ITGAV過表達(dá)與膽管癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系

陳平平，張震生，武金才，鄭進(jìn)方，唐 榮，李夢婷，章家超，曾勇超，陳 良

(海南省人民醫(yī)院/海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院肝膽外科,海南 海口 570311)

近年來，膽管癌(發(fā)生于膽管上皮的腺癌)的發(fā)病率明顯上升。膽管癌起病隱匿，臨床表現(xiàn)無特異性，早期診斷困難，臨床確診時(shí)大部分患者已屬晚期，失去了有效的手術(shù)治療機(jī)會(huì)，同時(shí)術(shù)后復(fù)發(fā)率高，對放化療不敏感，患者預(yù)后極差[1-2]。因此，研究膽管癌的生物學(xué)特性，探究其發(fā)病機(jī)制，尋找早期診斷和及時(shí)干預(yù)的方法，是提高膽管癌診治效果的關(guān)鍵。整合素是由α、β兩個(gè)亞基組成的一組跨膜糖蛋白及細(xì)胞黏附受體蛋白，其主要作用為介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的連接，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外信號、基因表達(dá)及細(xì)胞分化，激活相關(guān)通路，同時(shí)，其在調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)腫瘤血管形成能力及誘導(dǎo)藥物耐受等方面具有非常重要的作用[3-5]。整合素αv(integrin αv,ITGAV)為整合素家族的重要成員之一，在改變腫瘤微環(huán)境、促進(jìn)腫瘤的發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，其過表達(dá)與前列腺癌、口腔鱗癌、胃癌、肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性[4-7]。ITGAV在眼瞼鱗狀癌中過表達(dá)，其過表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在喉癌和咽癌中ITGAV過表達(dá)，其過表達(dá)與腫瘤分化、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，ITGAV過表達(dá)患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯高于低表達(dá)患者[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，ITGAV過表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移[10]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)整合素可與四跨膜蛋白相結(jié)合形成復(fù)合體，其復(fù)合體是腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要分子[11]。目前有關(guān)ITGAV在膽管癌中的表達(dá)及其在膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后判斷等方面的潛在價(jià)值尚不明確，本研究通過檢測ITGAV在膽管癌中的表達(dá)水平，結(jié)合臨床病理特征，初步探討其在膽管癌中的潛在臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

選取我院2010年1月至2016年1月行根治性手術(shù)切除的膽管癌患者374例，隨機(jī)分為Ⅰ組(80例)和Ⅱ組(294例)，取患者術(shù)中切除的癌組織及癌旁組織(癌旁組織均取自距離腫瘤組織邊緣2 cm以外區(qū)域)。納入標(biāo)準(zhǔn)：樣本經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為膽管癌；患者術(shù)前未行放療、化療、靶向治療及免疫治療；腫瘤切除完整，切緣凈，無癌組織殘留，局部受累淋巴結(jié)清掃完全；臨床及隨訪資料完整。所有患者術(shù)后隨訪5年，隨訪時(shí)間截止到2020年12月。腫瘤TNM分期參考國際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control，UICC)標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)間分為早期復(fù)發(fā)組(復(fù)發(fā)時(shí)間<1年)和未復(fù)發(fā)或晚期復(fù)發(fā)組(復(fù)發(fā)時(shí)間≥1年)。2組患者的臨床病理特征見表1。采用RT-PCR和Western blot檢測Ⅰ組ITGAV的表達(dá)；Ⅱ組用于大樣本組織芯片檢測。本研究通過我院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)[醫(yī)倫研(2018)202號]。

表1 2組患者臨床病理特征[例(%)]

1.2 主要試劑

ITGAV單克隆抗體、GAPDH抗體購自英國Abcam公司；ITGAV及GAPDH引物由美國Invitrogen公司合成；TRIzol提取試劑盒購自美國Gibco公司；逆轉(zhuǎn)錄、聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；蛋白印跡雜交顯影化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)購自美國Pierce公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清標(biāo)記辣根過氧化物酶的羊抗兔二抗均購自武漢博士德公司。

1.3 RT-PCR檢測

按照TRIzol提取試劑盒說明書從膽管癌組織及癌旁組織提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，建立RT-PCR反應(yīng)體系，以GAPDH為內(nèi)參。引物由Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，選擇最佳引物，ITGAV上游引物序列5’-AAGCTGAGCTATCGTTTCC-3’，下游引物序列5’-GCACAGGAAAGTCTTGCTAAGG-3’；GAPDH上游引物序列5’-CCACTAGGCGCTCACTGTTCT-3’，下游引物序列5’-GCGAACTCACCCGTTGACT-3’。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 45 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，共25個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下分析PCR結(jié)果。拍照后用圖像分析儀分析ITGAV條帶和GAPDH條帶的灰度，計(jì)算兩者的比值。

1.4 Western blot

參考文獻(xiàn)[12-13]從實(shí)驗(yàn)樣本組織提取細(xì)胞總蛋白，以BCA法測定蛋白濃度。將樣品與蛋白加樣緩沖液混合后100 ℃水浴5 min變性，經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(20 mA恒定電流條件下電泳60 min)，在恒定電壓20 V條件下轉(zhuǎn)膜17 min，5%脫脂奶粉室溫封閉20 min后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。10%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗為ITGAV(1∶200)和GAPDH(1∶1 000)，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG(1∶4 000)。聚偏二氟乙烯膜依次與抗體作用后，加入蛋白印跡化學(xué)發(fā)光試劑，以化學(xué)發(fā)光法將膜孵育5 min，曝光、顯影、定影成像。

1.5 TGAV組織芯片和免疫組化染色

組織芯片檢測294例膽管癌患者的ITGAV表達(dá)。組織芯片制備參考文獻(xiàn)[14]，ITGAV免疫組化染色采用SP法，操作過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。DAB顯色，蘇木素復(fù)染后鏡檢。ITGAV表達(dá)陽性細(xì)胞為細(xì)胞膜有棕褐色顆粒，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)占同類計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比：陽性細(xì)胞數(shù)<50%為陰性，陽性細(xì)胞數(shù)≥50%為陽性[14]。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)有陰性和陽性對照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，以已知陽性肝癌組織片作為陽性對照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 膽管癌組織及癌旁組織中ITGAV的表達(dá)

膽管癌組織中ITGAV mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

a～c: RT-PCR與Western blot檢測ITGAV在膽管癌組織及癌旁組織中的表達(dá) WB：Western blot；T:膽管癌組織;N:癌旁組織圖1 膽管癌組織和癌旁組織中ITGAV的mRNA和蛋白表達(dá)水平

2.2 組織芯片檢測ITGAV表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示，ITGAV陽性表達(dá)于膽管癌細(xì)胞膜或細(xì)胞漿中，黃染，陽性高表達(dá)者著色深，呈深棕色，在膽管癌組織中呈不均一性；而在癌旁組織中ITGAV呈淡染(圖2)。在161例患者的膽管癌組織中ITGAV陽性表達(dá)，在133例患者的膽管癌組織中ITGAV低表達(dá)或不表達(dá)，ITGAV陽性表達(dá)率為54.8%。

a:ITGAV在膽管癌組織中陽性表達(dá)；b:ITGAV在癌旁組織中陰性表達(dá)；c:ITGAV在膽管癌組織中低表達(dá)；d:ITGAV在癌旁組織中低表達(dá)圖2 組織芯片檢測ITGAV在膽管癌組織及癌旁組織中的表達(dá)(免疫組化染色×200)

2.3 ITGAV在膽管癌組織中差異表達(dá)與術(shù)后侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系

ITGAV差異表達(dá)與腫瘤個(gè)數(shù)、腫瘤直徑、腫瘤包膜完整(邊界完整)、肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或局部侵犯、血管或膽管侵犯、TNM分期、Edmondson分級等轉(zhuǎn)移潛能指標(biāo)相關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡、血清CA199水平、肝硬化、HBsAg等無關(guān)(P>0.05)，見表2。ITGAV在早期復(fù)發(fā)組中過表達(dá)，ITGAV過表達(dá)的161例患者中有119例出現(xiàn)術(shù)后早期復(fù)發(fā)；而ITGAV在未復(fù)發(fā)或晚期復(fù)發(fā)組中低表達(dá)，ITGAV低表達(dá)的133例患者中有44例出現(xiàn)術(shù)后早期復(fù)發(fā)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025)，見表3。Kaplan-Meier分析顯示，與ITGAV低表達(dá)膽管癌患者比較，ITGAV過表達(dá)膽管癌患者術(shù)后更易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)時(shí)間較短(HR=1.90；95%CI：1.41～2.62；P<0.001)，且術(shù)后生存時(shí)間較短(HR=1.95；95%CI：1.42～2.73；P<0.001)，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。COX回歸模型分析顯示，ITGAV過表達(dá)是膽管癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)間(HR=1.73；95%CI：1.13～2.63；P=0.011)和術(shù)后生存時(shí)間(HR=1.65；95%CI：1.08～2.51；P=0.021)的獨(dú)立影響因素(表4)。

表2 ITGAV差異表達(dá)與膽管癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

表3 294例膽管癌患者腫瘤組織中ITGAV表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的關(guān)系

a：復(fù)發(fā)曲線；b:總生存曲線圖3 ITGAV表達(dá)水平與術(shù)后復(fù)發(fā)率及生存率的關(guān)系

表4 294例膽管癌患者腫瘤組織中ITGAV表達(dá)與復(fù)發(fā)時(shí)間及生存時(shí)間的COX回歸分析

3 討論

本團(tuán)隊(duì)前期的研究發(fā)現(xiàn)，整合素α6在肝癌組織中過表達(dá)，其過表達(dá)與肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測整合素家族另一重要成員ITGAV在膽管癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，分析ITGAV表達(dá)與膽管癌轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，ITGAV過表達(dá)可促進(jìn)膽管癌轉(zhuǎn)移，且與術(shù)后復(fù)發(fā)及生存時(shí)間密切相關(guān)，ITGAV可作為膽管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)和生存時(shí)間的潛在分子預(yù)測指標(biāo)。

整合素是一類細(xì)胞外基質(zhì)的跨膜黏附受體家族,目前發(fā)現(xiàn)整合素家族共有26個(gè)成員，其成員是由α亞基和β亞基結(jié)合構(gòu)成的異源二聚體跨膜糖蛋白，并以異二聚體的方式發(fā)揮功能，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲，細(xì)胞轉(zhuǎn)化，血管生成及轉(zhuǎn)移等過程[16-18]。有研究表明，整合素與細(xì)胞外配體的結(jié)合可把細(xì)胞外信號傳入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)整合素(特別是β亞基)通過其胞內(nèi)域直接作用于許多胞內(nèi)結(jié)合蛋白，促進(jìn)細(xì)胞骨架重組，影響細(xì)胞與基質(zhì)的黏附或者改變骨架蛋白，從而提高或降低細(xì)胞的遷移和浸潤能力[19-21]。ITGAV作為家族重要成員，可與多個(gè)β亞基結(jié)合組成異二聚體，在多種腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮非常重要的作用[8]。有研究表明，ITGAV過表達(dá)于食管癌，其過表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及預(yù)后不良顯著相關(guān)[22]。ITGAV過表達(dá)可提高腫瘤細(xì)胞的遷移能力已在結(jié)腸癌細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌中腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力與ITGAV過表達(dá)密切相關(guān)[24]。目前已經(jīng)證實(shí)ITGAV在子宮內(nèi)膜癌、鼻咽癌、胃癌、胰腺癌等多種癌癥中過表達(dá)，其過表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。

本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選擇膽管癌患者的膽管癌組織及癌旁組織(Ⅰ組)，通過RT-PCR與Western blot檢測發(fā)現(xiàn)ITGAV在膽管癌組織中的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，提示在膽管癌及癌旁組織中ITGAV存在顯著差異表達(dá)；ITGAV的差異表達(dá)可能與膽管癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。我們在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行另外一組(Ⅱ組)組織芯片檢測分析，結(jié)果顯示，ITGAV過表達(dá)與腫瘤個(gè)數(shù)、腫瘤直徑、腫瘤包膜完整(邊界完整)、肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或局部侵犯、血管或膽管侵犯、TNM分期、Edmondson分級等轉(zhuǎn)移潛能指標(biāo)密切相關(guān)，而與性別、年齡、血清CA199水平、肝硬化、HBsAg等無關(guān)。提示ITGAV是膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)指標(biāo)。Kaplan-Meier分析顯示，ITGAV過表達(dá)患者術(shù)后更易復(fù)發(fā)，生存時(shí)間更短，表明ITGAV過表達(dá)可促進(jìn)膽管癌的侵襲轉(zhuǎn)移，并與患者的生存預(yù)后密切相關(guān)，提示檢測ITGAV表達(dá)對膽管癌患者的預(yù)后判斷有一定的臨床價(jià)值。有研究表明，沉默ITGAV后可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[8]；在肝癌細(xì)胞研究中ITGAV過表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[25]。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)下一步擬應(yīng)用慢病毒干擾等技術(shù)建立ITGAV高低表達(dá)膽管癌細(xì)胞株，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)ITGAV表達(dá)與膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

已有研究發(fā)現(xiàn)，整合素可與多種四跨膜蛋白相結(jié)合形成復(fù)合體，該復(fù)合體目前被認(rèn)為是與惡性腫瘤進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵分子，是目前的研究熱點(diǎn)[9]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合體主要通過加強(qiáng)整合素介導(dǎo)的黏附能力，使得細(xì)胞從整合素配體上分離的能力大大減弱[9,26]。在胰腺癌細(xì)胞系中研究發(fā)現(xiàn)，整合素α6β4可與Tspan8結(jié)合形成四跨膜網(wǎng)絡(luò)，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的遷移[27]。在Tspan1與整合素α6β1相互作用研究中發(fā)現(xiàn)，復(fù)合體可通過誘導(dǎo)膽管癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而加速膽管腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[28]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，整合素α6可以與Tspan8形成復(fù)合體(ITGα6-Tspan8)并相互作用，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，共同推進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[12]。據(jù)此我們認(rèn)為，ITGAV可與四跨膜蛋白結(jié)合形成ITGAV-TM4SF復(fù)合體，復(fù)合體相互作用共同促進(jìn)膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移。但I(xiàn)TGAV與何種TM4SF結(jié)合形成復(fù)合體？復(fù)合體共同作用是否因誘導(dǎo)了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而推進(jìn)腫瘤的進(jìn)展？其具體作用的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。目前四跨膜蛋白與整合素的關(guān)系在腫瘤進(jìn)展中的作用機(jī)制仍未闡明，下一步我們擬通過信號網(wǎng)絡(luò)通路進(jìn)一步闡述ITGAV促進(jìn)膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

綜上，本研究結(jié)果初步證明膽管癌中ITGAV過表達(dá)可以促進(jìn)膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移，并與膽管癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)及生存預(yù)后密切相關(guān)，可作為膽管癌術(shù)后復(fù)發(fā)和預(yù)后的潛在分子預(yù)測指標(biāo)。