牙周膜HMGB1、骨膜蛋白表達(dá)水平與正畸牙移動過程的相關(guān)性分析

高再冕，高雅麗

（平頂山學(xué)院第二附屬醫(yī)院 平頂山市口腔醫(yī)院1.口腔正畸科；2.牙體牙髓科，河南 平頂山467000）

口腔正畸是一種借助機械外力促進(jìn)牙齒畸形患者壓力側(cè)骨吸收,而張力側(cè)新骨沉積的移位矯形的口腔治療技術(shù)[1]。 正畸牙受矯治力作用后，早期是個急性炎癥的過程,牙周組織合成與釋放多種因子[2]。 最近的研究發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白1（HMGB1）是牙周炎癥及骨組織改建的重要介質(zhì)， 其還與成纖維細(xì)胞增殖、分化的重要參與因子[3]。 骨膜蛋白（Pn） 是新發(fā)現(xiàn)的一種多功能的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。研究認(rèn)為[4]，Pn 是對牙周膜穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)有關(guān)鍵作用的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。 但臨床對HMGB1、Pn 在各牙周疾病中表達(dá)水平及臨床意義研究較少。 因此本研究探討牙周膜高遷移率族蛋白1（HMGB1）、骨膜蛋白（Pn）在正畸牙移動過程中的表達(dá)及意義，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取清潔型C57BL 小鼠12 只，雌雄各半，7 周齡，體質(zhì)量17～20 g，在室溫18～25℃，相對濕度50～80%條件下飼養(yǎng)， 明暗周期為12 h，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由攝食和飲水。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠牙齒移動模型建立 本實驗采用Waldo法建立牙齒正畸移動模型，C57BL 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，稱重后腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，小鼠固定后取仰臥位，暴露小鼠口腔。 用眼科鑷將皮條塞至小鼠牙齒之間， 以右側(cè)上頜第一磨牙遠(yuǎn)中根及周圍牙周組織為觀察組（近中為壓力側(cè)、遠(yuǎn)中為張力側(cè)），左側(cè)上頜作為對照組。

1.2.2 組織學(xué)觀察 各組動物在建模7 d 后處死，取雙側(cè)上頜磨牙及其周圍組織，福爾馬林固定。 脫鈣處理48 h 后清水沖洗，選用10% EDTA 進(jìn)行脫鈣處理，時長約為30 d，每隔3 d 更換一次脫鈣液。大頭針能無阻力穿過組織為脫鈣完成標(biāo)準(zhǔn)[5]。 脫鈣后選用酒精進(jìn)行梯度脫水處理，共7 個梯度，每個梯度脫水6 h。 蠟缸浸漬3 h， 組織包埋后切片處理。 取含有第一磨牙近遠(yuǎn)中根及其周圍組織的切片展開，置于37℃烤箱烤干過夜備用。

1.2.3 免疫組化檢測 采用免疫組化SP 法。HMGB1、Pn 一抗（HMGB1：兔來源單克隆抗體，濃度1∶250， 購自Abcam 公司；Pn： 兔來源多克隆抗體，濃度1∶500，購自Abbkine 公司）；生物素標(biāo)記二抗（山羊抗兔IgG 多克隆抗體，濃度1∶1000，購自Abcam 公司）。

讀片評分標(biāo)準(zhǔn)：（1） 根據(jù)著色強度：0 分為無色，1 分為淡黃色，2 分為棕黃色，3 分為褐、 黑色；（2）根據(jù)陽性細(xì)胞比例：陽性細(xì)胞數(shù)目占比≤10%計1 分，陽性細(xì)胞占比為11%～50%計2 分，陽性細(xì)胞數(shù)占比為51%～75%計3 分， 陽性細(xì)胞數(shù)占比＞75%計4 分。 兩種積分相乘總分＜3 分視為陰性，≧3 分視為陽性。

Western blot 法檢測HMGB1、Pn 表達(dá)：均按試劑使用說明常規(guī)進(jìn)行HMGB1、Pn 蛋白的提取、電泳、封閉、一抗及二抗孵育、顯色；應(yīng)用激光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描并用電腦圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)字化信息轉(zhuǎn)化， 記錄條帶光密度對HMGB1、Pn 表達(dá)進(jìn)行評價。

1.2.4 RT-PCR 檢測 采用Trizol 法提取組織樣本的總RNA， 參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求快速將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA， 以cDNA 為模板， 參考RTPCR kit 說明書完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成TGF-1 mRNA、FAK mRNA，取出產(chǎn)物4℃下放置5 min。 常規(guī)進(jìn)行PCR 產(chǎn)物電泳、染色，在紫外投影儀下進(jìn)行觀察，并應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)TGF-1 mRNA、FAK mRNA 及內(nèi)參照基因GAPDH 的DNA 條帶進(jìn)行灰度值分析，TGF-1 mRNA、FAK mRNA 的相對表達(dá)量為各mRNA 的條帶與GAPDH 的DNA 條帶的灰度值比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用（±s)表示，組間比較使用方差分析， 兩兩比較采用LSD 檢驗。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色結(jié)果 對照組牙周纖維排列整齊，牙槽骨平整，膠原纖維自牙骨質(zhì)伸入牙周膜，牙周膜大部分有膠原纖維和成纖維細(xì)胞組成。 實驗組張力側(cè)牙周間隙變寬，牙周膜纖維排列不整齊，壓力側(cè)牙周間隙變窄，有部分透明樣變區(qū)，骨有大量多核的破骨細(xì)胞聚集在吸收陷窩內(nèi)。 見圖1。

圖1 HE 染色

2.2 各組HMGB1、Pn 表達(dá)比較 觀察組壓力側(cè)HMGB1 光密度值為明顯低于觀察組張力側(cè)和對照組（P＜0.05），而Pn 光密度值明顯高于觀察組張力側(cè)和對照組（P＜0.05）； 觀察組張力側(cè)與對照組HMGB1 和Pn 光密度值比較， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表1。

表1 各組HMGB1、Pn 表達(dá)比較

圖2 免疫組化檢測

2.3 各組TGF-1、FAK mRNA 表達(dá)比較 觀察組壓力側(cè)TGF-1、FAK mRNA 相對表達(dá)量均明顯高于觀察組張力側(cè)和對照組（P＜0.05）；觀察組張力側(cè)與對照組TGF-1、FAK mRNA 相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表2。

表2 各組TGF-1 mRNA、FAK mRNA 相對表達(dá)比較

3 討論

口腔正崎是牙齒畸形，尤其是牙齒排列不齊、牙齒形態(tài)異常的常用治療方案[6]。 整個正畸工作具有生物力學(xué)階段和生物學(xué)兩個階段， 其中生物力學(xué)階段需借助機械外力，將錯位牙、牙弓及頜骨進(jìn)行移位矯形； 生物學(xué)階段則表現(xiàn)為機械外力作用下，牙周組織微結(jié)構(gòu)的改建。 這一微結(jié)構(gòu)改建主要存在于牙周組織、牙槽骨內(nèi)，改建時牙周局部將合成并釋放多種因子，進(jìn)而刺激多種細(xì)胞發(fā)生應(yīng)答，最后促使牙齒移位，實現(xiàn)正畸效果[7]。

牙周膜（Periodontal ligament）位于牙根與牙槽骨之間，為連接牙齒與牙槽骨的橋梁，主要為膠原纖維，多集合成束。 研究顯示[8]，牙周膜是牙周組織損傷或修復(fù)的重要組織，正畸治療時，牙周膜將感應(yīng)到的應(yīng)力信號轉(zhuǎn)化為生物學(xué)信號， 完成牙周組織的改建。 這一過程與多種細(xì)胞因子及信號通道有關(guān)[9]。 高遷移率族蛋白1（HMGB1）是一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白， 廣泛存在于在真核細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。近年來關(guān)于HMGB1 與牙齒移動的關(guān)系受到廣泛的關(guān)注。 既往研究顯示[10]，軟骨細(xì)胞合成的HMGB1 對成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞具有極強的趨化效應(yīng)。機械應(yīng)力的刺激使HMGB1 在牙周膜中的表達(dá)受到影響[11]。 本研究中，觀察組壓力側(cè)HMGB1 光密度值明顯低于觀察組張力側(cè)和對照組（P＜0.05），表明牙周膜HMGB1 可能參與了正畸牙移動過程中牙周膜改建。

骨膜蛋白(Periostin，Pn)是一種多功能的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在骨合成代謝、骨折修復(fù)、骨的生長發(fā)育及骨強度維持方面起重要作用[12]。 近年來對Pn 研究顯示[13]，Pn 對牙周組織的完整性、牙齒的發(fā)育和萌出發(fā)揮著重要的作用。 因此Pn 可能對正畸牙移動中牙周組織的改建起著關(guān)鍵作用。 Sriram[14]等研究發(fā)現(xiàn)， 敲除基因的小鼠牙周組織出現(xiàn)明顯破壞、牙周附著降低、牙槽骨吸收。 越來越多的研究認(rèn)為，Pn 是評價牙周膜細(xì)胞特性的關(guān)鍵因子，但其對牙周組織改建的影響如何，臨床研究較少。 基于此，本研究探討Pn 在正畸牙移動過程中的表達(dá)及意義， 用以探究正畸過程中牙周組織改建的分子機制。 研究結(jié)果顯示，觀察組Pn 光密度值明顯高于觀察組張力側(cè)和對照組（P＜0.05）；說明正畸牙齒移動過程中，Pn 在牙周膜的表達(dá)明顯增強，Pn在牙周膜細(xì)胞外基質(zhì)改建發(fā)揮重要作用。 研究顯示[15]，Pn 與多個系統(tǒng)性疾病有關(guān)，而其表達(dá)水平則與TGF-β1 存在密切聯(lián)系， 會涉及FAK 依賴的通路的調(diào)節(jié)。 骨組織的改建過程中，骨新生與骨吸收處于動態(tài)平衡， 其中個別細(xì)胞因子在其中起到重要作用。TGF-β1 分布于動物的正常組織和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，在骨及骨環(huán)境的遞質(zhì)中廣泛存在。 為了更好的了解與正畸牙周組織骨改建的關(guān)系， 本研究使用RT-PCR 檢測TGF-β1、FAK mRNA 表達(dá)， 結(jié)果顯示， 觀察組壓力側(cè)TGF-β1、FAK mRNA 相對表達(dá)量明顯高于觀察組張力側(cè)和對照組（P＜0.05）。結(jié)果表明PN、TGF-β1、FAK 是正畸力的轉(zhuǎn)化為生物信號的效應(yīng)因子，均參與牙周膜改建的過程。 但是FAK 信號通路在其中參與的調(diào)控機制， 還需要進(jìn)一步研究驗證。

綜上所述， 牙周膜HMGB1 和Pn 可能參與了正畸牙移動過程中牙周膜改建，值得進(jìn)一步研究。