不同保存方式對新鮮母乳中免疫活性因子、細(xì)菌菌落及營養(yǎng)成分的影響

周曉萍，劉璐，陳兵兵

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科，河南 鄭州450000）

母乳是嬰兒成長最安全，最完整的天然食物，含有滿足嬰兒成長所需的營養(yǎng)和抗體， 其中的免疫球蛋白有著預(yù)防和保護(hù)嬰兒不被感染和一些慢性疾病的發(fā)生，還有利于嬰兒腸道健康的菌群，有助于嬰兒健康生長[1-2]。 但臨床上由于多因素的影響，如低體重、生理性黃疸等新生兒需進(jìn)行治療而不能及時的進(jìn)行哺乳， 故需保存母乳來實現(xiàn)母乳喂養(yǎng)。 低溫保存是公認(rèn)保存母乳的方式[3]，但對溫度和容器的選擇并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)， 因此本研究以母乳中的免疫球蛋白、細(xì)菌菌落水平以及營養(yǎng)成分為主要觀察指標(biāo)，比較母乳在不同溫度儲存條件下各成分變化情況，旨在探討母乳最佳儲存方式。

1 資料與方法

1.1 一般資料 經(jīng)本研究倫理委員會審核通過，于2018 年10 月至2020 年10 月選取于我院分娩42d 后的86 例產(chǎn)婦， 經(jīng)產(chǎn)婦及其家屬同意后采集新鮮母乳。 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）產(chǎn)婦身體健康且飲食良好；（2） 為足月分娩；（3） 新生兒健康且純母乳喂養(yǎng)；（4）妊娠后體質(zhì)指數(shù)≤28 kg/m2。 排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）乳頭或乳暈有破損；（2）有乳腺炎或有全身性感染者；（3）有服用特殊藥物者。

1.2 方法 母乳采集：將乳頭及乳暈進(jìn)行清潔待干后，采用吸奶器進(jìn)行母乳采集，約140 mL，于30 min 內(nèi)進(jìn)行分裝，分為7 份，每份20 mL，1 份新鮮母乳放入無菌燒杯中， 其余6 份分別儲放于聚乙烯儲奶瓶中， 將儲奶瓶分別存放至4℃、-18℃和-20℃的冰箱中（每個溫度條件各2 份）。儲奶瓶均經(jīng)無菌消毒。1 份新鮮母乳進(jìn)行即時檢測。在4℃條件保存的母乳分別于存放48 h、72 h 后進(jìn)行檢測，在-18℃和-20℃條件保存的母乳分別于存放30 d和90 d 后檢測。 母乳采集時間點均為下午14：00～15：00 左右，產(chǎn)婦情緒良好。

1.3 觀察指標(biāo) 于設(shè)定時間點檢測母乳中的免疫活性因子、細(xì)菌菌落水平、菌群種類分布，營養(yǎng)成分。

1.3.1 免疫活性因子 采用ELISA 法 （試劑盒：武漢益普生物科技有限公司， 酶標(biāo)儀： 邁瑞MR-96A。）檢測母乳中的乳鐵蛋白（LF）；采用熒光化學(xué)法（儀器：邁瑞全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，型號：CL-2000i）檢測母乳中白介素細(xì)胞-6（IL-6），腫瘤壞死因子（TNF-α）水平。 嚴(yán)格按照試劑盒、儀器說明書以及操作流程進(jìn)行。

1.3.2 細(xì)菌菌落 將母乳取出后在40℃溫水中進(jìn)行融化或復(fù)溫，并搖晃均勻，后進(jìn)行離心（3000 r/15 min）， 取下層沉積。 制作血平板， 進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)（35℃，24～48 h，5% CO2）。

細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)束后取出血平板，制備細(xì)菌懸液，采用比濁法檢測細(xì)菌菌落計數(shù)。 （儀器：法國梅里埃DENSIMAT 比濁儀，貨號：99234）。 嚴(yán)格按照操作流程進(jìn)行。

1.3.3 營養(yǎng)成分 采用全自動母乳分析儀（廠家：山東國康，型號：GK-9000）檢測其脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物水平。 嚴(yán)格按照儀器說明書及操作流程進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 滿足正態(tài)分布且方差齊的計量資料采用（±s）表示，組間差異采用兩樣本獨立t 檢驗比較， 重復(fù)測量方差分析比較組內(nèi)母乳保存不同時間點差異，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同保存方式母乳的免疫活性因子比較 與新鮮母乳比較，在各設(shè)定條件下的LF 水平比較無明顯差異（P＞0.05），IL-6 和TNF-α 水平比較有明顯差異 （P＜0.05），IL-6 水平在各設(shè)定條件下隨著時間的推移逐漸下降（P＜0.05），TNF-α 水平在4℃的條件下保存72 h 下降， 在-18℃與-20℃的條件下保存90 d 均上升（P＜0.05）。 各免疫活性因子水平在-18℃與-20℃的條件下的各時間點比較均無明顯差異（P＞0.05）。 見表1。

表1 不同保存方式母乳的免疫活性因子比較（±s）

表1 不同保存方式母乳的免疫活性因子比較（±s）

注： 與新鮮母乳比較*P＜0.05。 與-18℃保存條件下30 d 比較①P＜0.05,與-18℃保存條件下90 d 比較②P＜0.05。4℃保存條件下與新鮮母 乳 比 較，LF 水 平 （F=0.065,P=0.937），IL-6 水 平 （F=8.000,P＜0.001），TNF-α 水平 （F=3.433,P=0.034），-18℃保存條件下與新鮮母乳比較，LF 水平 （F=0.936,P=0.393），IL-6 水平 （F=13.101,P＜0.001），TNF-α 水平 （F=9.602,P＜0.001），-20℃保存條件下與新鮮母乳比較，LF 水平 （F=0.403,P=0.669），IL-6 水平 （F=11.811,P＜0.001），TNF-α 水平（F=13.376,P＜0.001）。

保存條件 時間點新鮮母乳4℃-18℃-20℃48 h 72 h 30 d 90 d 30 d 90 d LF（mg/mL） IL-6（pg/mL）3.98±1.02 4.01±0.96 4.02±0.85 4.28±1.64 4.17±1.89 4.05±1.54①4.15±1.49②9.49±5.26 7.26±3.72 7.21±3.63*6.96±2.97*6.84±2.76*7.36±2.23*①7.12±2.13*②TNF-α（pg/mL）9.54±3.52 8.84±2.41 8.43±2.34*9.86±3.14 11.54±2.96*9.96±2.87①11.87±3.02*②

2.2 不同保存方式母乳的細(xì)菌菌落計數(shù)比較 與新鮮母乳比較， 各設(shè)定條件下的細(xì)菌菌落計數(shù)比較無明顯差異（P＞0.05）。 見表2。 在4℃保存72 h后發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌生長，經(jīng)鑒定有52 例為革蘭陽性菌生長，其中金黃色葡萄球菌12 例，表皮葡萄球菌34 例，變異庫克菌6 例，有34 例革蘭陰性菌生長，其中陰溝腸桿菌24 例，肺炎克雷伯桿菌10 例。

表2 不同保存方式母乳的細(xì)菌菌落計數(shù)比較（×10 cfu/mL，n=86，±s）

表2 不同保存方式母乳的細(xì)菌菌落計數(shù)比較（×10 cfu/mL，n=86，±s）

注：4℃保存條件下與新鮮母乳比較 （F=2.443,P=0.089），-18℃保存條件下與新鮮母乳比較（F=1.328,P=0.267），-20℃保存條件下與新鮮母乳比較（F=1.706,P=0.184）。

保存條件新鮮母乳4℃時間點 細(xì)菌菌落計數(shù)-18℃-20℃48 h 72 h 30 d 90 d 30 d 90 d 2.15±1.23 2.19±1.65 2.65±1.97 1.96±1.45 1.82±1.31 1.87±1.13 1.85±1.21

2.3 不同保存方式母乳的營養(yǎng)成分比較 與新鮮母乳比較，在各設(shè)定條件下母乳中的脂肪、蛋白質(zhì)以及碳水化合物水平均隨著時間的推移下降 （P<0.05），各營養(yǎng)物質(zhì)在4℃的保存條件下僅脂肪水平在72 h 后下降明顯（P<0.05），其余物質(zhì)水平無明顯差異（P<0.05）。 在-18℃與-20℃的條件下各營養(yǎng)物質(zhì)下降趨勢明顯（P<0.05）。 見表3。

表3 不同保存方式母乳的營養(yǎng)成分比較

3 討論

母乳中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)， 是新生兒初期最主要的營養(yǎng)來源， 可為新生兒提供大量的免疫因子，提高其免疫力，預(yù)防其受到感染[4-5]。 且母乳中的蛋白質(zhì)與脂肪在新生兒腸道內(nèi)易被吸收和消化，有助于嬰兒健康成長[6-7]。 母乳公認(rèn)的保存條件為低溫保存， 但對其保存的最佳溫度及時間尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究就母乳保存條件進(jìn)行探討，將86例健康產(chǎn)婦的母乳進(jìn)行不同溫度、 不同時間的保存，觀察其營養(yǎng)物質(zhì)、免疫活性因子及細(xì)菌菌落的變化。 結(jié)果顯示，在各設(shè)定條件下，雖然隨著時間的推移和溫度的下降細(xì)菌菌落計數(shù)有下降趨勢，但比較無明顯差異，Pandya SP 等[8]研究也提到，母乳細(xì)菌菌落在低溫狀態(tài)下仍具有活性， 因而低溫保存母乳是有效維持其菌落活性的手段。

LF 是母乳中的重要成分之一，具有抗菌、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能， 是先天防御系統(tǒng)的主要組成成分，為新生兒胃腸道保駕護(hù)航[9]。 本研究顯示，與新鮮母乳比較，在各設(shè)定條件下的LF 水平比較無明顯差異，說明LF 的穩(wěn)定性較好。 IL-6和TNF-α 細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能，屬于促炎細(xì)胞因子[10]，研究顯示，IL-6 水平在各設(shè)定條件下隨著時間的推移逐漸下降，且在4℃的條件下保存72 h 后有顯著下降趨勢， 猜測其可作為檢測母乳是否新鮮的指標(biāo)。TNF-α 水平在4℃的條件下保存72 h 下降， 可能與母乳在此條件下的細(xì)菌繁殖，TNF-α 消耗有關(guān)。 但TNF-α 水平在-18℃與-20℃的條件下保存90 d 均上升，考慮其活性在低溫環(huán)境下仍然存在。

在母乳中的營養(yǎng)物質(zhì)以脂肪、 蛋白質(zhì)以及碳水化合物為主要營養(yǎng)成分，本研究顯示，與新鮮母乳比較，在4℃的保存條件下，僅脂肪水平在72 h后下降明顯，其他營養(yǎng)成分水平相對較穩(wěn)定，但存在細(xì)菌生長現(xiàn)象。 分析其原因可能是，脂肪酶在低溫條件下仍存在活性， 因而脂肪分解作用仍然存在[11]，細(xì)菌生長菌落以革蘭陽性菌為主，因而不建議在4℃的條件下保存超過72 h。 于-18℃與-20℃的條件下各營養(yǎng)成分水平有明顯的下降趨勢，且隨著時間的推移，下降趨勢明顯。 可能與蛋白質(zhì)與碳水化合物黏附于容器壁上有關(guān)。Orbach R 等[12]研究提到， 在不同儲存溫度下母乳中蛋白質(zhì)與碳水化合物的組成無顯著變化，本研究結(jié)論與不同。 原因可能由于Orbach R 等采用超聲波進(jìn)行均化，而本研究采取手動均化的原因。 從結(jié)果中可以看出碳水化合物的下降速度較緩慢， 可能與碳水化合物黏附于容器壁上的速度有關(guān)。 本文所觀察的三類物質(zhì)在-18℃與-20℃中的各時間點比較無明顯差異， 提示在此兩種溫度下進(jìn)行母乳保存的效果可能一致。

綜上所述， 在低溫環(huán)境下保存母乳對細(xì)菌菌落無影響， 對免疫活性因子和營養(yǎng)物質(zhì)有一定的影響，結(jié)合本研究結(jié)論，建議在4℃的保存條件下保存時長不應(yīng)超過72 h，在-18 ℃與-20 ℃的保存條件下保存時長不應(yīng)超過90 d。 因母乳成分復(fù)雜，本研究因時間和條件上的局限，觀察的指標(biāo)較少，今后仍需深入進(jìn)行研究。