濕地松不定根誘導(dǎo)中內(nèi)源激素水平變化*

王會(huì)周 陳志東 石禮盛 黃淑敏

( 1. 深圳市寶安區(qū)羅田林場(chǎng), 廣東 深圳 518100; 2. 福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院, 福建 福州 350002 )

濕地松Pinus elliottii生長(zhǎng)性狀優(yōu)良，基于脂材兩用的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，目前已成為我國(guó)南方主要造林樹種[1]。速生、高抗、優(yōu)質(zhì)多功能目標(biāo)林木育種是實(shí)現(xiàn)林業(yè)可持續(xù)經(jīng)營(yíng)的根本與保障。然而當(dāng)前濕地松速生高抗種子園產(chǎn)量較低，育種周期又長(zhǎng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)前種苗良種化大規(guī)模發(fā)展的需要[2]。因此，生產(chǎn)上建立一種高效的繁殖濕地松優(yōu)良種質(zhì)的技術(shù)體系尤為迫切。

無性繁殖是能保持親體優(yōu)良性狀的一種繁殖技術(shù)[3]。扦插作為無性繁殖技術(shù)中最簡(jiǎn)單易行的一種手段，被廣泛應(yīng)用于林業(yè)科研和生產(chǎn)。以往研究發(fā)現(xiàn)，濕地松扦插具有明顯的生理年齡效應(yīng)，母株年齡為1～3 年時(shí)，扦插生根可達(dá)90%以上，而母株年齡為6 年時(shí)，扦插生根率不足30%[2]。季孔庶等[4]也發(fā)現(xiàn)，4 年生以上馬尾松Pinus massoniana母株插穗生根能力顯著下降。楊峰等[5]認(rèn)為，年齡效應(yīng)是進(jìn)行松樹嫁接、扦插、組織培養(yǎng)等無性繁殖時(shí)的共同難題，不定根誘導(dǎo)是組培、扦插無性育苗中的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，年齡效應(yīng)直接影響不定根發(fā)生。為加快濕地松優(yōu)良種質(zhì)材料的推廣應(yīng)用，進(jìn)一步提升濕地松無性育苗中的生根穩(wěn)定性極為重要。激素在植物不定根形成中起到至關(guān)重要的作用[6-7]。因此，本試驗(yàn)以4 年生濕地松母株上所采穗條為試驗(yàn)材料，通過扦插育苗的方法，分析不定根誘導(dǎo)過程中插穗根莖解剖構(gòu)造與內(nèi)源激素水平變化，以期揭示內(nèi)源激素對(duì)濕地松生根的影響，為濕地松生根能力優(yōu)化與提升提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以優(yōu)良的濕地松種子培育實(shí)生苗為采穗母株，通過截頂促萌修剪方式進(jìn)行母株管護(hù)，采集4 年生母株在當(dāng)年3 月份生產(chǎn)的5～8 cm 長(zhǎng)、生長(zhǎng)健壯、未木質(zhì)化穗條為試驗(yàn)材料，通過扦插方式開展不定根誘導(dǎo)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不定根誘導(dǎo) 采用容器扦插育苗的方法，以黃泥為育苗基質(zhì)，參照前人最優(yōu)[8]的濕地松扦插育苗生根處理方式（扦插成活率97.5%），以1 000 mg/L IAA 浸泡插穗基部5 min 后插入經(jīng)高錳酸鉀消毒的黃泥杯（Ф=4 cm，高=7 cm）。不定根誘導(dǎo)試驗(yàn)在控制環(huán)境條件的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，溫度25±1℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，每日光照16 h，相對(duì)濕度85%。試驗(yàn)重復(fù)5 次，每重復(fù)60 株。

1.2.2 不定根解剖構(gòu)造觀察 顯微鏡觀測(cè)：在扦插生根處理中每隔5 天取出穗條，經(jīng)流水沖洗干凈后，切下約5～8 mm 長(zhǎng)度大小的根莖基部，轉(zhuǎn)入FAA 固定液進(jìn)行，依次用30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100% 酒精系列脫水，然后進(jìn)行透蠟和包埋。最后用轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)切片，進(jìn)行番紅固綠對(duì)染后用阿拉伯中性樹膠封片，觀察不定根發(fā)生并顯微拍照。重復(fù)3 次取樣進(jìn)行觀察拍照。

油鏡觀測(cè)：為進(jìn)一步清晰觀測(cè)濕地松生根過程中根莖細(xì)胞變化，參考吳均章和韓素芬方法[9]，利用油鏡進(jìn)行顯微觀測(cè)。取樣時(shí)間與方法同上，然后將根莖樣品轉(zhuǎn)入FAA 液固定，再依次用50%、70%、80%、95%、100%酒精脫水。脫水后將根莖置入Technovit7100 活化液中滲透，然后采用電鏡超薄切片用的定向包埋板, 于40 ℃溫箱中使之快速固化，最后用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切片，利用Gimsa 染色后在1%偏重亞硫酸鈉溶液中漂洗，將切片自然晾干后放入二甲苯透明，中性樹膠封藏。重復(fù)3 次取樣在油鏡下進(jìn)行觀察拍照。

1.2.3 內(nèi)源激素水平測(cè)定 根據(jù)生根解剖構(gòu)造顯微觀察結(jié)果，于生根誘導(dǎo)處理第0（初期，R0）、20（根原基形成期，R20）、45 天（不定根形成期，R45）取樣測(cè)定內(nèi)源激素水平的變化。使用儀器：美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn)的Agilent 1290 液相色譜儀、Agilent 6460C 三重四極桿質(zhì)譜儀和配電噴霧離子源，測(cè)定內(nèi)源激素包括吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GAs）、脫落酸（ABA）和玉米素核苷（ZR），激素標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma 公司生產(chǎn)，色譜純級(jí)。色譜條件和質(zhì)譜條件參照王榮[10]的方法，取不同生根時(shí)間處理R0、R20、R45 插穗基部1 cm 長(zhǎng)的根莖為測(cè)試樣品，各重約2 g，于液氮中研磨成粉末，分離上清液，過聚乙烯聚吡咯烷酮PVPP 柱和二乙基氨基乙基交聯(lián)葡聚糖凝膠（DEAESephadex A-25）柱凈化，過0. 22 μm 濾膜后檢測(cè)。重復(fù)3次取樣進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑促根處理 根據(jù)解剖構(gòu)造與內(nèi)源激素水平分析結(jié)果，生根處理20 天后，采用4 個(gè)不同濃度多效唑（PBZ）水溶液噴施插穗針葉。其中，以0 mg/L PBZ（純水）為對(duì)照，設(shè)置25、50、100 mg/L 3 個(gè)PBZ 處理。噴施插穗針葉時(shí)，每株噴施5 mL，每隔10 天噴施一次，連續(xù)噴施3 次。于生根處理45 天，取出插穗觀察濕地松生根能力變化。統(tǒng)計(jì)不同PBZ 處理插穗生根率和長(zhǎng)度≥5 mm 的不定根數(shù)目。其中，生根率（%）=（生根苗株數(shù)÷扦插穗條總數(shù)）×100，根條數(shù)=生根穗條不定根數(shù)目總和÷生根苗株數(shù)。每處理5 重復(fù)，每重復(fù)扦插60 株。生根培養(yǎng)溫度、光照、濕度條件同1.2.1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用單因素方差分析（one-way ANOVA，α=0. 05）對(duì)不同PBZ 處理間的均值進(jìn)行差異顯著性分析。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析及Duncan’s 多重比較（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不定根發(fā)生過程分析

以濕地松4 年生母株上扦插穗條為初始材料（圖1A）進(jìn)行不定根誘導(dǎo)，通過每隔5 天取樣動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，濕地松生根處理20 天時(shí)，莖切口愈合（圖1B），45 天時(shí)形成不定根（圖1C）。同時(shí)，生根處理45 天后觀察到大量莖基部愈傷化程度嚴(yán)重的無根苗（圖1D）。通過顯微結(jié)構(gòu)觀測(cè)證明，濕地松無潛伏根原基（圖1E），生根處理20天，在維管形成層誘導(dǎo)產(chǎn)生根原始體細(xì)胞（圖1F，黃色箭頭所示），在生根處理45 天時(shí)發(fā)育形成不定根（圖1G）。而生根處理45 天的無根苗中也發(fā)現(xiàn)了根原始體細(xì)胞團(tuán)（黃色箭頭所示），但其周圍薄壁細(xì)胞中出現(xiàn)大量染色為紅色的栓化或脂質(zhì)化物質(zhì)（圖1H）。為進(jìn)一步確證根莖細(xì)胞發(fā)育過程，在高倍高清油鏡顯微觀測(cè)下，根原始體細(xì)胞（紅色箭頭所示的具有增大細(xì)胞核的細(xì)胞）在生根處理20 天產(chǎn)生（圖1J），而生根處理45 天在有根與無根苗中均誘導(dǎo)出了根原始體，但在無根苗的根莖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大量脂性物質(zhì)（綠色箭頭所示，圖1K～1L）。上述結(jié)果表明，扦插生根處理20 和45天，可分別作為濕地松扦插苗根原基發(fā)生與不定根形成兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)期。同時(shí)，根莖細(xì)胞中代謝物質(zhì)積累與濕地松不定根發(fā)育和形成密切相關(guān)。

2.2 內(nèi)源激素水平變化

內(nèi)源激素與不定根形成及植物代謝物質(zhì)積累緊密關(guān)聯(lián)。根據(jù)生長(zhǎng)素（IAA）、細(xì)胞分裂素（ZR）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GAs）四大類內(nèi)源性激素在濕地松不定根形成中檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IAA、ABA、GAs 水平隨生根過程不同而變化，而ZR 水平變化不大。其中，IAA 先下降后上升、GAs 與之相反呈先上升后下降趨勢(shì)，ABA 則隨生根時(shí)間延長(zhǎng)而增加。說明，IAA、ABA、GAs 顯著影響著濕地松不定根產(chǎn)生。根據(jù)生根處理45 天有根與無根苗中內(nèi)源性激素水平的差異分析結(jié)果來看，IAA、ABA、ZR 無顯著差異，而無根苗中GAs 水平顯著高于有根苗。這暗示了，高濃度的內(nèi)源GAs 與濕地松不定根形成困難密切相關(guān)。

2.3 PBZ 促根性分析

圖2 濕地松不定根生根過程中內(nèi)源激素水平變化Fig.2 Endogenous hormone levels during adventitious rooting in Pinus elliottii

從有根與無根中內(nèi)源性激素水平的分析來看，GAs 顯著影響濕地松不定根的形成。以GAs 生物合成抑制劑多效唑（PBZ）為促根劑在扦插20 天后噴施插穗針葉，分析PBZ 對(duì)濕地松不定根發(fā)育的促進(jìn)性。由圖3 可知，相較未施用PBZ 對(duì)照處理（0 mg/L PBZ），施用50 mg/L PBZ 能明顯改善插穗生根率與根系質(zhì)量，生根率和根系條數(shù)分別增加了63.0%和90.6%，但過高濃度PBZ（100 mg/L）較對(duì)照降低了20.5%和62.5%。說明，PBZ 能提升濕地松插穗生根能力，具有較強(qiáng)的促根性，但其使用濃度應(yīng)控制在一個(gè)適度范圍。

圖3 PBZ 對(duì)濕地松不定根發(fā)育的促根性Fig.3 Promotive effects of PBZ on adventitious root development in Pinus elliottii

3 結(jié)論與討論

生根解剖構(gòu)造觀察結(jié)果證明，濕地松無潛伏根原基，不定根通過由誘導(dǎo)根原始體發(fā)育形成。無潛伏根原基是植物生根困難的關(guān)鍵原因[11]。研究發(fā)現(xiàn)，植物不定根大多源于維管形成層[12-13]，在維管形成層中可直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根原始體[14-16]。從植物細(xì)胞功能來看，維管形成層細(xì)胞分裂分化能力強(qiáng)，易被誘導(dǎo)、分化[17]。從本試驗(yàn)研究結(jié)果來看，濕地松不定根誘導(dǎo)處理20 天，在維管形成層誘導(dǎo)產(chǎn)生了具有明顯增大細(xì)胞核的不定根原始體。之后，在生根處理45 天時(shí)隨著不定根原基細(xì)胞進(jìn)一步分裂分化而發(fā)育成為不定根。與馬尾松P. massoniana、核桃Juglans regia、毛白楊Populus tomentosa等難生根木本植物相比，濕地松不定根發(fā)生部位相似[12-13,18]。在濕地松有根與無根苗中，均發(fā)現(xiàn)了大量誘導(dǎo)產(chǎn)生的根原基細(xì)胞團(tuán)，但無根苗皮層及韌皮薄壁細(xì)胞中積累了大量脂性物質(zhì)，從而可能形成了一種機(jī)械性障礙，阻礙了根原基細(xì)胞團(tuán)進(jìn)一步發(fā)育成為不定根。這說明，今后濕地松不定根再生要從不定根發(fā)生（根原基誘導(dǎo)）與形成（根原基發(fā)育）兩個(gè)階段進(jìn)行考慮，尤其后者將直接影響著根系再生效果。

從本試驗(yàn)濕地松插穗生根過程中IAA、ABA、ZR 和GAs 4 種內(nèi)源激素水平的變化來看，IAA、ABA 和GAs 與濕地松不定根誘導(dǎo)密切相關(guān)，其中GAs 影響根原基發(fā)育。作為植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，激素在不定根誘導(dǎo)中起到關(guān)鍵性作用[6-7]。通過分析IAA、ABA 和GAs 水平在濕地松不同生根時(shí)期的變化，能較好地反映內(nèi)源激素在濕地松不定根再生中的作用。對(duì)IAA 而言，先下降后上升變化模式說明低水平IAA 利于根原基誘導(dǎo)，而高水平IAA 能促進(jìn)不定根發(fā)育與形成；ABA 直線上升趨勢(shì)說明高水平的ABA 利于濕地松不定根的再生；GAs 先上升后下降，說明GAs 在濕地松不定根再生中早期能促進(jìn)不定根原基產(chǎn)生，但后期不利于不定根形成，在濕地松生根中存在雙重作用，而生根處理45 天無根苗中高水平的GAs 也揭示了GAs 對(duì)濕地松不定根發(fā)育的潛在抑制性。為觀察GAs 在濕地松不定根發(fā)育中的作用，本試驗(yàn)采用一種被廣泛使用的GAs 生物合成抑制劑多效唑（PBZ）[19-20]作為促根劑，在誘導(dǎo)出根原基后通過噴施針葉促根發(fā)育。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，在50 mg/L PBZ 作用下濕地松4 年生母株插穗生根率和根條數(shù)均顯著增加，說明GAs 在濕地松不定根發(fā)育中具有抑制性，外源性PBZ 能提升濕地松生根能力。

綜上所述，建議濕地松不定根誘導(dǎo)可采用兩步法，早期（扦插0～20 天）生根培養(yǎng)中可使用由生長(zhǎng)素、赤霉素和脫落酸組成的一種復(fù)合型外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，后期（扦插21～45 天）培養(yǎng)中則使用多效唑。根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道，松樹生根能力有著顯著的遺傳基礎(chǔ)與生理年齡效應(yīng)[4-5,21]，因此添加的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度應(yīng)根據(jù)材料來源（種源、家系、無性系）與材料類型（幼齡、成熟齡）進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。