血人參提取物及其制劑對(duì)半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉致衰老小鼠模型抗氧化能力的影響*

何金英，成 雪，楊 露，繆艷燕，2，張永萍，2，3▲，段 麗

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；2國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；3貴州省中藥民族藥炮制與制劑工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；4國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司；貴州 貴陽(yáng) 550025)

血人參是豆科蝶形花亞科植物茸毛木藍(lán)(IndigoferastaclrvoidesLindl.)的干燥根，為貴州苗族常用藥，又名雪人參，《貴州民間方藥集》中稱為鐵刷子，《云南中草藥》中稱其為紅苦刺、山紅花。其性溫，味微苦澀，有補(bǔ)氣攝血、滋陰補(bǔ)腎之功效，主治崩漏、跌打、風(fēng)濕、肝硬化、痢疾及疳積等[1]。血人參植物主要含有揮發(fā)油、黃烷醇、甾醇體類等活性化學(xué)成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂、保肝、抗癌、抑菌、抗病毒等作用[2-5]，其提取物乙酸乙酯部位也具有較強(qiáng)的抗氧化活性[6]。以血人參為主藥的芪膠升白膠囊，由血人參、大棗、阿膠、淫羊藿等中藥組成，具有提高免疫力、抗腫瘤、抗疲勞、抗病毒等作用，用于白血病、癌癥、腫瘤的治療[7]。本研究采用D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉誘導(dǎo)衰老小鼠的模型進(jìn)行研究，從抗氧化方面探索苗藥血人參提取物、芪膠升白膠囊對(duì)機(jī)體的抗衰老作用，為血人參及其制劑以后的研究開發(fā)及臨床應(yīng)用奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)別KM小鼠，雄性，體重18～22 g，購(gòu)自重慶騰鑫生物科技有限公司(許可證號(hào)：SCXK(軍)2012-0011)。

1.2 藥物與試劑

血人參乙酸乙酯部位(YSYZ)；芪膠升白膠囊(QJ，貴州德昌祥藥業(yè)有限公司，批號(hào)：25270051)；MDA檢測(cè)試劑盒(深圳子科生物科技有限公司，批號(hào)：20171210)；SOD檢測(cè)試劑盒(深圳子科生物科技有限公司，批號(hào)：20171210)；GSH-Px檢測(cè)試劑盒(深圳子科生物科技有限公司，批號(hào)：20171210)；0.9%氯化鈉注射液(貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)：E117081704)；亞硝酸鈉(四川金山制藥有限公司，批號(hào)：170801)；VitE片(湯臣倍健股份有限公司，批號(hào)：20160401D)；D-半乳糖(BeiJingsolarbio，Lot-No：0902c052，EXP：20211109)。

1.3 主要儀器

Sorvall ST 40離心機(jī)(賽默飛)；ELX800型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)GE公司)； tissuelyser-19型組織勻漿機(jī)(上海凈信科技)；移液器(德國(guó) Eppendorf 公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制)。

1.4 小鼠衰老模型建立及藥物干預(yù)

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，用水迷宮每天訓(xùn)練一次，前5次進(jìn)行訓(xùn)練，第6次進(jìn)行篩選，選出能在60 s內(nèi)找到平臺(tái)的為合格小鼠，隨機(jī)分為9組；造模與給藥同時(shí)進(jìn)行，正常組每天采用生理鹽水皮下注射聯(lián)合腹腔注射，并用生理鹽水進(jìn)行灌胃；模型組采用皮下注射150 mg·kg-1D-半乳糖聯(lián)合腹腔注射50 mg·kg-1亞硝酸鈉構(gòu)建小鼠衰老模型[8-11]，陽(yáng)性對(duì)照VitE組造模后灌胃0.75 g·kg-1VE，芪膠升白膠囊高、中、低劑量組造模后分別灌胃2 g·kg-1、1 g·kg-1、0.5 g·kg-1芪膠升白膠囊，血人參乙酸乙酯部位高、中、低劑量組造模后再分別灌胃0.33 g·kg-1、0.17 g·kg-1、0.08 g·kg-1血人參乙酸乙酯部位藥液，第7周時(shí)進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，所有樣品均溶于生理鹽水，連續(xù)8周。

1.5 各組小鼠每周體重的測(cè)量

在實(shí)驗(yàn)期間，每周利用電子天平測(cè)量小鼠體重，連續(xù)8周。

1.6 各組小鼠臟器指數(shù)的計(jì)算

小鼠連續(xù)8周給藥后，通過(guò)頸椎脫位方法處死小鼠，分離臟器組織，采用生理鹽水沖洗后稱其質(zhì)量，測(cè)定臟器指數(shù)。小鼠臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量。

1.7 觀察各組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)后潛伏期

造模給藥的第7周各組小鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)時(shí)將大鼠面向水池壁放入水池中沒(méi)有躲避平臺(tái)的象限區(qū)域，記錄大鼠出水時(shí)間(潛伏期)。

1.8 各組小鼠血清及各臟器組織中SOD、GSH-Px活性及MDA水平檢測(cè)

小鼠連續(xù)8周給藥后，摘眼球取血，血液經(jīng)10000 r/min、4 ℃離心10 min，分離血清置于-80 ℃保存，制備肝、心、腎、腦10%的組織勻漿液，1000 r/min，離心10 min后取上清液，采用ELISA法參照試劑盒說(shuō)明書要求檢測(cè)血清及各臟器組織中SOD、GSH-Px活性及MDA水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠體重的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)前各實(shí)驗(yàn)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，造模2周后，與正常組比較，模型組小鼠體重減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，除乙酸乙酯高劑量組外，其余實(shí)驗(yàn)組小鼠體重增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)4周后，各組小鼠體重增長(zhǎng)無(wú)明顯差異。實(shí)驗(yàn)6周，與正常組比較，模型組小鼠體重減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，除乙酸乙酯高劑量組外，其余實(shí)驗(yàn)組小鼠體重較大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)8周，與正常組比較，模型組與血人參乙酸乙酯部位中劑量組小鼠體重較輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，各實(shí)驗(yàn)組小鼠體重較重，其中乙酸乙酯部位高劑量組、芪膠升白膠囊高低劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果如表1所示。

表1 小鼠體重的比較Tab.1 Comparison of the body weight of the mice

2.2 對(duì)小鼠各臟器指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝、心、腎、腦、胸腺、脾指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果如表2所示。

表2 小鼠各臟器指數(shù)的比較Tab.2 Comparison of the organ indexes of the mice

2.3 對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分組時(shí)，各組水迷宮實(shí)驗(yàn)中潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；造模6周后，與正常組比較，模型組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)中潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性藥物組、血人參乙酸乙酯部位中低劑量組、芪膠升白膠囊高低劑量組潛伏期明顯縮短(P<0.05)。表明血人參、芪膠升白膠囊對(duì)D-半乳糖所致的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低有一定的抑制作用。結(jié)果如表3所示。

表3 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較Tab.3 Comparison of the learning and memory ability of the mice

2.4 對(duì)小鼠血清及各臟器組織中SOD活性的影響

與正常組比較，模型組衰老小鼠血清及各臟器組織中SOD活性極顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，血人參乙酸乙酯部位除腦、腎臟及心臟組織的低劑量組及血清的中、低劑量以外，其余各劑量組血清及臟器組織中的SOD活性極顯著提高(P<0.01)；芪膠升白膠囊高、中劑量組能極顯著提高衰老小鼠腦、腎臟及肝臟組織中的SOD活性(P<0.01)，同時(shí)高劑量組能極顯著提高血清與心臟組織中的SOD活性(P<0.01)，中劑量組能顯著提高心臟組織中的SOD活性(P<0.05)。與陽(yáng)性藥VitE組比較，血人參乙酸乙酯部位除血清與腦組織中、低劑量組以及心臟與肝臟低劑量組外，其余各劑量組均極顯著提高血清與心臟組織中的SOD活性(P<0.01)；芪膠升白膠囊高、中劑量組均能極顯著提高腦組織、腎臟及肝臟組織中的SOD活性(P<0.01)，芪膠升白膠囊高劑量組能極顯著提高血清中的SOD活性(P<0.01)，芪膠升白膠囊高、中、低劑量組分別能顯著提高心臟、血清及腎臟組織中的SOD活性(P<0.05)。結(jié)果如圖1所示，表明血人參及制劑能提高衰老小鼠血清及各臟器組織中的SOD活性。

圖1 血人參及制劑對(duì)衰老小鼠血清及各臟器組織中SOD活性的影響Fig.1 Effect of Indigofera staclrvoides extract and its preparationon the SOD activity in serum and organs of the aging mice

2.5 對(duì)小鼠血清及各臟器組織中GSH-Px活性的影響

與正常組比較，模型組衰老小鼠血清及各臟器組織中GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，除肝臟組織中、低劑量組外，血人參乙酸乙酯部位與芪膠升白膠囊各劑量組均能極顯著提高衰老小鼠血清及各臟器組織中GSH-Px活性(P<0.01)。與陽(yáng)性藥VitE組比較，血人參乙酸乙酯部位除了肝臟組織低劑量組，各劑量組均能極顯著提高衰老小鼠血清及各臟器組織中GSH-Px活性(P<0.01)，其中高、低劑量組能顯著提高腦組織中GSH-Px活性(P<0.05)，低劑量組能顯著提高心臟組織中GSH-Px活性(P<0.05)；芪膠升白膠囊除肝臟組織低劑量組外，其余各劑量組均能顯著提高衰老小鼠血清及各臟器組織中GSH-Px活性(P<0.05)，其中高、中劑量組極顯著提高腦組織與心臟組織中GSH-Px活性(P<0.01)，高、中、低劑量組極顯著提高血清與腎臟組織GSH-Px活性(P<0.01)。結(jié)果如圖2所示，表明血人參及制劑能提高衰老小鼠血清及各臟器組織中GSH-Px活性。

圖2 血人參及制劑對(duì)衰老小鼠血清及各臟器組織中GSH-Px活性的影響Fig.2 Effect of Indigofera staclrvoides extract and its preparationon the GSH-Px activity in serum and organs of the aging mice

2.6 對(duì)小鼠血清及各臟器組織中MDA含量的影響

與正常組比較，模型組衰老小鼠心臟與肝臟組織中MDA含量極顯著升高(P<0.01)，血清與肝臟組織中MDA含量顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，血人參乙酸乙酯部位與芪膠升白膠囊高、中、低劑量組均能極顯著降低心臟組織中MDA含量(P<0.01)，高、中劑量組極顯著降低腎臟組織中MDA含量(P<0.01)；芪膠升白膠囊高劑量組顯著降低肝臟組織中MDA含量(P<0.05)。與陽(yáng)性藥VitE組比較，血人參乙酸乙酯部位與芪膠升白膠囊高、中、低劑量組對(duì)血清與腦組織中MDA含量均無(wú)顯著影響(P>0.05)，而高、中劑量組均能極顯著降低腎臟組織MDA含量(P<0.01)；血人參高、中、低劑量組能極顯著降低心臟組織MDA含量(P<0.01)，且高劑量組能極顯著降低肝臟組織MDA含量(P<0.01)；芪膠升白膠囊高、中劑量組能極顯著降低肝臟組織MDA含量(P<0.01)，高劑量組能極顯著降低肝臟組織MDA含量(P<0.01)，中、低劑量組分別能顯著降低肝臟與心臟組織中MDA含量(P<0.05)。結(jié)果如圖3所示，表明血人參及制劑能降低衰老小鼠肝臟、腎臟與心臟組織中MDA含量。

圖3 血人參及制劑對(duì)衰老小鼠血清及各臟器組織中MDA含量的影響Fig.3 Effect of Indigofera staclrvoides extract and its preparationon the MDA content in serum and organs of the aging mice

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用KM小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以D-半乳糖皮下注射聯(lián)合亞硝酸鈉腹腔注射制備衰老模型。研究表明[12-15]，腹腔注射亞硝酸鈉進(jìn)入體內(nèi)后使血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，失去攜帶氧的能力，引起組織器官缺氧受損、大腦記憶與行為障礙；皮下注射D-半乳糖后，在體內(nèi)其代謝產(chǎn)物半乳糖醇不能被進(jìn)一步代謝，在細(xì)胞內(nèi)堆積致細(xì)胞腫脹與代謝紊亂，活性氧水平升高，機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量自由基致神經(jīng)元損傷及抗氧化酶活性降低導(dǎo)致衰老。在機(jī)體中SOD和GSH-Px是重要的抗氧化酶，具有清除自由基從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用[16-17]，MDA是由自由基誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化作用生成的毒性產(chǎn)物，可反映機(jī)體被自由基攻擊的損傷程度[18]。因此本研究采用D-半乳糖皮下注射聯(lián)合亞硝酸鈉腹腔注射制備記憶力低下、行為障礙、組織與器官功能性退化及抗氧化能力降低的小鼠衰老模型，與人整體衰老相似；以小鼠體重、臟器指數(shù)、小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、SOD活性、GSH-Px活性與MD含量為檢測(cè)指標(biāo)，從抗氧化方面研究血人參提取物與芪膠升白膠囊的抗衰老作用。

模型組小鼠體重在造模后均低于其他組，表明D-半乳糖和亞硝酸鈉聯(lián)合注射可抑制小鼠體重正常生長(zhǎng)，血人參乙酸乙酯部位與芪膠升白膠囊可改善衰老小鼠體質(zhì)量。大量的D-半乳糖可使小鼠胸腺萎縮[19]，本實(shí)驗(yàn)中模型組和芪膠升白膠囊低劑量組胸腺指數(shù)低于正常組，其余各組的各臟器指數(shù)均無(wú)顯著性差異，表明芪膠升白膠囊對(duì)小鼠各臟器指數(shù)無(wú)明顯影響。通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果顯示血人參乙酸乙酯部位與芪膠升白膠囊可增強(qiáng)衰老的小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。根據(jù)血清、腦及各臟器中SOD、MDA、GSH-Px檢測(cè)結(jié)果顯示，芪膠升白膠囊和血人參乙酸乙酯部位高、中劑量組均能增高血清、腦、心、肝、腎中SOD及GSH-Px的活性，高于模型組與陽(yáng)性藥物組；血人參乙酸乙酯部位及芪膠升白膠囊各劑量組血清和各臟器中MDA含量低于模型組，其中高、中劑量組低于陽(yáng)性藥物組。

血人參乙酸乙酯部位及芪膠升白膠囊具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可增加抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成，降低各組織中MDA含量，延緩機(jī)體衰老。本實(shí)驗(yàn)利用D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉致小鼠衰老模型，并用血人參乙酸乙酯部位及芪膠升白膠囊進(jìn)行干預(yù)，證明了其能抑制小鼠衰老，有利于進(jìn)一步研究臨床藥效作用及抗衰老作用機(jī)制。