鮑曼不動桿菌Hcp 基因原核表達載體的構建及蛋白純化

胡音音，杜偉鵬，張亞東，盧慶文，李向陽

（1.南陽市中心醫(yī)院檢驗科，河南 南陽473009；2.南陽市中心醫(yī)院肝臟外科，河南 南陽473009；3.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州325027）

隨著鮑曼不動桿菌臨床分離率的不斷攀升及多重耐藥和泛耐藥菌株的不斷涌現， 該菌的感染已成為國內乃至世界面臨的一大公共衛(wèi)生問題。Ⅵ型分泌系統(tǒng)（Type ⅥSecretion System, T6SS）是存在于大多數革蘭陰性桿菌中的一種新型分泌系統(tǒng)， 對其功能研究發(fā)現該系統(tǒng)不僅參與細菌間的種群競爭作用，具有殺傷異種菌功能，還與細菌毒力相關[1-2]。 作為T6SS 的核心組分，溶血素共調節(jié)蛋白（Hemolysin-coregulated protein，Hcp）的 檢 測是驗證T6SS 活性最重要的方法，因此其單克隆抗體的制備顯的尤為重要。 另外，Hcp 蛋白家族本身又是一種效應因子，參與細菌的致病過程[3]，但其在鮑曼不動桿菌致病性中的研究甚少。 本研究擬構建鮑曼不動桿菌Hcp 原核表達載體， 探索蛋白表達情況并純化Hcp 蛋白，為后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 pET-28a(+)質粒、ATCC17978 標準菌株和E.coli BL21(DE3)菌株為本實驗室自存。pJET1.2克隆載體和CloneJET PCR Cloning 試劑盒購于美國Thermo 公司，IPTG、卡那霉素及質粒提取、DNA回收、PCR 產物純化的試劑盒均購于上海捷瑞生物有限公司，T4 DNA Ligase、Xho Ⅰ和Nco Ⅰ內切酶購于大連寶生生物有限公司，細菌DNA 提取試劑盒、His 蛋白純化試劑盒、鼠抗-His 多克隆抗體、羊抗鼠IgG（HRP 標記）、蛋白酶抑制劑（PMSF）均購于碧云天上海生物有限公司， PVDF 膜、蛋白超濾管等購于美國Millipore 公司。

1.2 方法

1.2.1 Hcp 基因擴增及產物純化 采用DNA 提取試劑盒提取ATCC17978 菌株全基因組DNA，根據Hcp 基因序列，參照pET-28a (+)質粒的限制性酶切位點設計合成一對帶有Xho Ⅰ和Nco Ⅰ位點的特 異性引物。 引 物 序 列 如 下：F: 5’—GCATCCATGGATGAAAGATATATACGTTGA—3’,R:5’—CCGCT CGAGCGCTGCGTAAGAAGCTGTAT—3’（黑體示酶切位點）。 Hcp 基因擴增通過PCR 技術完成，反應條件為：94℃10 min；94℃40 s，50℃30 s，72℃30 s，30 個循環(huán)；72℃10 min。 產物經瓊脂糖凝膠電泳進行回收并純化備用。

1.2.2 pET-28a (+)-Hcp 重組質粒的構建及鑒定根據CloneJET PCR Cloning 試劑盒說明書將Pjet1.2 平末端載體與Hcp 基因純化物連接， 隨后立即轉化E.coli DH5α 感受態(tài)細胞構建Pjet1.2-Hcp 克隆載體轉化株并驗證。用Nco I 和Xho Ⅰ對pET-28a(+)和Pjet1.2-Hcp 進行酶切，回收有切口的pET-28a(+)和Hcp 基因片段，將兩者以3～5:1（摩爾比）的比例在16℃環(huán)境下連接16 h。 連接產物轉化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，轉種LB 固體培養(yǎng)基（用卡那霉素進行篩選），挑取單克隆菌落進行PCR 鑒定、酶切鑒定及測序鑒定。

1.2.3 Hcp 的誘導表達、表達方式的探索及western blot 驗證 將導入pET-28a (+)-Hcp 重組質粒的E.coli BL21(DE3)（后面簡稱“重組菌”）轉種含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基，37℃，250 rpm 培養(yǎng)過夜，次日取適量菌液再次轉種， 同樣條件培養(yǎng)至OD600≈0.5。 取出2 mL 菌液作對照樣品，剩余菌液加入IPTG（終濃度為1 mmol/L）誘導，于相同條件下培養(yǎng)5h（作為對照，導入pET-28a(+)的E.coli BL21(DE3)也同時進行誘導處理），取適量誘導后的菌液備用。 剩下的菌液用超聲裂解處理分離沉淀和上清。 取誘導前后的菌液、 空載體誘導菌液100℃煮沸裂解及超聲裂解的沉淀和上清進行SDS-PAGE 電泳， 并用western blot 驗證目的蛋白。

1.2.4 探索IPTG 誘導Hcp 表達的濃度和時間 取適量過夜培養(yǎng)的重組菌轉種LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600≈0.5，以不同終濃度的IPTG（0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、0.7 mmol/L 和1.0 mmol/L）誘導表達5 h 或以終濃度為1.0 mmol/L 的IPTG 分別誘導表達3 h、5 h、7 h、9 h、10 h。離心收集并處理菌體，經SDS-PAGE 電泳分析結果。

1.2.5 大量表達Hcp 重組蛋白、分析表達方式及純化 將重組菌轉種大量LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600≈0.5，以最佳的IPTG 濃度誘導5~7 h，離心收集菌體。加入含PMSF 的超聲裂解液及終濃度為1 mg/mL 的溶菌酶重懸菌體，于冰上超聲裂解重懸菌， 分離上清和沉淀。 上清和沉淀均進行SDSPAGE 電泳以分析重組蛋白的存在形式。純化重組蛋白據試劑盒說明書進行。 純化蛋白液用10 KD的超濾管濃縮，經0.22 μm 濾菌器除菌后分裝、保存。

2 結果

2.1 擴增Hcp 基因及PCR 產物純化 擴增Hcp 基因并純化后經1.5%瓊脂糖凝膠電泳， 獲得約500 bp 的基因擴增物，與預期大小一致，見圖1。

圖1 Hcp 基因擴增產物純化電泳圖

2.2 重組質粒pET-28a (+)-Hcp 的構建及鑒定pET-28a (+) 和Hcp 基因連接后轉化E.coli BL21(DE3）并轉種培養(yǎng)基，選取數個菌落行Hcp 基因擴增，如圖2 所示，菌落1、4、6 為陽性，菌落2、3、5為陰性。 提取1、4、6 菌落的質粒進行雙酶切，電泳顯示出預期約500 bp 的目的基因，見圖3。

圖2 菌落PCR 鑒定結果

圖3 pET-28a(+)-hcp 重組質粒雙酶切結果

將上述1、4、6 號菌送上海桑尼生物技術有限公司對Hcp 基因序列測序， 對結果進行比對，與GenBank （CP012004.1）：ACX60_11670 相 似 率 達100%。 具體序列如下：GGTACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATAT ACCATGGATGAAAGATATATACGTTGAGTTTCGC GGTAAATATAAAGTTGATGGAGAATCTCGTGATT CTGAGCACAAAGGTTGGTTAGAAGTTAACTCTTG GTCTCATAACATCCGTCAACCTAAATCTGCTACTT CAAGTAGTGTAGGCGGCCACACTGCTGAACGTGT TGAACATTCTGACATGGTTTTCGTAAAAGACTTA GATGCAACTAGCCCTAAATTATGGGAAGCTTGTT CAGCTGGTTATACATTTGATGAAGTACAAATCGA CTTCTATCGTGCAAATGGCGATAAACGTATCAAG TACTTACAAATCAAATTGAAGCACGTTTTAGTTTC TAGTGTGACTCCAACTGTTAACGAAGAAGGCGTT CCTACAGAAGCATTCGGTTTGAAATATGCTGCTG TTGAGTGGACTTATAACCAACAAGATATTAACGG TACTGCTAAAGGTGCTGTTACTAAGAAATGGTCA CTTTCTAATAATACAGCTTCTTACGCAGCGCTCGA GCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCT AACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCT GCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTG GGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCT GAAAGGAGGAACTATATCCGGATTGGCGAATGG GACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCG GGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACAC TTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTC TTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCC CCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGG TTCCGATTTAGTGCTTTACCGGCACCTC

2.3 Hcp 蛋白的誘導表達 將誘導后的pET-28a(+)導入菌、誘導前后的重組菌煮沸裂解物及重組菌誘導后的超聲破菌上清和沉淀同時上樣。如圖4所示， 重組菌誘導后的煮沸裂解物和超聲裂解的上清和沉淀均高表達19KD 的蛋白，而空載體菌和誘導前重組菌則不表達或低表達。

圖4 Hcp 蛋白在E.coli BL21 中的表達

2.4 IPTG 誘導Hcp 表達的最佳濃度和時間 如圖5A 所示，Hcp 蛋白在0.5 mmol/L IPTG 誘導時表達量最高。如圖5B 所示，Hcp 蛋白在誘導5~7 h 后后表達量最高。

圖5 不同IPTG 誘導濃度及不同誘導時間下Hcp 蛋白的表達情況

2.5 蛋白純化及鑒定 本實驗使用重組菌超聲裂解的上清液進行重組蛋白的純化，作為陰性對照，pET-28a(+)導入菌破菌上清也同時同步進行純化，純化過程中預留洗滌液、穿流液、洗脫液等驗證純化效果。 電泳顯示上清液純化的洗脫液中僅在19 kD 左右處出現蛋白條帶，見圖6A。 而pET-28a(+)導入菌破菌上清純化物中無任何蛋白，見圖6B。通過Western blot 進一步鑒定， 蛋白純化物能與His抗體結合，見圖6C。

圖6 Hcp 蛋白純化及Western blot 鑒定

3 討論

鮑曼不動桿菌是一種主要引起醫(yī)院內感染的革蘭陰性菌。 隨著近年來多重耐藥、泛耐藥和高毒力株的出現， 使該菌引起的感染有著高發(fā)病率和高死亡率的特點[4-5]，因此世界衛(wèi)生組織已將碳青霉烯耐藥的鮑曼不動桿菌列為急需新型抗生素的重點病原體， 廣大科研工作者也一直致力于該菌耐藥機制和致病機制的研究。

在鮑曼不動桿菌中，Hcp 不僅是T6SS 的核心蛋白，其本身也是一種效應因子，該蛋白常被分泌到細菌培養(yǎng)物的上清液、 感染者的痰液甚至血清中，標志著T6SS 處于活性狀態(tài)（T6SS+）[6-8]。 因此，大多數科研工作者研究革蘭陰性菌T6SS 時的必需首要工作就是制備Hcp 蛋白[1,3,6,9]。本實驗通過經典的基因克隆的方法制備了Hcp 原核表達載體并通過測序的方法驗證了重組質粒中Hcp 序列未發(fā)生突變。 SDS-PAGE 電泳顯示重組菌在IPTG 誘導后可大量表達預期大小的蛋白，Western Blot 驗證了在原核細胞中高表達的蛋白就是Hcp 重組蛋白。此外，經本實驗研究表明，重組菌在0.5 mmol/L的IPTG 誘導5~7 h 的條件下蛋白表達量最高，且目的蛋白在破菌沉淀和上清中的含量相差無異，這為該領域的研究者提供了寶貴經驗。 在蛋白純化上， 本實驗選用破菌上清進行目的蛋白的非變性純化， 同時空載體導入菌也進行同樣的操作及純化，既可驗證操作過程的可靠性，又為Hcp 融合蛋白功能的研究提供了對照物。

T6SS 在革蘭陰性菌的生存和致病中發(fā)揮重要作用[10-12]，比如，Hcp 蛋白在洋蔥伯克霍爾德菌和鮑曼不動桿菌生物膜形成過程中發(fā)揮重要作用[1,13]；E.coli K1 引起人腦微血管內皮細胞（HBMEC）炎癥反應、 細胞骨架重構和細胞凋亡等方面都有Hcp蛋白家族的參與[3]；此外，有研究發(fā)現T6SS 的負向調節(jié)因子存在于鮑曼不動桿菌內的耐藥性質粒上[14]，這說明T6SS 與該菌的耐藥性也有極大的關聯。綜上，研究鮑曼不動桿菌的T6SS 有望在其致病機制和耐藥機制方面得到新突破。 前期，本團隊從基因層面發(fā)現Hcp 在感染狀態(tài)的鮑曼不動桿菌中的表達量較定植狀態(tài)突出，并且其RNA 水平的表達受到免疫細胞、感染狀態(tài)和pH 的調節(jié)[15]，但其蛋白層面的研究并未涉及。Hcp 融合蛋白表達系統(tǒng)的成功構建為上述研究、 去定植研究及疫苗研究等后續(xù)研究奠定了堅實的實驗基礎。