LncRNA NEAT1 與miR-495-3p 對(duì)重癥肺部感染的診斷價(jià)值及其對(duì)T 淋巴細(xì)胞凋亡的影響

趙童，孟明哲，孫棟

（焦作市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科北區(qū)，河南 焦作454000）

重癥肺部感染患者的臨床癥狀不具有典型性導(dǎo)致臨床無(wú)法判斷患者肺部感染的嚴(yán)重程度，進(jìn)而降低治療效果，影響患者預(yù)后。 目前部分血清指標(biāo)可用于診斷重癥肺部感染但診斷準(zhǔn)確率較低[1-2]。因而， 探尋重癥肺部感染相關(guān)的分子標(biāo)志物有助于提高臨床診斷效率。 研究報(bào)道指出，T 淋巴細(xì)胞在機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要作用， 若細(xì)胞凋亡率增多可降低機(jī)體免疫力并可促進(jìn)全身炎癥反應(yīng)及感染性疾病的發(fā)生[3-4]。 長(zhǎng)鏈非編碼RNA NEAT1 （Long non-coding RNA NEAT1，LncRNA NEAT1）在炎癥性疾病中呈高表達(dá)，并可參與免疫調(diào)節(jié)過(guò)程[5]。 微小RNA-495-3p（microRNA-495-3p，miR-495-3p）在脂多糖誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，并可抑制細(xì)胞炎癥損傷[6]。 但NEAT1 與miR-495-3p 在重癥肺部感染患者中的表達(dá)及其臨床意義尚未可知。 本研究主要探討NEAT1 與miR-495-3p 對(duì)重癥肺部感染的診斷價(jià)值及其對(duì)T淋巴細(xì)胞凋亡的影響， 為提高重癥肺部感染的診斷準(zhǔn)確率及治療效果提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016 年5 月至2018 年10 月本院收治的肺部感染患者95 例為研究對(duì)象，其中重癥感染患者50 例作為重癥感染組，非重癥感染患者45 例作為非重癥感染組，所有患者均符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。 重癥感染組中男30 例，女20 例，年齡60~75 歲，平均年齡（65.32±6.12）歲；非重癥感染組中男25 例，女20 例，年齡60~80 歲，平均年齡（68.38±7.21）歲。 選取同期于本院體檢的40 例健康志愿者為對(duì)照組，其中男20 例，女20 例，年齡60~78 歲，平均年齡（66.36±5.21）歲。 三組患者年齡、性別等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）， 具有可比性。 本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情且簽署同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 Trizol 試劑、 反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；Lipofectamine 2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；杜氏改良培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；CD3 試劑盒購(gòu)自加拿大Stem Cell 公司；NEAT1 小干擾RNA（si-NEAT1）、亂序無(wú)意義陰性序列（si-NC）購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司； 膜聯(lián)蛋白V （Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；RIPA 裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量檢測(cè)試劑盒、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔抗人B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 相關(guān)蛋白（Bax）抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司；辣根過(guò)氧化物酶 （HRP） 標(biāo)記的IgG 二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。

1.2.2 外周血T 淋巴細(xì)胞分離與培養(yǎng) 所有受試者均于入組次日清晨抽取外周靜脈血10 mL，其中5 mL 血液樣本經(jīng)3000 r/min 離心15 min，吸取血清置于離心管內(nèi)，置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。 另一部分血液樣本5 mL 置于EDTA-K2 抗凝試管內(nèi)保存，進(jìn)行T 淋巴細(xì)胞分離。按照CD3 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作， 將血血樣轉(zhuǎn)移至聚乙烯管內(nèi)（14 mL）， 加入等體積的1×RBC lysisi Buffer， 充分混勻，加入EasySep 陽(yáng)性選擇混合物，充分混勻，室溫孵育15 min， 加入磁珠， 充分混勻， 室溫孵育10 min， 反復(fù)吹打2~3 次， 將試管置于磁極中放置5 min，4 ℃條件下經(jīng)3000 r/min 離心10 min， 棄上清，遠(yuǎn)離磁極，加入PBS，反復(fù)吹打2~3 次，再次放入磁極中，5 min 后加入PBS 重懸細(xì)胞 （即CD3+T淋巴細(xì)胞）。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 T 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2、相對(duì)濕度95%， 待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 重癥感染患者T 淋巴細(xì)胞接種于24 孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)更換為不含血清的培養(yǎng)基， 分別將si-NC、si-NEAT1 轉(zhuǎn)染至T 淋巴細(xì)胞，分別命名為si-NC 組、si-NEAT1 組， 嚴(yán)格按照Lipofectamine2000 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作， 轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）檢測(cè)NEAT1、miR-495-3p 的表達(dá)水平 采用Trizol 法提取血清、T 淋巴細(xì)胞中的總RNA， 應(yīng)用Nanodrop2000c 超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度。 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作將總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 NEAT1 正向引物5’-TCTGTGTGTCAAAGCAAGGC-3’，反向引物5’-AGATGCCACTGAATCACCCA-3’；miR-495-3p正向引物5’-GACGAAACAAACATGGTGCAC-3’，反向引物5’-TACCCACCATTCCCTTCTCC-3’；U6正向引物5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’；GAPDH 正 向 引 物 5’ -AACGGATTTG GTCGTATTG-3’， 反 向 引 物 5’ -GGAAGATGGTGATGGGATT-3’， 引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)條件：95 ℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s， 共循環(huán)40 次。 置于ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀檢測(cè)NEAT1、miR-495-3p 的 對(duì) 表 達(dá) 量，NEAT1 以GAPDH 為 內(nèi) 參，miR-495-3p 以U6 為 內(nèi) 參， 采 用2-ΔΔCt法 計(jì) 算NEAT1、miR-495-3p 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集各組T 淋巴細(xì)胞， 預(yù)冷PBS 清洗， 加入500 μL Binding Buffer 懸浮細(xì)胞， 依次分別加入5 μL Annexin VFITC 與5 μL PI，充分混勻，室溫避光孵育10 min，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 收集各組T 淋巴細(xì)胞， 加入RIPA 蛋白裂解液， 冰上裂解30 min，4 ℃條件下經(jīng)12000 r/min 離心10 min，吸取上清液。 采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度， 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。 取40 μg 蛋白樣品與上樣緩沖液充分混勻后點(diǎn)樣， 采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDSPAGE）分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗稀釋液（1:1000），4 ℃孵育24 h，TBST 洗滌， 加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h，滴加ECL，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0 進(jìn)行分析， 符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析及兩兩比較的LSD-t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用檢驗(yàn)；采用受試者工作特征（ROC）分析血清NEAT1、miR-495-3p 對(duì)重癥感染的診斷價(jià)值，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清LncRNA NEAT1 與miR-495-3p 表達(dá)量比較 與對(duì)照組相比，非重癥感染組與重癥感染組患者血清NEAT1 的表達(dá)水平顯著升高 （P＜0.05），miR-495-3p 的 表 達(dá) 水 平 顯 著 降 低 （P ＜0.05）；與非重癥感染組相比，重癥感染組患者血清NEAT1 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），miR-495-3p 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組血清LncRNA NEAT1 與miR-495-3p 表達(dá)量比較(±s)

表1 各組血清LncRNA NEAT1 與miR-495-3p 表達(dá)量比較(±s)

注：與對(duì)照組相比，①P<0.05；與非重癥感染組相比，②P<0.05。

組別 n對(duì)照組非重癥感染組重癥感染組F 值P 值40 45 50 NEAT1 miR-495-3p 1.01±0.15 1.68±0.23①2.63±0.51①②247.891＜0.001 1.02±0.21 0.52±0.11①0.30±0.09①②294.474＜0.001

2.2 血清NEAT1、miR-495-3p 對(duì)重癥肺部感染的診斷價(jià)值 繪制ROC 曲線分析血清NEAT1、miR-495-3p 對(duì)重癥肺部感染的診斷價(jià)值， 結(jié)果顯示NEAT1 在重癥肺部感染診斷時(shí)敏感度為82.00%，特 異 度 為84.44%，AUC 面 積 為0.816，95%CI：0.723~0.888，截?cái)嘀禐?.065；miR-495-3p 在重癥肺部感染診斷時(shí)敏感度為78.00%， 特異度為82.22%，AUC 面 積 為0.820，95%CI：0.727~0.891，截?cái)嘀禐?.413，見(jiàn)圖1。

圖1 血清NEAT1、miR-495-3p 對(duì)重癥感染診斷的ROC 分析圖

2.3 重癥肺部感染患者T 淋巴細(xì)胞中NEAT1 與miR-495-3p 表達(dá)量比較 與對(duì)照組相比， 非重癥感染組與重癥感染組患者T 淋巴細(xì)胞中NEAT1的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），miR-495-3p 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與非重癥感染組相比，重癥感染組患者T 淋巴細(xì)胞中NEAT1 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），miR-495-3p 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 重癥肺部感染患者T 淋巴細(xì)胞中NEAT1與miR-495-3p 表達(dá)量比較（±s，n=9）

表2 重癥肺部感染患者T 淋巴細(xì)胞中NEAT1與miR-495-3p 表達(dá)量比較（±s，n=9）

注：與對(duì)照組相比，①P<0.05；與非重癥感染組相比，②P<0.05。

組別 NEAT1對(duì)照組非重癥感染組重癥感染組F 值P 值miR-495-3p 1.00±0.18 0.63±0.11①0.35±0.10①②52.662＜0.001 1.02±0.16 1.52±0.29①2.01±0.18①②46.558＜0.001

2.4 重癥肺部感染患者T 淋巴細(xì)胞凋亡的變化與對(duì)照組相比，非重癥感染組與重癥感染組患者T淋巴細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），Bax 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與非重癥感染組相比，重癥感染組患者T 淋巴細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平顯著降低 （P＜0.05），Bax 蛋白水平顯著升高 （P＜0.05），見(jiàn)圖2、表3。

圖2 重癥肺部感染患者T 淋巴細(xì)胞凋亡的變化

表3 重癥肺部感染患者T 淋巴細(xì)胞凋亡的變化（±s，n=9）

表3 重癥肺部感染患者T 淋巴細(xì)胞凋亡的變化（±s，n=9）

注：與對(duì)照組相比，①P<0.05；與非重癥感染組相比，②P<0.05。

組別對(duì)照組非重癥感染組重癥感染組F 值P 值細(xì)胞凋亡率（%） Bcl-2 蛋白8.57±1.35 19.25±3.24①37.58±4.16①②196.193＜0.001 0.85±0.10 0.52±0.11①0.30±0.05①②84.110＜0.001 Bax 蛋白0.46±0.03 0.68±0.12①0.96±0.15①②44.857＜0.001

2.5 沉默NEAT1 表達(dá)對(duì)重癥肺部感染患者T 淋巴細(xì)胞凋亡的影響 與si-NC 組相比，si-NEAT1 組重癥肺部感染患者T 淋巴細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平顯著升高 （P＜0.05），Bax蛋白水平顯著降低（P＜0.05），miR-495-3p 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表4。

圖3 沉默NEAT1 表達(dá)對(duì)T 淋巴細(xì)胞凋亡的影響

表4 沉默NEAT1 表達(dá)對(duì)T 淋巴細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=9）

表4 沉默NEAT1 表達(dá)對(duì)T 淋巴細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=9）

組別 細(xì)胞凋亡率（%）si-NC 組si-NEAT1 組t 值P 值36.57±5.11 16.45±3.21 10.002＜0.001 Bcl-2 蛋白 Bax 蛋白0.33±0.08 0.87±0.16 9.056＜0.001 0.95±0.17 0.42±0.10 8.062＜0.001 miR-495-3p 0.38±0.17 0.95±0.23 5.979＜0.001

3 討論

T 淋巴細(xì)胞凋亡與感染性疾病發(fā)生過(guò)程有關(guān)，并可促進(jìn)自身免疫及感染的發(fā)生[8-9]。 目前，關(guān)于重癥肺部感染與T 淋巴細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子機(jī)制尚未闡明。 因此，本研究從分子水平探究重癥肺部感染相關(guān)基因?qū) 淋巴細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制。

NEAT1 在感染的巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)， 并可在結(jié)核病免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[10]。研究表明，肺結(jié)核患者外周血中NEAT1 表達(dá)水平升高，其高表達(dá)量與肺結(jié)核的發(fā)展密切相關(guān)[11]。 與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示，NEAT1 在重癥肺部感染患者血清中表達(dá)上調(diào)， 其表達(dá)量高于對(duì)照組與非重癥感染組，提示NEAT1 表達(dá)量升高可能促進(jìn)肺部感染的發(fā)生及發(fā)展。 本研究通過(guò)ROC曲線分析NEAT1 對(duì)重癥肺部感染的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)其靈敏度與特異度均較高，提示NEAT1 可能作為重癥肺部感染的有效分子標(biāo)志物。 研究表明NEAT1 可充當(dāng)miR-495-3p 的海綿分子， 從而促進(jìn)心肌缺血-再灌注損傷[12]。但NEAT1 是否可調(diào)控miR-495-3p 參與重癥肺部感染的發(fā)生過(guò)程尚未可知。 研究表明，miR-495-3p 表達(dá)異?？蓞⑴c肺纖維化、腫瘤等發(fā)生過(guò)程[13-14]。 本研究結(jié)果顯示，miR-495-3p 在重癥肺部感染患者血清中表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步研究顯示miR-495-3p 對(duì)重癥肺部感染具有一定診斷價(jià)值， 可明顯區(qū)別重癥肺部感染與非重癥肺部感染，提示miR-495-3p 可能作為重癥肺部感染診斷及治療的潛在靶標(biāo)基因。

T 細(xì)胞凋亡與增殖在維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，T 淋巴細(xì)胞凋亡可促使機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變[15]。本研究為探討重癥肺部感染患者T 淋巴細(xì)胞凋亡的原因， 采用磁珠分選方法分離重癥肺部感染患者T 淋巴細(xì)胞，結(jié)果顯示，重癥肺部感染患者T 淋巴細(xì)胞凋亡率明顯高于非重癥感染患者，Bcl-2 表達(dá)量降低，Bax 表達(dá)量升高， 說(shuō)明重癥感染環(huán)境下T 淋巴細(xì)胞凋亡明顯增加， 隨著病情的加重T 淋巴細(xì)胞凋亡率也隨之升高。 提示重癥肺部感染患者外周血T 淋巴細(xì)胞數(shù)目減少可能引發(fā)免疫抑制。 同時(shí)本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，重癥肺部感染患者T 淋巴細(xì)胞中NEAT1 的表達(dá)水平明顯升高，miR-495-3p 的表達(dá)水平明顯降低， 進(jìn)一步分析顯示沉默NEAT1 表達(dá)后T 淋巴細(xì)胞凋亡率明顯降低，Bcl-2 表達(dá)量顯著升高，Bax 表達(dá)量顯著降低， 提示重癥肺部感染患者可通過(guò)降低抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)及促進(jìn)凋亡蛋白Bax 表達(dá)，從而增加T 淋巴細(xì)胞凋亡， 而沉默NEAT1 表達(dá)可明顯抑制T 淋巴細(xì)胞凋亡。

綜上所述，NEAT1 在重癥肺部感染患者血清中呈高表達(dá)，miR-495-3p 表達(dá)量降低， 二者對(duì)重癥肺部感染具有一定診斷價(jià)值，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，沉默NEAT1 表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)miR-495-3p 表達(dá)從而抑制重癥肺部感染患者T 淋巴細(xì)胞凋亡，可為臨床診斷及治療重癥肺部感染提供理論依據(jù)。