MTHFR 基因多態(tài)性和脂蛋白磷脂酶A2 在糖尿病周圍血管病變中的分析

劉倩文，周國強，葉柱均，張志堅，吳春華

（1.東莞市康華醫(yī)院病理科，廣東 東莞523000；東莞市萬江醫(yī)院，2.檢驗科，3.內(nèi)科，廣東 東莞523050）

2 型糖尿病患者是全身性的代謝紊亂型疾病，高血糖會通過多種途徑影響血管結(jié)構(gòu)與功能，其中周圍血管病變（Peripheral vascular disease，PVD）是較為常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥之一， 對于糖尿病患者指的是下肢血管病變， 可能導(dǎo)致糖尿病足部潰瘍和下肢截肢， 早期診斷和干預(yù)對于2 型糖尿病患者預(yù)后有著重要意義[1]。 亞甲基四氫葉酸還原酶（5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因是編碼人體葉酸代謝中關(guān)鍵酶的基因， 既往研究表明其基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化等心腦血管疾病密切相關(guān)[2]；脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（Lipoprotein phospholipase A2，Lp-PLA2） 是新近發(fā)現(xiàn)的一種血管特異性炎癥酶， 國內(nèi)外相關(guān)研究表明其亦參與了動脈粥樣硬化過程， 是心腦血管疾病風(fēng)險的預(yù)測因子[3-4]。通過對比實驗以探討MTHFR 基因多態(tài)性與血清Lp-PLA2 水平與糖尿病PVD 發(fā)生的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取東莞市康華醫(yī)院及萬江醫(yī)院2016 年12 月至2019 年8 月收治的2 型糖尿病患者60 例，納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合《中國2 型糖尿病防治指南2013 版》[5]， 典型的糖尿病癥狀 （如多食、多飲、多尿或體重下降），血漿葡萄糖水平/口服葡萄糖耐量試驗 （OGTT）2 h 血糖水平≥11.1 mmol/L，或是空腹血漿葡萄糖水平≥7.0 mmol/L 中，無糖尿病癥狀者需要改日重復(fù)測定血糖確診。 排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心肝腎器質(zhì)性疾病者； 合并各種急慢性炎癥或免疫性疾病者；合并惡性腫瘤者；近1 月內(nèi)有服用抗炎類藥物者。 本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均對此知情并同意。

60 例糖尿病患者中屬于單純糖尿?。―M 組）27 例， 糖尿病合并周圍血管病 （DM+PVD 組）33例，選擇同期體檢健康志愿者30 例作為健康組對照。 三組間性別、年齡、BMI 等一般情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 三組間一般情況的比較

1.2 研究方法 PVD 診斷：采用多普勒超聲（美國惠普HP5500） 對60 例糖尿病患者進行下肢血管檢查，患者取仰臥位或者俯臥位，從腹股溝位置順著血管走向由上至下檢查下肢血管， 觀察血管內(nèi)徑、厚度、走行、有無血栓情況等，若存在血管狹窄或閉塞即可診斷為PVD。

血清生化指標(biāo)的測定： 對所有2 型糖尿病患者采用清晨抽取空腹血，分離血清，采用全自動生化分析儀（日本日立公司生產(chǎn)，型號7180）檢測血清生化指標(biāo)水平，包括空腹血糖（Fasting blood glucose，F(xiàn)PG)、總 膽 固 醇（Total cholesterol，TC）、甘 油三酯（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（High density lipoprotein，HDL）與低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）。 糖 化 血 紅 蛋 白(Glycosylated hemoglobin，HbA1c)測定：采用硼酸親和色譜層析法， 采集患者肘靜脈血2 mL， 裝入EDTA 抗凝管（美國BD 公司，型號367841）中，輕輕顛倒混勻，通過精確稱量、定容及超聲處理后，利用取樣器吸取一定量的全血標(biāo)本，利用特定蛋白分析儀（廣東優(yōu)尼德生物科技有限公司生產(chǎn)，貨號UNT5000）測量其在415 nm 的吸收度，通過數(shù)據(jù)處理軟件得出HbA1c 值，以百分率表示。 Lp-PLA2 測定：采用半自動比濁法，采集患者肘靜脈血2 mL，裝入EDTA抗凝管中，離心10 分鐘，轉(zhuǎn)速為1500 轉(zhuǎn)/min，取上清液，利用Lp-PLA2 定量檢測試劑盒（南京諾爾曼生物有限公司）進行測定。

MTHFR 基因多態(tài)性采用PCR-熒光法檢測，檢測試劑為江西諾德醫(yī)療器械有限公司MTHFR（C677T）基因檢測試劑盒，按照說明書進行操作。

1.3 觀察指標(biāo) 比較三組的血清生化指標(biāo)和MTHFR（C677T）基因型分布，評估它們與PVD 發(fā)生之間的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析處理，三組間計量資料（±s）的比較采用單因素分析，兩兩間比較采用獨立樣本t 檢驗，計數(shù)資料（%）的比較采用卡方檢驗χ2，采用Logistic 回歸分析評估糖尿病周圍血管病變的獨立影響因素。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清生化指標(biāo)的比較 三組間血清TC、TG、HDL 和LDL 比較， 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）；DM+PVD 組 與DM 組 血 清HbA1c、FPG 與Lp-PLA2 均明顯高于健康組 （P＜0.05）， 且DM+PVD 組血清Lp-PLA2 水平高于DM 組 （P＜0.05），見表2。

表2 三組血清生化指標(biāo)的比較（±s）

表2 三組血清生化指標(biāo)的比較（±s）

注：a 與健康組相比P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；b 與DM 組相比P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

組別 n HbA1c/% HDL/（mmol/L） LDL/（mmol/L） Lp-PLA2/（μg/L）DM+PVD 組DM組健康組33 27 30 F P 8.03±1.75a 7.96±1.67a 5.86±0.76 21.263＜0.001 FPG/（mmol/L）7.35±2.86a 7.46±2.77a 4.83±0.59 12.203＜0.001 TC/（mmol/L） TG/（mmol/L）4.58±1.20 4.42±1.13 3.97±1.08 2.373 0.099 1.73±0.71 1.65±0.68 1.62±0.70 0.210 0.811 1.04±0.42 1.07±0.49 1.11±0.35 0.218 0.805 2.58±0.87 2.51±0.81 2.42±0.76 0.302 0.740 205.89±51.68ab 176.61±46.03a 113.16±42.65 31.349＜0.001

2.2 三組MTHFR（C677T）基因多態(tài)性分布的比較DM+PVD 組患者MTHFR 的CC 基因型比例低于健康組（P＜0.05），而MTHFR 的TT 基因型比例和T 等位基因頻率均高于健康組和DM 組（P＜0.05），DM 組與健康組間MTHFR 基因多態(tài)性分布比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 三組MTHFR（C677T）基因多態(tài)性分布（例，%）

2.3 DM 患者PVD 發(fā)生與Lp-PLA2 和MTHFR 基因多態(tài)性的關(guān)系分析 經(jīng)Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，DM 患者PVD 的發(fā)生與Lp-PLA2 和MTHFR的TT 基因型與T 等位基因頻率呈顯著正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 DM 患者PVD 發(fā)生與Lp-PLA2 和MTHFR 基因多態(tài)性關(guān)系的Logistic 回歸分析

3 討論

PVD 是一種慢性肢體缺血性疾病， 主要癥狀為動脈粥樣硬化， 臨床表現(xiàn)為動脈壁彈力層和基層被破壞等， 從而使患者管壁脆性增加， 彈性降低。 糖尿病患者發(fā)生PVD，可能導(dǎo)致糖尿病足、壞疽截肢，嚴(yán)重危害患者生命健康，早期診斷和監(jiān)測PVD 對于改善糖尿病患者預(yù)后意義重大[6]。 既往研究指出，MTHFR 變異體可能對糖尿病及其并發(fā)癥的病理生理起重要作用， 是動脈疾病發(fā)展以及靜脈血栓形成的危險因素[7]，而Lp-PLA2 會隨著肥胖而增加，可能會對血管功能產(chǎn)生不利影響[8-9]，本文主要探討這兩種因素與DM 患者PVD 發(fā)生的關(guān)系。

本研究通過對比了健康人群、DM 與DM+PVD患者的血清生化指標(biāo)和MTHFR 基因多態(tài)性，結(jié)果顯示，DM 患者與DM+PVD 患者的血清FPG、HbA1c 與脂代謝水平?jīng)]有明顯差異， 而血清Lp-PLA2 濃度在健康人群、DM 患者和DM+PVD 患者中依次升高， 且其血清濃度與PVD 的發(fā)生呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系。 Lp-PLA2 是一種由血管內(nèi)膜中的巨噬細胞、T 細胞和肥大細胞分泌的磷脂酶，能夠促使氧化磷脂水解， 產(chǎn)生游離脂肪酸和溶血磷脂等脂質(zhì)類促炎物質(zhì)， 這些物質(zhì)可以通過趨化炎癥細胞進一步產(chǎn)生級聯(lián)放大， 產(chǎn)生更多的促炎物質(zhì)，同時介導(dǎo)內(nèi)皮細胞死亡和內(nèi)皮功能異常，促進動脈粥樣硬化[10]。 Ikonomidis I 等學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Lp-PLA2 濃度升高與冠心病患者的內(nèi)皮功能障礙、頸動脈粥樣硬化、冠狀動脈血流儲備受損、動脈僵硬度增加等不良并發(fā)癥有關(guān)， 而他們認(rèn)為Lp-PLA2會損害內(nèi)皮功能和動脈壁， 所有可以作為慢性冠脈綜合征中的預(yù)后因子[11-12]。 因此，Lp-PLA2 在PVD 的發(fā)生中起著促進作用， 其血清濃度有可能作為PVD 風(fēng)險的預(yù)測因子。

MTHFR 基因編碼的MTHFR 蛋白能催化葉酸和甲硫氨酸代謝，作為甲基供體參與了體內(nèi)嘌呤、嘧啶的合成，以及DNA、RNA、蛋白質(zhì)的甲基化，同時維持著體內(nèi)半胱氨酸水平[13]。 本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)DM+PVD 組TT 基因型比例和T 等位基因頻率均處于高水平， 并且經(jīng)Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，PVD 的發(fā)生與TT 基因型比例和T 等位基因頻率存在較明顯的正相關(guān)關(guān)系。 MTHFR 第677 位點的C 堿基被T 堿基置換，其編碼的丙氨酸被纈氨酸取代后，由于C677T 位于MTHFR 催化區(qū)域，這種堿基突變直接影響了MTHFR 蛋白酶活性和耐熱性下降，引起半胱氨酸水平升高，產(chǎn)生細胞毒性，損傷血管內(nèi)皮細胞，刺激平滑肌細胞增生，機體凝血和纖溶系統(tǒng)被破壞，最終導(dǎo)致了粥樣硬化[14-15]。Settin A 等多位學(xué)者研究[16-17]發(fā)現(xiàn)MTHFR 677T 等位基因是糖尿病視網(wǎng)膜病變、 糖尿病多發(fā)性神經(jīng)病和缺血性心臟病的危險因素， 與本研究結(jié)果呈現(xiàn)一致性。

綜上，MTHFR 基因C677T 多態(tài)性與糖尿病患者PVD 的發(fā)生相關(guān)，TT 基因型和T 等位基因頻率均為PVD 發(fā)生的高危因素，且血清Lp-PLA2 水平的升高可能參與了PVD 的發(fā)生與發(fā)展。