DNA結(jié)合分化抑制蛋白-1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞干細(xì)胞特性與血管形成的機(jī)制初探

賀洪洲，陳 萍，梁 華，李太軍，李小榮

(內(nèi)江市第一人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，四川 內(nèi)江 641000)

乳腺癌是女性常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型，全世界每年有超過(guò)150萬(wàn)女性被診斷出患有乳腺癌，占女性所有癌癥的25%[1]。乳腺癌通常從導(dǎo)管過(guò)度增殖開(kāi)始，在各種致癌因素的不斷刺激下發(fā)展為良性腫瘤，后續(xù)形成轉(zhuǎn)移癌，且可以轉(zhuǎn)移到骨、肝、肺和腦等遠(yuǎn)處器官，導(dǎo)致無(wú)法治愈[2-3]。近年來(lái)，乳腺癌的理論與臨床研究均取得了很大進(jìn)展，患者的病死率也有所下降,但據(jù)統(tǒng)計(jì)乳腺癌仍然是20～59歲女性癌癥死亡的首要原因。

DNA結(jié)合分化抑制蛋白-1(inhibitors of DNA binding-1，ID-1)是一種螺旋—環(huán)—螺旋(helix-loop-helix,HLH)蛋白，可與HLH家族轉(zhuǎn)錄因子成員形成異源二聚體，其編碼的蛋白質(zhì)沒(méi)有DNA結(jié)合活性，但會(huì)抑制與其相互作用的HLH蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合及轉(zhuǎn)錄[4]。ID-1參與細(xì)胞生長(zhǎng)、衰老和分化過(guò)程，并且與多種腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性[5-6]。已有研究表明，ID-1 mRNA在乳腺癌組織中高表達(dá)，且其與患者的無(wú)病生存率和總體生存率呈負(fù)相關(guān)[7]。鑒于此，本研究通過(guò)建立抑制或過(guò)表達(dá)ID-1的乳腺癌細(xì)胞系，經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)探究ID-1是否參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞干細(xì)胞特性及血管形成，并探討其分子機(jī)制，以期為乳腺癌的治療提供新的靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2019年6月至2020年12月在我院進(jìn)行手術(shù)切除治療的女性乳腺浸潤(rùn)性癌(非特指型)患者的癌組織與癌旁組織標(biāo)本共42例?；颊吣挲g29～68歲，平均(46.58±4.50)歲。所有患者的臨床、病理資料均完整，術(shù)前均未接受放療、化療、免疫制劑治療等，未患其他腫瘤或重大疾病。按2019版WHO乳腺腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[8]對(duì)患者進(jìn)行分級(jí)分期：Ⅰ級(jí)3例、Ⅱ級(jí)29例、Ⅲ級(jí)10例；TNM分期：Ⅰ期4例、Ⅱ期31例、Ⅲ期 7例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者11例。本研究已通過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)：20190528128)，組織標(biāo)本收集前患者或家屬均知情同意。

1.2 主要材料與試劑

人乳腺癌細(xì)胞系SUM159和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs(中科院上海細(xì)胞庫(kù))，Ham’s F-12K培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素及胰蛋白酶(美國(guó)HyClone公司)，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒和Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，SensiFast cDNA合成試劑盒和SensiFastTMSYBR Hi-ROX試劑盒(美國(guó)Meridian公司)，腫瘤細(xì)胞球誘導(dǎo)因子(美國(guó)Sigma公司)，細(xì)胞培養(yǎng)板和Matrigel膠(美國(guó)Corning 公司)，PVDF膜(瑞氏Roche公司)，結(jié)晶紫染液、DAB免疫組織化學(xué)染色試劑盒和BeyoECL Plus試劑盒(上海碧云天生物研究所)，免疫熒光染色試劑盒(南京博恩生物公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和異硫氰酸熒光素?zé)晒鈽?biāo)記的小鼠抗兔(北京博奧森公司)，ID-1、p-Src、Src及GAPDH抗體(英國(guó)Abcam公司)，shRNA-NC、shRNA-ID-1、pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-ID-1質(zhì)粒以及引物序列均由廣州銳博生物公司構(gòu)建合成。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色 將收集的乳腺癌組織及癌旁組織置于4%多聚甲醛中，室溫固定過(guò)夜，制備蠟塊，切成厚度為4 μm的切片。65 ℃烤箱內(nèi)烤片2 h，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，流水沖洗后，置于枸櫞酸緩沖液煮沸15 min修復(fù)抗原，冷卻后，通過(guò)3%過(guò)氧化氫去離子水溫育10 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶活性，再以10%山羊血清于37 ℃下封閉非特異性抗原30 min。加入一抗工作液，4 ℃共孵育過(guò)夜，次日，棄去一抗工作液，加入對(duì)應(yīng)二抗，37 ℃孵育40 min，PBS清洗后，利用DAB顯色液顯色，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分色3 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察并攝取圖片。ID-1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，著色顯示棕黃色至棕色顆粒表示陽(yáng)性。陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分：≤5%記0分，6%～25%記 1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，≥76%為 4分；染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色記0分，黃色記1分，棕黃色記2分，棕色至棕褐色記3分。兩項(xiàng)指標(biāo)得分的乘積為 0～4分表示陰性結(jié)果，5～12分表示陽(yáng)性結(jié)果。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將SUM159細(xì)胞復(fù)蘇后，添加含10%胎牛血清和1%青—鏈霉素雙抗的Ham’s F-12K培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代繼續(xù)培養(yǎng)。將細(xì)胞隨機(jī)分為Control組、shRNA-NC組、shRNA-ID-1組、pcDNA3.1-NC組、pcDNA3.1-ID-1組，采用Lipofectamine 2000將shRNA-NC、shRNA-ID-1、pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-ID-1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至對(duì)應(yīng)組的SUM159細(xì)胞中，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞和培養(yǎng)上清液，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，Control組細(xì)胞正常培養(yǎng)，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 在各組SUM159細(xì)胞中加入Trizol試劑液，使細(xì)胞充分裂解，按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取細(xì)胞總RNA，核酸測(cè)定儀測(cè)定RNA含量和純度。利用一步法qRT-PCR進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，按照SensiFast cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。以獲得的cDNA為模板，在qRT-PCR系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)ID-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量，按照SensiFastTMSYBR Hi-ROX試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以β-actin作為內(nèi)參基因。擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s、60 ℃10 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列：ID-1上游序列5’-ACGGCTGTTACTCACGCCTC-3’，下游序列5’-GCTGGAGAATCTCCACCTTGC-3’；β-actin上游序列5’-TGCGTGACATGAGAAG-3’，下游序列5’-GCTCGTAGCTTCTCCA-3’。以2-ΔΔCt計(jì)算ID-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 平板集落形成實(shí)驗(yàn) 將各組SUM159細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，按照每皿500個(gè)細(xì)胞的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕晃動(dòng)使細(xì)胞均勻分散，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的集落時(shí)，終止培養(yǎng)，甲醇室溫固定，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS清洗后，顯微鏡下計(jì)數(shù)各組的集落數(shù)目。

1.3.5 腫瘤球形成實(shí)驗(yàn) 將各組SUM159細(xì)胞以1×104/孔的密度接種于低黏附細(xì)胞6孔板中，添加含有10 ng/mL bFGF、5 μg/mL胰島素、4 g/L BSA、1% B27及20 ng/mL EGF的培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，倒置顯微鏡下觀察腫瘤球體的形成與生長(zhǎng)情況，并獲取圖像，計(jì)數(shù)球體個(gè)數(shù)。

1.3.6 HUVECs小管形成實(shí)驗(yàn) 將Matrigel膠在4 ℃下過(guò)夜溶解，與緩沖液按照1∶1比例混合進(jìn)行稀釋?zhuān)?0 μL加入96孔板中，均勻鋪開(kāi)，置于37 ℃下至基質(zhì)膠成固體狀。待HUVECs細(xì)胞消化后，收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液與無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液按照1∶1比例混合，重懸HUVECs細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，以1×104/孔的密度接種于鋪好Matrigel膠的96孔板內(nèi)，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h后，倒置顯微鏡下觀察各組成管效果并攝取圖像，采用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.3.7 免疫熒光染色法 將各組SUM159細(xì)胞以1×105/皿的密度接種于含爬片的培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，PBS清洗爬片，使用4%多聚甲醛室溫固定20 min，加入細(xì)胞通透劑0.1% Triton X-100處理5 min后，再以5% BSA封閉穿孔20 min，PBS清洗后，于玻片上滴加一抗工作液，4 ℃孵育過(guò)夜，次日棄去一抗工作液，并加入熒光二抗，避光條件下室溫染色2 h，PBS清洗，用DAPI在避光條件下孵育15 min，中性樹(shù)膠封片，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察染色情況并攝取圖像。

1.3.8 Western blot 在各組SUM159細(xì)胞中添加含NP-40的PIPES緩沖液裂解細(xì)胞，獲得細(xì)胞總裂解物，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。制備12% SDS-PAGE，取40 μg蛋白樣品上樣，通過(guò)電泳分離，將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，TBST洗膜，再將膜浸泡在一抗工作液中4 ℃孵育過(guò)夜，次日TBST洗膜，將膜與對(duì)應(yīng)二抗工作液共孵育2 h，TBST再次清洗后，使用BeyoECL顯色，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，采用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織及癌旁組織中ID-1表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，乳腺癌組織中ID-1陽(yáng)性表達(dá)率為85.71%(36/42)，癌旁組織中ID-1陽(yáng)性表達(dá)率為7.14%(3/42)，乳腺癌組織中ID-1陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

a：癌旁組織；b：乳腺癌組織圖1 乳腺癌組織及癌旁組織ID-1表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色×100)

2.2 各組乳腺癌細(xì)胞ID-1表達(dá)比較

SUM159細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組和shRNA-NC組比較，shRNA-ID-1組ID-1 mRNA與蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05)；與Control組和pcDNA3.1-NC組比較，pcDNA3.1-ID-1組ID-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖2。由此說(shuō)明，成功得到抑制或過(guò)表達(dá)ID-1的SUM159細(xì)胞。

*：與Control組比較，P<0.05；#：與shRNA-NC組比較，P<0.05；△：與pcDNA3.1-NC組比較，P<0.05圖2 各組SUM159細(xì)胞ID-1 mRNA及蛋白表達(dá)比較

2.3 ID-1對(duì)乳腺癌細(xì)胞干細(xì)胞特性的影響

平板集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組和shRNA-NC組比較，shRNA-ID-1組SUM159細(xì)胞集落形成數(shù)目顯著減少(P<0.05)，SUM159細(xì)胞集落形成能力降低；與Control組和pcDNA3.1-NC組比較，pcDNA3.1-ID-1組SUM159細(xì)胞集落形成數(shù)目顯著增加(P<0.05)，說(shuō)明SUM159細(xì)胞集落形成能力增強(qiáng)，見(jiàn)圖3。

*：與Control組比較，P<0.05；#：與shRNA-NC組比較，P<0.05；△：與pcDNA3.1-NC組比較，P<0.05圖3 各組SUM159細(xì)胞克隆形成比較

腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組和shRNA-NC組比較，shRNA-ID-1組形成的腫瘤球體體積明顯變小，球體數(shù)目顯著減少(P<0.05)；與Control組和pcDNA3.1-NC組比較，pcDNA3.1-ID-1組形成的腫瘤球體體積明顯增大，球體數(shù)目顯著增多(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

*：與Control組比較，P<0.05；#：與shRNA-NC組比較，P<0.05；△：與pcDNA3.1-NC組比較，P<0.05圖4 各組SUM159細(xì)胞腫瘤球形成比較

2.4 ID-1對(duì)HUVECs小管生成的影響

HUVECs小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組和shRNA-NC組比較，shRNA-ID-1組HUVECs形成的分支點(diǎn)數(shù)減少(P<0.05)；與Control組和pcDNA3.1-NC組比較，pcDNA3.1-ID-1組HUVECs形成的分支點(diǎn)數(shù)顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

*：與Control組比較，P<0.05；#：與shRNA-NC組比較，P<0.05；△：pcDNA3.1-NC組比較，P<0.05圖5 各組HUVECs小管生成比較

2.5 ID-1對(duì)乳腺癌細(xì)胞中Src激酶活化的影響

免疫熒光染色檢測(cè)各組SUM159細(xì)胞中p-Src表達(dá)，以綠色熒光標(biāo)記，結(jié)果如圖6所示，可見(jiàn)Control組、shRNA-NC組以及pcDNA3.1-NC組細(xì)胞中均有綠色熒光表達(dá)，而shRNA-ID-1組細(xì)胞中未見(jiàn)明顯的綠色熒光表達(dá)，同時(shí)，pcDNA3.1-ID-1組細(xì)胞中有較強(qiáng)的綠色熒光表達(dá)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)ID-1促進(jìn)了Src激酶活化。

圖6 各組SUM159細(xì)胞內(nèi)p-Src表達(dá)(免疫熒光染色×100)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組和shRNA-NC組比較，shRNA-ID-1組SUM159細(xì)胞中p-Src蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)；與Control組和pcDNA3.1-NC組比較，pcDNA3.1-ID-1組細(xì)胞中p-Src蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖7。

1：Control組；2：shRNA-NC組；3：shRNA-ID-1組；4：pcDNA3.1-NC組；5：pcDNA3.1-ID-1組 *：與Control組比較，P<0.05；#：與shRNA-NC組比較，P<0.05；△：與pcDNA3.1-NC組比較，P<0.05圖7 各組SUM159細(xì)胞內(nèi)p-Src與Src蛋白表達(dá)比較

3 討論

目前，乳腺癌臨床治療中最關(guān)鍵的問(wèn)題是缺乏敏感有效的分子靶點(diǎn)，大多數(shù)乳腺癌患者確診時(shí)已處于晚期，預(yù)后較差且病死率偏高[1]。乳腺癌病理過(guò)程較為復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞活動(dòng)以及相關(guān)信號(hào)通路的相互作用。因此，準(zhǔn)確了解乳腺癌的發(fā)病分子機(jī)制將有助于發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的生物標(biāo)志物用于早期診斷或預(yù)測(cè)臨床結(jié)果。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)是血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體瘤中存在的特定細(xì)胞亞群，首次在人類(lèi)急性髓系白血病中被檢測(cè)到，CSCs具有較高的惡性程度，能夠促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，并可使腫瘤細(xì)胞對(duì)治療藥物產(chǎn)生抵抗[9]。除了具備常見(jiàn)的腫瘤細(xì)胞能力(如遷移和侵襲)，CSCs還表現(xiàn)出特征性的干細(xì)胞特性，包括分化潛能多向、自我更新能力強(qiáng)和腫瘤起始細(xì)胞的作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明，CSCs與胰腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和乳腺癌等多種癌癥的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖以實(shí)現(xiàn)腫瘤異質(zhì)性，通過(guò)調(diào)節(jié)CSCs的分化和自我更新是治療乳腺癌的有效方式[10-12]。

ID-1在多個(gè)實(shí)體腫瘤中過(guò)表達(dá)，并且與腫瘤的高度侵襲性及患者的不良臨床結(jié)局密切相關(guān)，此外，ID-1還在胚胎神經(jīng)干細(xì)胞維持自我更新和多能性方面發(fā)揮重要作用[6,13]。Sun等[14]研究發(fā)現(xiàn)，ID-1通過(guò)激活Wnt/β-catenin、Shh以及ID-1-c-Myc-PLAC8信號(hào)通路來(lái)維持結(jié)直腸癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Li等[15]通過(guò)使用小干擾RNA敲低胃癌細(xì)胞中ID-1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞關(guān)鍵相關(guān)因子Nanog和Oct-4的表達(dá)均受到抑制，并減弱了胃癌細(xì)胞中干細(xì)胞的自我更新能力，同時(shí)也降低了胃癌細(xì)胞增殖及對(duì)順鉑化療的抵抗。Cook等[16]的研究指出，ID-1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中作為自我更新的腫瘤干細(xì)胞特性標(biāo)記物，通過(guò)Cox-2衍生的PGE2激活ERK1/2-MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)ID-1表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的自我更新與輻射抗性產(chǎn)生。本研究通過(guò)將shRNA-ID-1和pcDNA3.1-ID-1轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞系SUM159，并在基因和蛋白水平驗(yàn)證抑制或過(guò)表達(dá)效率，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在SUM159細(xì)胞中抑制ID-1表達(dá)后，細(xì)胞集落形成數(shù)目明顯減少，形成的腫瘤球體體積明顯變小且球體數(shù)目減少，說(shuō)明抑制ID-1表達(dá)減弱了SUM159細(xì)胞的干細(xì)胞特性；而在過(guò)表達(dá)ID-1的SUM159細(xì)胞中，作用與抑制后完全相反，細(xì)胞集落形成數(shù)目和腫瘤球體數(shù)目顯著增加。由此推測(cè)，抑制ID-1表達(dá)可以降低乳腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性。

腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因。腫瘤血管生成是腫瘤進(jìn)展的必要條件，其通過(guò)提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，為腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移提供保障。血管生成是一個(gè)高度調(diào)節(jié)的過(guò)程，其中促血管生成因子和抗血管生成因子之間的相互作用介導(dǎo)了血管內(nèi)皮在血管生成不同階段的轉(zhuǎn)變，研究者們通過(guò)對(duì)腫瘤血管生成的不斷探究，很多靶向血管生成的藥物已投入臨床使用[17]。目前，在乳腺癌患者手術(shù)或放/化療的基礎(chǔ)上，輔以靶向血管生成的治療方法，可能對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移起到進(jìn)一步的控制作用。已有研究表明，ID-1參與多條骨肉瘤血管生成相關(guān)通路，通過(guò)上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中VEGF-A的表達(dá)來(lái)促進(jìn)骨肉瘤血管生成[18]；ID-1可以通過(guò)介導(dǎo)激活PI3K/Akt和NF-κB/MMP-2信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)卵巢癌內(nèi)皮祖細(xì)胞血管生成，因此ID-1及其下游效應(yīng)子可作為治療卵巢癌的潛在靶點(diǎn)[19]；此外，在膠質(zhì)瘤中ID-1和VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)，在腫瘤血管生成過(guò)程中起協(xié)同作用[20]。這些研究結(jié)果均提示ID-1可作為抗腫瘤血管生成的治療靶點(diǎn)。本研究中，采用抑制ID-1表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理HUVECs能夠減少小管生成，過(guò)表達(dá)ID-1的乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理HUVECs則明顯促進(jìn)了小管生成，與上述研究結(jié)果一致。

迄今為止，ID-1在腫瘤中發(fā)揮作用的潛在機(jī)制尚未充分闡明。Src激酶家族是一類(lèi)非受體酪氨酸激酶，作為一種多效激活劑，可介導(dǎo)由G蛋白偶聯(lián)受體、β1-整聯(lián)蛋白、生長(zhǎng)因子受體等啟動(dòng)的眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，參與調(diào)節(jié)各種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過(guò)程[21-22]。Src激酶活化后可與下游靶標(biāo)因子相互作用，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。本研究通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抑制ID-1表達(dá)的SUM159細(xì)胞中未見(jiàn)明顯的p-Src標(biāo)記綠色熒光表達(dá)，p-Src蛋白表達(dá)受到抑制，而過(guò)表達(dá)ID-1的細(xì)胞中有較強(qiáng)的綠色熒光表達(dá)，p-Src蛋白表達(dá)增加，由此說(shuō)明，ID-1可能具有促進(jìn)Src激酶活化的作用。

綜上，本研究通過(guò)檢測(cè)乳腺癌組織以及體外細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，ID-1在乳腺癌組織中高表達(dá)，其能夠增加乳腺癌細(xì)胞干細(xì)胞特性，并且促進(jìn)腫瘤血管生成，該作用機(jī)制可能與激活Src激酶途徑有關(guān)，由此推測(cè)ID-1有望成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。但關(guān)于ID-1具體如何調(diào)控Src激酶表達(dá)以及該途徑是否涉及其他分子機(jī)制，有待后續(xù)進(jìn)行更為深入的研究來(lái)闡明。