源，提高植物組織的AsA含量對于維持和促進人類健康具有重要意義。

連續(xù)光照通常是指改變植物原有的光周期規(guī)律，給植物提供連續(xù)24 h的光照［7］。連續(xù)光照必需通過人工光源才能實現(xiàn)，因而連續(xù)光照是設施園藝中特有的光照模式。連續(xù)光照打破了植物原有的生長規(guī)律，對于植物而言是一種光脅迫。目前對于連續(xù)光照的研究主要是采用人工補光的方式來改變植物原有的明暗交替的光周期規(guī)律生長方式，研究其對植物生長發(fā)育的影響［8］。周晚來［9］研究發(fā)現(xiàn)，在生菜采收前，進行短期連續(xù)光照可以顯著降低水培生菜（Lactuca sativa L.）的硝酸鹽含量，并提高可溶性糖、AsA等營養(yǎng)物質(zhì)的含量；Ohyama等［10］研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)光照促使番茄嫁接苗植株鮮重、干重及葉面積等顯著提高，且未對番茄葉片造成傷害。事實上，已有大量研究表明，在一定范圍內(nèi)，光強越大，植物體內(nèi)的 AsA 含量越高［11］。Massot等［12］對番茄植株進行梯度光照強度處理后發(fā)現(xiàn)，植株AsA的總量隨光照強度的降低而減少，說明這種現(xiàn)象受到了光照強度的調(diào)控，對植株中AsA的合成代謝起到一定的調(diào)節(jié)作用［13］。

生菜是一種廣泛食用的全球性葉菜類蔬菜，也是人工光植物工廠廣泛種植的代表性蔬菜。高濃度硝態(tài)氮的栽培環(huán)境是提高水培葉菜產(chǎn)量的有效方法，但在實際生產(chǎn)中，植物工廠水培葉菜高產(chǎn)的同時品質(zhì)低的問題也十分突出，主要表現(xiàn)為以抗壞血酸為代表的次生代謝物質(zhì)和其他基礎營養(yǎng)物質(zhì)含量低。截至目前，光照強度對AsA代謝的調(diào)控機制仍不清楚。因此，本研究擬在作物生長過程中，通過研究采前LED連續(xù)光照的光照強度對生菜AsA等營養(yǎng)物質(zhì)的含量及AsA相關(guān)合成代謝酶活性的影響，探索生菜體內(nèi)AsA等營養(yǎng)物質(zhì)的含量及AsA代謝網(wǎng)絡對采收前連續(xù)光照光強的響應機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗在中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所植物工廠進行。試驗采取水培方式，種植環(huán)境溫度為（25±1）℃，相對濕度為65%±5%，CO2濃度為大氣CO2濃度。試驗用生菜品種為意大利耐抽薹，由本課題組保存。

1.2 試驗設計

將生菜種子播于海綿塊中育苗，培養(yǎng)15 d后，將長勢一致的生菜苗隨機移栽于長方形塑料栽培槽（長180 cm×寬60 cm×高6 cm）內(nèi)，并于次日開始光照試驗。試驗期間采用營養(yǎng)液水培，營養(yǎng)液采用霍格蘭配方。

試驗前期正常光照采用LED紅藍光面板燈進行光照處理，紅藍光比例為4∶1，光照強度為150 μmol·m-2·s-1，光周期為16 h/8 h（光期時間段：6：00—22：00），此種光環(huán)境設置可以更好地促進生菜產(chǎn)量和品質(zhì)的提高［14］。植物工廠生菜因品種不同，生長速度也有差異。根據(jù)前期試驗得到的結(jié)果，本試驗統(tǒng)一連續(xù)培養(yǎng)17 d，生菜達到采收標準后進行72 h的連續(xù)光照處理，從定植后第17天的6：00開始連續(xù)光照，在第20天6：00光照結(jié)束。每個處理種植生菜26株，采用紅光波峰為655 nm，藍光波峰為430 nm的LED紅藍光燈板（49 cm×49 cm）進行光照處理。燈板懸掛于栽培槽上方40 cm處。集中連續(xù)光照強度分別為100、150、200、300和500 μmol·m-2·s-1（分別用CL100、CL150、CL200、CL300和CL500表示），以延續(xù)此前 150 μmol·m-2·s-1、16 h/8 h 光周期的光照條件為對照（用CK表示）。

1.3 測定項目及方法

在連續(xù)光照開始和結(jié)束時取樣，采用SPAD-502葉綠素含量測定儀（Imaging-PAM，德國Walz）測定葉綠素含量（SPAD）。分別于每個處理中隨機選8株生菜作為重復樣本，從莖基部切開，其中4株的地上部分將葉片與葉柄分離后，迅速用液氮冷凍，并用高通量組織研磨器在低溫下把用液氮冷凍好的植物樣品研磨成粉末，放至-80℃冰箱中留樣備用。另外4株用電子計數(shù)天平稱取地上部鮮重和根鮮重，用Li-3100C葉面積儀（美國LI-COR）測量整株生菜葉片的葉面積，然后將生菜100℃下殺青20 min，80℃烘干至恒重，用分析天平分別稱取地上部干重和根干重。生理指標和品質(zhì)指標測定的取樣葉位為同葉位。

采用便攜式光合儀（LI-6400XT，美國）分別在采前連續(xù)光照前后分2次測定生菜不同處理下葉片的凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、蒸騰速率（transpiration rate，Tr）、胞間CO2濃度（intercellular CO2concentration，Ci）和氣孔導度（stomatalconductance，Gs）。

硝酸鹽含量測定采用硫酸-水楊酸法［15］測定，取新鮮植物樣品粉末0.1 g，加入1.5 mL蒸餾水，放入沸水浴中提取。取0.1 mL浸提液至10 mL試管中，加入0.4 mL 5%的水楊酸-濃硫酸溶液，混勻、冷卻后后加入9.5 mL 8%的NaOH溶液，冷卻后測定并計算硝酸鹽的含量。

可溶性糖含量測定采用硫酸-苯酚法，參考李合生［16］的試驗方法，取新鮮植物樣品粉末0.1 g，加入1.5 mL蒸餾水，放入沸水浴中提取。然后吸取0.5 mL樣品液于試管中，加蒸餾水1.5 mL，并以此加入苯酚、濃硫酸溶液、顯色，測定并計算可溶性糖的含量。

參照Spinola等［17］的方法，采用 UPLC 測定抗壞血酸（ASA）含量。提取液：1.5% MPA，4% CH3COOH， 0.5mmol·L-1EDTA；緩 沖 液 ：200 mmol·L-1Tris；還原液：750 mmol·L-1DTT；反應停止液：0.4 mol·L-1H2SO4。色譜柱為 HSS T3 2.1 mm×50 mm，1.8 μm，流動相為 0.1% 的甲酸溶液（超純水配制），流速0.25 mL·min-1，進樣量2 μL，柱溫25℃，樣品室溫度10℃，檢測波長245 nm，運行時間1.5 min。DHA含量、L-半乳糖酸 -1，4-內(nèi) 酯 脫 氫 酶（L-galactono-1，4-lactone dehydro-genase，GalLDH）酶活性、AsA過氧化物酶（APX）活性、AsA還原酶（DHAR）活性、單脫氫AsA還原酶（MDHAR）活性和谷胱甘肽還原酶（GR）活性的測定參照文獻［18］進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

分別用Microsoft Excel 2010和SPSS 25.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析和差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 采前LED連續(xù)光照光強對生菜生長的影響

2.1.1 采前LED連續(xù)光照光強對生菜產(chǎn)量的影響 從圖1可以看出，采前LED連續(xù)光照光強對生菜產(chǎn)量具有顯著影響。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜植株地上部分鮮重提升了2.65 g；而連續(xù)光照處理72 h后，生菜植株地上部分鮮重顯著提高，CL100、CL150、CL200、CL300和 CL500處理中，72 h后干重都出現(xiàn)顯著增加。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜植株根鮮重提升了0.60 g；在連續(xù)光照處理72 h后，生菜植株根鮮重顯著提高，CL150、CL200、CL300和 CL500處理中，72 h后干重均出現(xiàn)提升。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜植株地上部干重增加了0.14 g；而連續(xù)光照處理72 h后，高強度光照處理中地上部干重顯著提高，CL150、CL200、CL300和CL500處理中，72 h后地上部干重均顯著提升。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜根干重增加了0.014 g；而連續(xù)光照處理72 h后，高強度光照處理中地上部干重明顯增加，CL200、CL300和CL500處理中，72 h后根干重分別增加了0.11、0.12和0.24 g。結(jié)果表明，隨著采收前最后72 h LED紅藍光連續(xù)照射的光照強度升高，生菜地上部的干鮮重和根的干鮮重都升高。

圖1 采前LED連續(xù)光照光強對生菜產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of LED continuous light intensity on lettuces yield before harvest

2.1.2 采前LED連續(xù)光照光強對生菜形態(tài)指標的影響 圖2顯示，非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉面積增加了74 cm2；而連續(xù)光照處理72 h后，生菜葉面積顯著提高，CL150、CL200、CL300和CL500處理中，72 h后干物質(zhì)含量均出現(xiàn)增加。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉片的SPAD略微增加至19.83；而高光強連續(xù)光照處理72 h后，生菜葉片SPAD明顯增加。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜干物質(zhì)含量無變化；而高光強連續(xù)光照處理72 h后，生菜干物質(zhì)含量明顯增加。高光強連續(xù)光照處理72 h后，生菜比葉重明顯增加。可見，隨著采前LED連續(xù)光照光強的增加，生菜葉面積、干物質(zhì)含量和比葉重均顯著增加，SPAD在CL200處理時達到最高，之后不再隨CL光強的增加而增加。

圖2 采前LED連續(xù)光照光強對生菜形態(tài)指標的影響Fig.2 Effects of LED continuous lighting intensity on morphological index of lettuce before harvest

2.2 采前LED連續(xù)光照光強對生菜光合特性的影響

圖3顯示，采前LED連續(xù)光照光強對生菜光合特性有一定的影響。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉片的凈光合速率（Pn）增加了1.51 μmol·m-2·s-1；而高光強連續(xù)光照處理72 h后，生菜葉片的Pn明顯增加。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉片的氣孔導度（Gs）略微降低；而進行連續(xù)光照處理72 h后，CL300和CL500處理中生菜葉片的Gs明顯增加；CL100和CL150處理中生菜葉片的Gs明顯降低，72 h 后 Gs分別降低了 0.102 和 0.108 mol·m-2·s-1。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉片的胞間CO2濃度（Ci）略微降低；而連續(xù)光照處理72 h后，CL300處理中生菜葉片的Ci明顯增加；CL150和CL200處理中生菜葉片的Ci均明顯降低。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉片的蒸騰速率（Tr）略微升高；而連續(xù)光照處理72 h后，CL300和CL500處理中生菜葉片的Tr明顯增加。

圖3 采前LED連續(xù)光照光強對生菜光合特性的影響Fig.3 Effects of LED continuous light intensity on photosynthetic characteristics of lettuces

2.3 采前LED連續(xù)光照光強對生菜品質(zhì)的影響

由圖4可知，非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉片的可溶性糖含量略微升高；而連續(xù)光照處理72 h后，CL150、CL200、CL300和CL500處理中生菜葉片的可溶性糖含量明顯增加。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉柄的可溶性糖含量升高了4.80 mg·g-1；而連續(xù)光照處理72 h后，CL200和CL500處理中生菜葉柄的可溶性糖含量明顯增加，72 h后分別增加了19.20和33.70 mg·g-1。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉片的硝酸鹽含量略微升高；而連續(xù)光照處理72 h后，CL200、CL300和CL500處理中生菜葉片的硝酸鹽含量明顯降低。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉柄的硝酸鹽含量升高了17.46 mg·kg-1；而連續(xù)光照處理72 h后，CL200和CL500處理中生菜葉柄的硝酸鹽含量明顯增加，72 h后分別增加了116.54和171.54 mg·kg-1?？梢姡巳~片和葉柄的可溶性糖含量隨CL光強的升高而升高，生菜葉片和葉柄的硝酸鹽含量隨CL光強的升高而降低。

圖4 采前LED連續(xù)光照光強對生菜可溶性糖和硝酸鹽含量的影響Fig.4 Effects of LED continuous lighting intensity on soluble sugar and nitrate contents of lettuces before harvest

2.4 采前LED連續(xù)光照光強對生菜AsA代謝的影響

為探明LED紅藍光連續(xù)光照對水培生菜中AsA含量的調(diào)控效果及其相應的代謝機理。本研究以AsA代謝途徑（合成、氧化和還原再生）連續(xù)光照響應位點與聯(lián)動機制為突破口，在基因表達和關(guān)鍵酶活性層面研究了紅藍光連續(xù)光照對水培生菜AsA代謝關(guān)鍵酶（GalLDH、APX、MDHAR、DHAR和GR）的影響及其與時長、光強和光質(zhì)的關(guān)系，揭示水培生菜AsA代謝對連續(xù)光照響應機理。

2.4.1 采前LED連續(xù)光照光強對生菜AsA和DHA含量的影響 由圖5可知，非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉片的AsA含量略微升高；而連續(xù)光照處理72 h后，CL200、CL300和CL500處理中生菜葉片的AsA含量明顯增加。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉柄的AsA含量升高了0.21 mg·g-1；而連續(xù)光照處理72 h后，各處理的生菜葉柄中AsA含量均無顯著差異。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉片的DHA含量略微升高；而CL150處理中生菜葉片的DHA含量明顯增加，72 h后增加了0.32 mg·g-1。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉柄的DHA含量略微降低；而連續(xù)光照處理72 h后，各處理的生菜葉柄中DHA含量均無顯著差異?？梢姡汕癓ED連續(xù)光照處理后，隨著CL光強的升高，生菜葉片AsA含量逐漸升高，生菜葉片DHA含量有先升高后降低的趨勢，各處理中生菜葉柄的AsA和DHA含量均無顯著差異。從圖5中可以明顯看出，各處理中，生菜葉片的AsA含量顯著高于葉柄的AsA含量。

圖5 采前LED連續(xù)光照光強對生菜AsA和DHA含量的影響Fig.5 Effects of LED continuous light intensity on ASA and DHA contents of lettuces before harvest

2.4.2 采前LED連續(xù)光照光強對生菜GalLDH酶活性的影響 由圖6可知，非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉片的GalLDH酶活性略微升高；而連續(xù)光照處理72 h后，CL100處理中生菜葉片的GalLDH酶活性最高，達到0.338 U·mg-1FW；CL500處理中生菜葉片的GalLDH酶活性明顯下降。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉柄的GalLDH酶活性略微升高；而連續(xù)光照處理72 h后，各處理的生菜葉柄中GalLDH酶活性均無顯著差異?？梢钥闯觯?2 h采前LED連續(xù)光照后，生菜葉片的GalLDH酶活性隨CL光強的升高而逐漸下降，各處理的生菜葉柄中GalLDH酶活性均無顯著差異。

圖6 采前LED連續(xù)光照光強對生菜GalLDH酶活性的影響Fig.6 Effects of LED continuous light intensity on the GalLDH activities in lettuces before harvest

2.4.3 采前LED連續(xù)光照光強對生菜APX、MDHAR、DHAR和GR酶活性的影響 采前LED連續(xù)光照光強處理對生菜AsA代謝循環(huán)中各種酶活性具有不同的影響。圖7顯示，非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉片的APX酶活性略微升高；而高光強連續(xù)光照處理72 h后，生菜葉片的APX酶活性明顯增加。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉柄的APX酶活性略微升高；而高光強連續(xù)光照處理72 h后，生菜葉柄的APX酶活性明顯增加。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉片的MDHAR酶活性略微降低至2.12 U·mg-1FW；而高光強連續(xù)光照處理72 h后，生菜葉片的MDHAR酶活性明顯增加。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉柄的MDHAR酶活性略微升高；而連續(xù)光照處理72 h后，生菜葉柄的MDHAR酶活性略微增加，但無顯著差異。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉片的DHAR酶活性略微降低至1.52 U·mg-1FW；而高光強連續(xù)光照處理72 h后，生菜葉片的DHAR酶活性明顯增加。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉柄的DHAR酶活性略微升高；連續(xù)光照處理72 h后，各處理中生菜葉柄的DHAR酶活性無顯著差異。非連續(xù)光照處理72 h（CK）后，生菜葉片的GR酶活性升高了0.013 U·mg-1FW；而連續(xù)光照處理72 h后，CL200、CL300和CL500處理中生菜葉片的GR酶活性明顯增加。非連續(xù)光照處理72 h（CK）和連續(xù)光照處理72 h后，各處理的生菜葉柄的GR酶活性均無顯著差異。

圖7 采前LED連續(xù)光照光強對生菜APX、MDHAR、DHAR和GR酶活性的影響Fig.7 Effects of LED continuous light intensity on APX，MDHAR，DHAR and GR activities of lettuces before harvest

3 討論

本研究結(jié)果顯示，采前LED連續(xù)光照后生菜地上部鮮重和干重均顯著增加，且隨著連續(xù)光照的光照強度的提高，生菜葉片的凈光合效率增大，生菜地上部的干物質(zhì)含量增大，這與Sysoeva［19］等的研究結(jié)果一致。通過延長光合作用的時間而提高生菜葉片的凈光合效率，促進光合產(chǎn)物的累積，從而使得生菜產(chǎn)量得到顯著提高。因此，通過采收前集中連續(xù)LED紅藍光照射是一個增加產(chǎn)量的有效途徑。

周晚來［9］通過對生菜進行50～200 μmol·m-2·s-1光強的采前連續(xù)光照發(fā)現(xiàn)，水培生菜的硝酸鹽含量隨連續(xù)光照光強的升高逐漸降低，可溶性糖及抗壞血酸含量隨連續(xù)光照光強的升高而逐漸升高。本研究進一步將采前LED連續(xù)光照的最高光強處理提高到500 μmol·m-2·s-1，發(fā)現(xiàn)隨著連續(xù)光照光強的升高，可溶性糖含量逐漸升高，硝酸鹽含量逐漸降低，但在光強達到150 μmol·m-2·s-1之后繼續(xù)增加，硝酸鹽含量雖進一步降低，但已無顯著差異。這可能是由于植物體內(nèi)所含物質(zhì)的含量都有個濃度范圍，在150 μmol·m-2·s-1的72 h 連續(xù)光照后，生菜體內(nèi)的硝酸鹽含量已經(jīng)達到下限，再通過升高連續(xù)光照的光強來進一步降低硝酸鹽含量會逐漸變的困難。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨采前連續(xù)光照光強的升高，葉片AsA含量逐漸增加，葉片DHA含量先升高后降低。隨采前連續(xù)光照光強的升高，葉柄的AsA含量略有增加，DHA含量略有降低，與非連續(xù)光照處理（CK）對比，各處理間葉柄的AsA和DHA含量均無顯著差異。植物體內(nèi)的抗壞血酸含量取決于其合成和分解的速率及合成和分解的動態(tài)平衡狀態(tài)［20］。本研究結(jié)果表明，隨著連續(xù)光照光強的提高，葉片中GalLDH活性逐漸降低。因此，采前LED連續(xù)光照光強對生菜葉片GalLDH活性的影響與抗壞血酸含量變化相反。研究表明，AsA含量的高低主要與APX、MDHAR、DHAR和GR等酶活性的高低有關(guān)［21-22］。本研究結(jié)果表明，葉片APX酶活性隨連續(xù)光照光強的增大而增大，與AsA含量的變化趨勢一致，說明連續(xù)光照光強越高，APX酶活性越高，催化分解AsA的量越多。葉片MDHAR酶活性隨連續(xù)光照光強的增大而增大，與AsA含量的變化趨勢一致，說明連續(xù)光照光強越高，MDHAR酶活性越高，催化分解為DHA那部分的MDHA轉(zhuǎn)化合成AsA的量越多。葉片DHAR酶活性隨連續(xù)光照光強的增大而增大，與AsA含量的變化趨勢一致，說明連續(xù)光照光強越高，DHAR酶活性越高。葉片GR酶活性隨連續(xù)光照光強的增大而增大，也說明連續(xù)光照光強的升高促進了DHA還原為AsA的效率?？梢?，連續(xù)光照光強對AsA含量的影響主要是與參與AsA再生循環(huán)系統(tǒng)的MDHAR、DHAR和GR酶活性相關(guān)。