重度再生障礙性貧血患者外周血IL-2、IL-18、CD34+細胞表達及其預(yù)后相關(guān)性

高慧，何婷婷，高玲

（1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，河南 洛陽471000；2.洛陽市第五人民醫(yī)院精神一科，河南 洛陽471000；3.河南省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，河南 鄭州450000）

再生障礙性貧血（Aplastic anemia，AA）是一種以骨髓造血干細胞增生能力低下、 外周血全血細胞減少為主的獲得性骨髓造血功能衰竭性疾病[1-2]。AA 可分為遺傳和獲得性兩類， 又可分為重型AA（SAA）和非重型AA（NSAA）。 SAA 病情進展迅速，預(yù)后兇險，其發(fā)病機制尚不明確，有學(xué)者認為與細胞免疫異常有關(guān)， 細胞免疫異?？梢l(fā)造血功能衰竭，另外Th1 細胞過度表達時可導(dǎo)致AA 發(fā)生[3]。白細胞介素-18（Interleukin-18，IL-18）是T 細胞炎癥的誘導(dǎo)因子，可通過刺激Th1 細胞過度表達，導(dǎo)致免疫紊亂[4]。 有研究顯示，外周血T 淋巴細胞被異?；罨螅僧a(chǎn)生抑制造血的細胞因子，如白細胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）等[5]。 造血干細胞是各種血細胞和免疫細胞的起始細胞， 具有多向分化和自我復(fù)制的能力[6]。 正常情況下，機體內(nèi)造血干細胞的多向分化能力和自我復(fù)制能力是處于動態(tài)平衡的，一旦平衡被打破，機體的造血系統(tǒng)將發(fā)生嚴重的疾病[7]。 CD34+抗原是造血干細胞表面的糖蛋白，當(dāng)機體造血功能出現(xiàn)損壞時，可導(dǎo)致骨髓中CD34+細胞向外周血遷移[8]。 目前有關(guān)IL-2、IL-18 和CD34+細胞表達與SAA 患者的預(yù)后關(guān)系的報道較少， 本研究擬探討三者對SAA 患者的預(yù)后評估價值，旨在為預(yù)估患者預(yù)后，及時調(diào)整治療方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2016 年1 月至2018 年1 月本院收治的SAA 患者60 例為研究對象（SAA 組），男32 例， 女28 例， 年齡15~55 歲， 平均年齡（37.85±9.72）歲。 納入標準：（1）符合《血液病診斷及療效標準》中SAA 的診斷標準，屬于獲得性AA[9]；（2）入院后經(jīng)骨髓涂片、骨髓活檢等檢查確診；（3）患者/患者家屬了解本次研究， 且已簽署同意書；（4）隨訪時間＞6 個月。排除標準：（1）患有自身免疫性疾??；（2）患有感染類疾?。唬?）合并嚴重心、肝、腎功能障礙疾病。 選擇同期在本院體檢的健康者60 例為對照組，男30 例，女30 例，年齡15~60 歲，平均年齡（42.18±11.65）歲。 患者及家屬同意簽署知情同意書和臨床研究協(xié)議書， 本研究通過本院倫理委員會批準，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑及儀器 IL-2 ELISA 試劑盒（貨號：SEA073Bo02）、IL-18 ELISA 試 劑 盒 （貨 號：SCA064Hu02）， 購自南京賽泓瑞生物科技有限公司；FACSCalibur 流式細胞儀，購自美國BD 公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集 對所有研究對象清晨空腹時采取靜脈血5~6 mL 裝于含乙二胺四乙酸（EDTA）采血管中，平均分成兩份，一份4℃，4000 r/min，離心8 min，留上清，凍存于-80℃冰箱中，待測；另一份直接凍存于-80℃冰箱中，待測。

1.3.2 檢測血清中IL-2、IL-18 水平 采用酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測血清中IL-2、IL-18 水平， 操作步驟嚴格依據(jù)IL-2 ELISA 試劑盒、IL-18 ELISA 試劑盒進行。IL-2 參考范圍為5~15 pg/mL，IL-18 參考范圍為5~ 200 ng/L。

1.3.3 CD34+細胞檢測 檢測所有研究對象外周血中CD34+細胞百分比。取出外周血樣品，4000 r/min離心8 min，分離出上層血漿成分，向試管中加入等體積的PBS 稀釋試管中成分， 再加入淋巴細胞分離液，繼續(xù)梯度離心，獲取外周血單個核細胞。加入藻紅蛋白 （PE） 標記的CD34 單抗20 μL 和PreCP 標記的CD45 單抗10 μL，4℃避光孵育30 min，加入450 μL 溶血素，室溫靜置30 min，混勻，采用流式細胞儀ProCOUNT 軟件檢測，獲得CD34+細胞百分比，參考范圍為0.5%~3.5 %。

1.4 隨訪 所有SAA 患者均接受隨訪，本次隨訪截止日期2020 年6 月。 通過打電話或復(fù)診的方式對所有患者均進行2 年隨訪。 根據(jù)隨訪情況將SAA患者分為預(yù)后良好組50 例和預(yù)后不良組10 例。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用軟件SPSS 25.0 對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料用n（%）表示，采用χ2檢驗。本研究數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布， 計量資料以平均值±標準差（±s）表示，兩組間行獨立樣本t 檢驗。 采用COX法分析影響SAA 患者不良預(yù)后的因素。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組和SAA 患者IL-2 和IL-18 水平及CD34+表達水平比較 與對照組相比，SAA 組患者IL-2 和IL-18 水 平 較 高，CD34+比 例 較 低 （P＜0.05），見表1。

表1 對照組和SAA 患者IL-2 和IL-18水平及CD34+表達水平比較（±s）

表1 對照組和SAA 患者IL-2 和IL-18水平及CD34+表達水平比較（±s）

組別 n對照組SAA 組t 值P 值60 60 IL-2(pg/mL) IL-18(ng/L)12.49±2.88 181.26±22.24 58.294 0.000 156.46±26.57 386.28±101.62 16.948 0.000 CD34+（%）1.08±0.42 0.22±0.08 15.581 0.000

2.2 預(yù)后不良與預(yù)后良好SAA 患者一般資料比較SAA 患者預(yù)后不良與預(yù)后良好組間性別、年齡、體重、病程、中性粒細胞、血小板數(shù)、網(wǎng)織紅細胞數(shù)、骨髓淋巴細胞數(shù)比較， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），見表2。

表2 預(yù)后不良與預(yù)后良好SAA 患者一般資料比較

2.3 預(yù)后不良與預(yù)后良好SAA 患者IL-2 和IL-18水平及CD34+表達水平比較 與預(yù)后良好組相比，預(yù)后不良組患者SAA 患者IL-2 和IL-18 水平較高，CD34+比例較低（P＜0.05），見表3。

表3 預(yù)后不良與預(yù)后良好SAA 患者IL-2 和IL-18 水平及CD34+表達水平比較（±s）

表3 預(yù)后不良與預(yù)后良好SAA 患者IL-2 和IL-18 水平及CD34+表達水平比較（±s）

組別 n預(yù)后良好組預(yù)后不良組t 值P 值50 10 IL-2(pg/mL) IL-18(ng/mL)156.34±17.64 296.38±35.12 18.967 0.000 174.29±25.94 431.67±96.83 16.518 0.000 CD34+（%）0.25±0.09 0.07±0.03 6.218 0.000

2.4 影響SAA 患者患者不良預(yù)后的COX 分析 單因素COX 分析顯示，IL-2、IL-18、CD34+均是影響SAA 患者預(yù)后的危險因素； 多因素COX 分析顯示，高水平IL-2、高水平IL-18 及低表達CD34+細胞是影響SAA 患者不良預(yù)后的危險因素 （HR=2.142，HR=2.086，HR=2.286，P＜0.05）。 見表4。

表4 影響SAA 患者不良預(yù)后的COX 分析

3 討論

據(jù)流行病學(xué)報道，AA 在中國每年的發(fā)病率是7.4/10 萬，男女發(fā)病率幾乎相等[10]。 SAA 是難治型血液疾病，可危及患者生命，我國為SAA 高發(fā)區(qū)[11]。目前SAA 在臨床上主要以免疫抑制法治療為主，雖然治療效果明顯， 但是仍然有大約30%的患者治療無效或出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)現(xiàn)象， 而長期給患者使用免疫抑制劑會容易使患者向腫瘤類疾病轉(zhuǎn)化[12]。因此在臨床上需要及早預(yù)測SAA 患者預(yù)后情況，調(diào)整治療方案。

在人體細胞免疫系統(tǒng)中，T 淋巴細胞是主要的效應(yīng)細胞；在AA 疾病發(fā)生、發(fā)展過程中，T 淋巴細胞扮演著重要角色[13-14]。 Th1 細胞與Th2 細胞之間表達平衡是機體免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素。 盧遠強等[15]研究認為骨髓造血功能被抑制主要與Th1 細胞與Th2 細胞之間平衡被打破有關(guān)， 隨著Th1 細胞過度表達，Th1 細胞分泌的細胞因子 （如IL-2、IFN-γ 等）含量升高，造血功能被抑制。 IL-2細胞抗原活化后產(chǎn)生的一種多效性細胞因子，主要由CD4+和CD8+T 細胞產(chǎn)生，以自分泌或旁分泌的方式參與免疫應(yīng)答[16]。 有研究發(fā)現(xiàn)IL-2 水平異常升高與免疫紊亂相關(guān)[17]。 IL-18 主要由巨噬細胞和Kupffer 細胞產(chǎn)生， 是一種多效性細胞因子，可參與調(diào)節(jié)先天性和獲得性免疫反應(yīng)。 以往研究顯示IL-18 具有抗腫瘤作用，其作用機制是通過抑制腫瘤血管生成、 增加腫瘤細胞毒性進而抑制腫瘤細胞生長[18]。 近年來發(fā)現(xiàn)IL-18 能作用于Th1 細胞， 已有研究認定在T 細胞和自然殺傷細胞中，IL-18 是IFN-γ 的誘導(dǎo)因子，可誘導(dǎo)IFN-γ 產(chǎn)生，并促進Th1 細胞極化[19]。 IL-18 可通過調(diào)節(jié)CD8+細胞毒性，導(dǎo)致骨髓造血細胞凋亡[20-21]。 本研究發(fā)現(xiàn)SAA 患者血清中IL-2、IL-18 水平顯著高于健康體檢者，且預(yù)后不良組顯著高于預(yù)后良好組，與Dutta A[22]、夏正萍等[17]研究顯示外周血IL-2 在獲得性AA 較正常對照者顯著升高相一致，提示IL-2、IL-18 可能與SAA 患者發(fā)生有關(guān)，對SAA 患者預(yù)后不良可能也具有一定的影響， 但對于具體作用機制仍需深入研究。

SAA 患者骨髓造血干細胞是T 細胞和Th1 型淋巴因子的靶細胞，骨髓CD34+細胞數(shù)減少與骨髓造血細胞數(shù)減少有關(guān)， 骨髓抑制性細胞因子 （如IFN-γ、TNF-α 等）通過TRAIL 等途徑在體外誘導(dǎo)CD34+細胞凋亡[23]。 CD34+抗原是造血干細胞表面的一種糖蛋白，其在造血干細胞中呈特異性表達[24]。國外學(xué)者Choudhury 等[25]研究顯示，CD34+在多數(shù)AA 患者中水平較低。 本研究發(fā)現(xiàn)，SAA 患者外周血中CD34+表達水平較健康體檢者低，且預(yù)后不良組患者低于預(yù)后良好組，提示外周血CD34+細胞表達水平與SAA 發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，對SAA 預(yù)后不良可能具有評估作用。 研究進一步采用COX 分析顯示，高水平IL-2、高水平IL-18 及低表達CD34+是影響SAA 患者不良預(yù)后的危險因素， 提示監(jiān)測外周血IL-2、IL-18、CD34+細胞水平對預(yù)估SAA 患者預(yù)后情況可能具有作用。

綜上所述，SAA 患者血清IL-2、IL-18 水平明顯升高，CD34+水平降低，高水平IL-2 及IL-18、低CD34+是SAA 不良預(yù)后的危險因素。但本研究僅納入60 例SAA 患者檢測分析，可能影響結(jié)果的準確性， 因此后期可在大樣本量基礎(chǔ)， 并延長隨訪時間， 對IL-2、IL-18、CD34+細胞在疾病中作用機制進行深入分析。