高效反硝化細菌馴化培養(yǎng)及其包埋填料低溫條件下應用性能研究

＊周亞坤

（北京市市政工程設計研究總院有限公司 北京 100082）

氮的高效穩(wěn)定去除仍是目前污水處理領域熱點問題之一[1-3]，大多數(shù)污水廠目前采用活性污泥法處理污水[4]，其反硝化處理能力雖基本滿足要求，但仍存在著較大的提升空間[5]，尤其在冬季低溫條件下污水廠的反硝化脫氮效果較差。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，通過有效反硝化細菌數(shù)量的增加來提高反硝化效率是有效的技術途徑[6-8]。因此快速馴化培養(yǎng)出高效反硝化脫氮菌群，并利用包埋固定化技術[9]將其制作成生物活性填料，投放到反硝化功能池中，可以有效提高反硝化菌群的數(shù)量及活性[10]，從而提高污水處理廠冬季低溫條件下的脫氮能力。

目前已有針對高效反硝化細菌馴化培養(yǎng)的研究，多為特定功能菌屬的純菌擴增培養(yǎng)，菌種較為單一，抵抗外界環(huán)境條件的穩(wěn)定性不高。有研究通過序批式實驗已馴化出反硝化速率為300mg·(L·h)-1的高效反硝化細菌[11]，但對于細菌的馴化機理及脫氮性能的進一步提高仍需研究。有研究者系統(tǒng)地闡述了活性污泥的馴化機理[12-14]，但針對馴化成熟的高效菌應用性能未作研究。對于包埋反硝化填料的研究，多局限于實驗室配水條件下，應用于實際污水的脫氮性能研究較少。有學者將反硝化填料應用于二級出水脫氮的研究[15]，但其所用菌源未經(jīng)馴化培養(yǎng)，填料的脫氮性能較為低下。

本文實驗以具有較高生物多樣性的活性污泥為菌源，以具有底物多樣性特點的乙酸鈉作為碳源，采用流加-間歇式培養(yǎng)方法（連續(xù)進藥，間歇排水），梯度提高硝酸鹽負荷[16]，對反硝化細菌進行馴化培養(yǎng)，得到了高效穩(wěn)定的廣譜性反硝化脫氮菌群[17]，通過細菌固定化技術制作成包埋反硝化填料[18]，在冬季低溫條件下對不同濃度的市政污水表現(xiàn)出了良好的脫氮性能。

1.材料與方法

(1)實驗水質及分析方法

以北京某污水處理廠二沉池回流污泥為菌源，實驗用水為人工模擬硝酸鹽廢水，硝酸鉀提供氮源，乙酸鈉提供碳源，KH2PO4提供反硝化細菌所需要的磷，氮源和碳源的投加量隨反硝化速率的增加而提高，同時每升進水中加1.25mL微量元素[19]，微量元素的組成如表1所示。

表1 微量元素組成表

依據(jù)標準分析法[20]測定NO2--N、NO3--N、COD、污泥濃度（MLSS）、溫度（T）、pH，其中NO2--N、NO3--N分別采用N-（1-萘基）乙二胺光度法和紫外分光光度法（UV-1600PC，MAPADA），COD值采用連華科技快速測定法，MLSS采用濾紙烘干稱重法測定，溫度使用溫控器探頭測定，pH利用在線儀表監(jiān)測。

(2)流加-間歇式培養(yǎng)方法的建立

反應器主體為304不銹鋼水箱，總體積為200L，配有一臺雙槳攪拌裝置（轉速范圍：0～250r/min可調），pH探頭連接自控裝置，通過控制蠕動泵向反應器內投加稀硫酸（pH：3.5±0.5），調節(jié)反應體系酸堿平衡，加熱環(huán)連接溫控裝置維持反應器內溫度恒定。

實驗采用流加-間歇的運行模式，即連續(xù)進藥，周期結束后將上清液排出。每個運行周期為10h，其中流加進水周期為8h，靜置排出上清液時間為2h。以出水TN（NO3-和NO2-）濃度接近零為指示標準，逐步提高進水的NO3--N濃度，從而刺激反硝化細菌的生長。流加-間歇的培養(yǎng)方式，可有效解決反硝化過程中因污泥上浮而引起的細菌流失問題，同時還可以控制反應器內的COD濃度，阻止其他異養(yǎng)菌搶奪反硝化所需碳源，并實現(xiàn)其他異養(yǎng)菌、硫酸鹽還原菌、水解酸化細菌等的大量生長，控制反應器內溫度在26±1℃，利用pH探頭連接自控裝置控制反應器內pH為7.4±1，連續(xù)運行反應器至單位質量污泥的反硝化速率趨于動態(tài)平衡，連續(xù)運行34d。

(3)微生物菌群結構分析

通過高通量測序手段對不同馴化階段的污泥樣品進行菌群結構檢測分析，實驗共選取3個樣品，每個樣品的選取時間如表2所示。

表2 各樣品選取情況統(tǒng)計

利用OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit從樣本中提取DNA，針對細菌16SrRNA的V3-V4區(qū)基因進行PCR擴增測序，引物設計為V3-V4通用引物：341F引物（CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG）和805R引物（GACTGGAGTTCCTTGGCAC CCGAGAATTCCA），共進行兩輪擴增。PCR擴增結束后，利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，然后通過Illumina Hiseq2500 PE250平臺進行高通量測序，測序數(shù)據(jù)利用 MEGAN 軟件進行環(huán)境微生物的16S分析，可分別得到每個樣本對應的優(yōu)質序列，根據(jù)序列之間的相似性，將各序列分成不同的聚類操作分類單元（OTUs），最后對OTUs結果進行分析計算。

(4)包埋反硝化填料應用性能研究

為有效提高冬季低溫條件下（9～11℃），污水廠反硝化過程的脫氮性能，利用細菌包埋技術，將馴化成熟的高效反硝化細菌制作成包埋填料，考察其在冬季低溫條件下對于市政污水中TN（NO3-和NO2-）的去除能力。實驗以北方某污水處理廠二級出水為原水，其TN濃度約為25mg·L-1，通過連續(xù)流反應裝置研究包埋反硝化填料在冬季低溫條件下的脫氮能力。

2.結果與討論

(1)廣譜性高效反硝化細菌的馴化培養(yǎng)

①反硝化速率與進水NO3-濃度變化關系

從圖1可以看出隨著進水NO3-濃度不斷增大，反硝化速率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。培養(yǎng)初期，由于污泥體系中異養(yǎng)菌較為豐富，與反硝化細菌存在碳源的競爭，故反硝化速率增長較為緩慢。從第8d開始反硝化速率增長速度明顯加快，呈現(xiàn)對數(shù)增長趨勢，這說明反硝化細菌的菌群優(yōu)勢逐步建立，經(jīng)過34d的培養(yǎng)，反硝化速率最終達到了546.34mg·(L·h)-1，并趨于穩(wěn)定，此時反應體系中反硝化細菌的生長代謝形成動態(tài)平衡，反硝化細菌菌群優(yōu)勢形成。流加-間歇式培養(yǎng)反硝化細菌，NO3-與COD同時加入反應器，有效控制了反應體系中的COD濃度，從而抑制了其他異樣菌的生殖，保證了污泥體系的穩(wěn)定。

圖1 反硝化速率與進水NO3-負荷、出水TN之間的關系

②污泥濃度與比反硝化速率變化分析

從圖2可以看出前4d污泥濃度的增長較為緩慢，這是由于培養(yǎng)啟動階段體系中的好氧型細菌消亡所致，從第5d開始MLSS增長率有了明顯提升，同時比反硝化速率（單位質量污泥反硝化速率）也開始明顯提高，這表明反硝化細菌開始逐步適應馴化條件，并在菌群結構中逐漸占據(jù)一定優(yōu)勢，比反硝化速率最高可達到60.66mg·(g·h)-1，這表明馴化成熟的污泥體系不僅反硝化功能菌的數(shù)量得到了擴增，單位質量污泥的脫氮性能也得到了增強。

圖2 污泥濃度與比反硝化速率變化關系

③微生物群落結構多樣性變化分析

微生物結構多樣性變化是活性污泥體系對馴化條件做出的進一步調整，通過高通量測序可有效反應不同培養(yǎng)階段微生物多樣性的變化。表3為樣品多樣性指數(shù)統(tǒng)計表，本研究共選取了3個樣品，所有樣本的Coverage指數(shù)均在0.93以上，這表明測序比較全面的覆蓋了所有物種，保證了測序的有效性。

表3 不同階段微生物多樣性統(tǒng)計

如表3所示，通過測序從3個樣本中得到了61740、38239、71166條優(yōu)質序列，分別被分為了6216、1496、4465個OTUs（操作分類單元）。Shannon指數(shù)可有效反應樣本中微生物的多樣性，Shannon值越大，說明群落多樣性越高。Sample0到ZYK-4，樣本的Shannon指數(shù)從6.49降低到了2.61，這說明原始污泥具有較大的微生物菌群多樣性，隨著進水負荷的不斷提高，污泥體系的多樣性呈現(xiàn)出遞減趨勢，這表明高硝酸鹽濃度的水質條件對微生物菌屬進行選擇，同時微生物菌群為適應馴化條件而不斷做出適應性調整。其中反硝化菌群能夠適應并生存下來，不適應的菌屬受到抑制或被淘汰出污泥體系。從微觀層面來看，高效反硝化細菌的馴化過程，即為馴化條件對污泥中微生物菌群進行選擇的過程。

④微生物菌群結構變化分析反硝化菌屬種類十分繁多，已有50多個屬和130多個種被報道[22-23]。反硝化功能菌群結構變化是活性污泥馴化更高一級的適應性調整，表4統(tǒng)計了各樣品中微生物在屬分類水平上的豐度變化情況，可以明顯看出在馴化條件的影響下，微生物菌群結構發(fā)生了明顯的適應性變化。

表4 不同培養(yǎng)階段微生物優(yōu)勢菌屬統(tǒng)計

其中豐度變化明顯的Thauera和Pseudomonas，兩者均為污水處理中較為常見的反硝化菌屬[24]，且在培養(yǎng)過程中豐度較高。Thauera是Betaproteobacteria綱下的一類具有反硝化能力的革蘭氏陰性細菌，且具有降解多種芳香族污染物能力，Paracoccus菌屬已被Baker S C正式描述為反硝化副球菌屬[25]，屬內存在異養(yǎng)硝化型細菌分支，說明了污泥體系具備一定的氨氮去除能力。

如表4所示，原始污泥樣本中反硝化主要功能菌屬Thauera豐度僅為2.85%，經(jīng)過馴化培養(yǎng)，兩種反硝化功能菌屬Thauera和Pseudomonas分別達到了26.87%和42.99%，擴大了近25倍，成為了污泥中的絕對優(yōu)勢菌群，同時具有反硝化功能的菌群多樣性得到了提升，如具有反硝化功能的Paracoccus（12.58%）較活性污泥也有了明顯提升。如圖3所示，反硝化同功菌群的結構也在不斷的發(fā)生變化，隨著馴化濃度的提高，Thauera最終取代Pseudomonas成為菌群中的優(yōu)勢菌屬。由此可以看出通過馴化培養(yǎng)，污泥體系中具有反硝化功能的菌群結構發(fā)生了明顯變化，但反硝化功能菌群的豐富有了明顯的提升，這也是污泥反硝化性能保持高效且穩(wěn)定的原因。

圖3 不同培養(yǎng)階段微生物群落結構變化（屬水平）分析

(2)低溫條件下包埋反硝化細菌填料應用性能分析

冬季低溫條件下污水廠生物脫氮單元普遍存在細菌活性較差，脫氮性能不高等問題，為考察馴化成熟的反硝化細菌對低溫條件下市政污水的實際脫氮效果，將馴化后的污泥離心濃縮至含水率為85%，將其與質量分數(shù)為15%的PVA凝膠混合成包埋液，將包埋液均勻涂裝在圓柱形條狀載體上，在過飽和的硼酸溶液中交聯(lián)，最后切成1cm長度的筒狀填料，分裝于懸浮填料球中。

①對低氮濃度市政污水的脫氮性能分析

由圖4可以看出，冬季低溫條件下污水廠二級出水中約含有25mg·L-1的TN，在運行前初期包埋反硝化填料對TN的去除率增長較為緩慢，從第5d開始填料開始逐步適應二級出水水質，對TN的去除率表現(xiàn)出較快的增長，經(jīng)17d左右的運行，出水TN可降至5mg·L-1以下。運行過程中，填料對二級出水中COD的利用率最高可達67.51%，這有效降低了深度處理單元碳源的投加量。由此不難看出，對于低氮濃度的二級出水，包埋反硝化填料能夠保持良好的脫氮性能，這對于強化污水廠二級出水的脫氮效果具有重要意義。

圖4 包埋反硝化填料強化二級出水脫氮性能分析

3.結論

以污水廠回流污泥為菌源，通過流加-間歇的培養(yǎng)方式梯度提高硝酸鹽負荷，得到了去除速率為546.34mg·(L·h)-1的高效反硝化脫氮菌群。

高通量測序研究發(fā)現(xiàn)馴化條件使原始活性污泥多樣性顯著降低，但豐富了反硝化同功菌群結構的多樣性，其中Thauera和Pseudomonas變化較為明顯，豐度由2.85%達到了69.86%，最終形成了同具反硝化功能但種類不盡相同的廣譜性反硝化菌群，與馴化條件形成了新的動態(tài)平衡，這為細菌及填料高效穩(wěn)定的脫氮性能奠定了基礎。

冬季低溫條件下，包埋反硝化填料可使污水廠二級出水TN穩(wěn)定在5mg·L-1以下，這對提升污水廠冬季對于市政污水的脫氮能力具有重要的參考意義。