無精子癥及嚴(yán)重少弱畸精子癥患者進(jìn)行ICSI 治療的臨床結(jié)局分析

張杰，吳成亮，李霞，溫國亮，蘇占營

（江西省九江市婦幼保健院輔助生殖科，江西 九江332000）

全球10～15%的育齡夫婦存在著不孕不育，男性因素約占50%[1]。 無精子癥作為男性不育的重要病因，發(fā)生率約占男性不育的8%[2]。 1992 年，隨著卵胞漿內(nèi)單精子注射 （intra cytoplasmic sperm injection,ICSI）技術(shù)的問世，給無精子癥患者的治療帶來了突破， 通過經(jīng)皮附睪穿刺精子抽吸術(shù)（PESA）、睪丸穿刺取精術(shù)（TESE）進(jìn)行ICSI 治療使越來越多的無精子癥患者獲得了生育。 通過回顧性研究我院384 例ICSI 治療周期的資料， 分析精子來源為附睪、 睪丸的無精子癥患者與正常射精來源的嚴(yán)重少弱畸精子癥患者進(jìn)行ICSI 的臨床效果。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2013 年1 月至2018 年1 月至我院生殖中心進(jìn)行ICSI 治療的384 例周期病例。 入選條件滿足以下2 點(diǎn)：（1）因單純男性因素行ICSI 治療，排除女方不孕者；（2）雙方染色體檢查無異常。 把不同來源的精子列為三組：A 組為無精子癥患者（至少經(jīng)過3 次離心鏡檢未見精子，附睪或睪丸穿刺可見成熟精子） 取卵日通過經(jīng)皮附睪穿刺精子抽吸 （Percutaneous epididymal sperm aspiration,PESA） 取精的67 個周期，B 組為無精子癥患者取卵日行睪丸穿刺取精 （Testicular sperm extraction,TESE） 的61 個周期，C 組為正常射精的嚴(yán)重少弱畸精子癥或取精當(dāng)日前向運(yùn)動精子總數(shù)＜2×106/mL 的256 個周期。

1.2 方法

1.2.1 控制性超排卵 我院采用GnRH-a（達(dá)必佳，德國輝凌）+FSH（果納芬，瑞士雪蘭諾/麗申寶，中國麗珠）長方案，F(xiàn)SH/HMG 微刺激方案，F(xiàn)SH+醋酸西曲瑞克（思則凱，德國百特）拮抗劑方案。 當(dāng)1～2個主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到18～20 mm 或2～3 個卵泡直徑達(dá)到16～17 mm 時，肌注HCG10000IU（中國麗珠），34～36 h 后經(jīng)陰道B 超引導(dǎo)下卵泡穿刺取卵。

1.2.2 卵子獲取 卵子孵育4～6 h 左右將卵冠丘復(fù)合物置于80 IU/mL 透明質(zhì)酸酶溶液 （瑞典Vitrolife）中消化去除卵丘顆粒細(xì)胞外的顆粒細(xì)胞，獲得MⅡ期卵子待行ICSI。

1.2.3 精子采集 A 組患者于取卵當(dāng)日采用經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)（PESA）取精：患者仰臥，常規(guī)陰囊皮膚消毒鋪巾，1%利多卡因精索阻滯麻醉并將附睪固定于陰囊皮下， 將預(yù)先抽吸0.5 mL IVF30 培養(yǎng)液（瑞典Vitrolife 公司生產(chǎn)）的皮試針穿刺進(jìn)入附睪頭或附睪體，持續(xù)負(fù)壓抽吸附睪液，抽出少許淡黃或渾濁液體后立即鏡檢觀察有無活動精子及精子數(shù)量、形態(tài)等，將其混合離心處理并孵育待用。若鏡檢未見精子，改行同側(cè)睪丸穿刺取精（TESE）。B 組患者取卵當(dāng)日行睪丸穿刺取精： 局部麻醉后，將預(yù)先抽吸1 mL 培養(yǎng)液的10 mL 注射器連接7號針頭刺入陰囊穿破睪丸白膜 （有明顯突破感），持續(xù)負(fù)壓抽吸多次， 保持負(fù)壓緩慢抽針并用眼科剪將曲細(xì)精管剪斷。 洗滌睪丸組織，去除血液后用2 只1 mL BD 注射針將其磨碎，立即鏡檢觀察有無活動精子， 把睪丸組織懸液混合離心制成精子懸液放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育待用。 C 組患者取卵前禁欲3～7 d， 清潔雙手后采取手淫取精留置精液，用直接離心沉淀或微量密度梯度離心法處理精液，置37℃6% CO2培養(yǎng)箱中待用。

1.2.4 卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI） 在顯微操作皿上加入數(shù)滴Gammer-20、1 滴精子上游液及PVP液，將減數(shù)分裂中期的MⅡ卵子放入預(yù)備好的QHTF-hepes+10%SPS 液滴中， 將活動精子置于5%的聚乙烯吡咯烷酮中。 單精子經(jīng)尾部制動后，將其吸入顯微注射針內(nèi)， 保持卵子極體位于6 點(diǎn)或12點(diǎn)位置，在3 點(diǎn)位置進(jìn)針，抽吸少量胞質(zhì)，見破膜后將精子注入卵細(xì)胞內(nèi)。 如無活動精子，可選取形態(tài)好的精子進(jìn)行低滲膨脹實(shí)驗(yàn) （Hypoosm swelling test，HOST）,尾部陽性的精子為活精子，經(jīng)注射的卵子沖洗后轉(zhuǎn)入37℃6% CO2環(huán)境下的培養(yǎng)液中。

1.2.5 胚胎評估及移植 經(jīng)培養(yǎng)14～18 h 顯微鏡下觀察是否受精，雙原核和兩個極體為正常受精，D3（取卵第三天）觀察胚胎卵裂情況并評分，選取1～3個最優(yōu)質(zhì)胚胎移植， 如剩余可利用胚胎則進(jìn)行冷凍保存，移植后予黃體酮支持，最大移植胚胎數(shù)不超過3 個。

1.2.6 妊娠結(jié)局 胚胎移植后14 天測血β-hCG，陽性者為生化妊娠，陰性者為未獲妊娠；移植后35天行B 超檢查， 顯示孕囊及胎心搏動者為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（±s）表示，采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05，兩兩比較采用SNK 法；計(jì)數(shù)資料比較采用R×C 表的卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05,兩兩比較采用Bonferroni 方法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.0167。

2 結(jié)果

2.1 患者基本情況比較 三組女方平均年齡無顯著差異，C 組男方平均年齡與不孕年限均顯著大于A、B 兩組（P＜0.05），A、B 兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。 見表1。

表1 3 組患者基本情況比較

2.2 受精、胚胎情況：B 組和C 組卵裂率、受精率明顯低于A 組 （P＜0.05），C 組優(yōu)質(zhì)胚胎率明顯低于A、B 組，P＜0.05。 見表2。

表2 3 組卵子與胚胎情況比較

2.3 妊娠結(jié)局 三組之間的流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及出生缺陷率無明顯差異；C 組臨床妊娠率顯著低于A、B組（P＜0.05），A 組、B 組間無明顯差異。 見表3。

表3 3 組妊娠結(jié)局比較

3 討論

近年來，由于自然與社會環(huán)境的改變，男性生育能力普遍下降。 據(jù)國外多位學(xué)者報(bào)道，過去的幾十年人類精子數(shù)量下降了40%以上，精子濃度、活率、 正常形態(tài)百分率正以平均每年2.6%、0.7%、0.3%的速度下降[3-4]。 嚴(yán)重少弱精與無精癥患者由于無法獲取精子或精子數(shù)量、 活率太低而難以生育， 而ICSI 是借助顯微操作系統(tǒng)將單一精子機(jī)械性注射入卵子內(nèi)使其受精，使其對精子數(shù)量、活動率、受精能力的要求極大的降低。正是ICSI 技術(shù)的廣泛開展， 越來越多的無精子癥患者通過PESA/TESE 取精進(jìn)行ICSI 治療獲得了生育。 隨著ICSI治療的患者不斷增加， 許多學(xué)者開始關(guān)注無精子癥及嚴(yán)重少弱精患者行ICSI 治療的結(jié)局[5-6]。

關(guān)于不同來源精子對胚胎發(fā)育及妊娠的影響是有爭議的， 一些學(xué)者認(rèn)為射出精子和附睪來源精子ICSI 后的受精率、卵裂率、早期胚胎發(fā)育能力要高于睪丸精子[7]，另一種觀點(diǎn)認(rèn)為不同來源精子ICSI 后的受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、妊娠結(jié)局近似[8-9]。 本研究結(jié)果顯示TESE 組（B 組）和嚴(yán)重少弱精組（C 組）的受精率、卵裂率顯著低于PESA 組（A 組），嚴(yán)重少弱精組的優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著低于PESA 組和TESE 組。 有研究顯示[10]睪丸精子未經(jīng)附睪成熟，與附睪及射精組精子相比較成熟度低、活動率差、畸形率高，且睪丸精子核濃縮不全、頭大小不等、有空泡、頸部常殘留胞質(zhì)、尾部畸形、染色體異常比例增加，這些因素都會造成TESE 精子的受精率與早期胚胎發(fā)育能力下降。而使用DNA（線粒體DNA 與核DNA） 損傷較高的精子進(jìn)行ICSI時，卵子受精率影響不大，但胚胎質(zhì)量、種植率顯著下降[11-12]。 據(jù)報(bào)道精子DNA 損傷主要發(fā)生在睪丸后階段，睪丸精子DNA 的損傷程度顯著低于附睪與射精中的精子[13-14]；另外附睪來源精子阻塞在附睪，與嚴(yán)重少弱精相比，由于血-附睪屏障的作用受到的精子DNA 損傷相對較少，但后者的精子可能受到睪丸、 附睪功能的缺陷及其他有害物質(zhì)的氧化損傷而使精子DNA 損傷更嚴(yán)重，從而使睪丸、 附睪來源精子的優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于嚴(yán)重少弱精患者。 本研究結(jié)果還顯示C 組男方年齡、不孕年限顯著高于前兩組，女方年齡無明顯差異；嚴(yán)重少弱精組的臨床妊娠率顯著低于TESE 組、PESA組，但流產(chǎn)率、異位妊娠率、活產(chǎn)率、出生缺陷率無顯著差異。 分析認(rèn)為：（1）無精子癥患者在就診時能被及早發(fā)現(xiàn)、確診，治療方法少，且更具針對性，一般采用顯微外科手術(shù)治療或TESE/PESA 取精行ICSI 治療。 嚴(yán)重少弱畸患者ICSI 治療前大都經(jīng)歷過較長時間的保守治療，因此男方年齡、不育年限較高， 女方年齡較其它兩組相比雖無顯著差異但也略高。 大量研究證實(shí)，隨著女性年齡增加，卵子質(zhì)量和子宮內(nèi)膜的容受性逐漸下降， 胚胎種植率和臨床妊娠率也會降低[15-16]。 （2）不孕年限較長會增加夫妻雙方的精神壓力甚至產(chǎn)生焦慮、 抑郁癥狀， 這種精神心理因素可能通過影響下丘腦-垂體-性腺軸的分泌而影響胚胎種植率臨床妊娠率[17-18]。 （3）盡管TESE 組的受精率、卵裂率低于PESA 組，但獲得的優(yōu)質(zhì)胚胎率與PESA 組無差異；嚴(yán)重少弱畸精組優(yōu)質(zhì)胚胎率雖然顯著低于TESE/PESA 組，但經(jīng)過體外培養(yǎng)后選擇最優(yōu)質(zhì)的胚胎進(jìn)行移植，三組間不良妊娠結(jié)局無明顯差異，也有可能與胚胎在發(fā)育過程中的自我修復(fù)和糾錯機(jī)制相關(guān)[19]。

綜上所述，PESA/TESE 組ICSI 的臨床妊娠率高于嚴(yán)重少弱畸精子癥組， 且未增加妊娠不良結(jié)局的發(fā)生率及子代出生缺陷風(fēng)險，所以采用TESE/PESA 精子結(jié)合ICSI 技術(shù)是治療無精子癥患者安全有效的方法。 目前大多數(shù)研究仍處于短期跟蹤觀察階段， 不同精子來源對妊娠及子代的影響還需要較長時間和大量樣本的持續(xù)研究。